Name: Autoradiographie als eine einfache und leistungsfähige Methode zur Visualisierung und Charakterisierung von pharmakologischen Ziele (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Lernen Sie Autoradiographie zur Visualisierung von Proteinbindungsstellen in Mausgeweben mit hoher räumlicher Auflösung. Diese Methode ermöglicht schnellere digitale Bildgebung als herkömmliche Verfahren.

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Die Arbeit wurde von Lundbeck Stiftung (Grant R133-A12270) und der Novo Nordisk (Grant NNF0C0028664) unterstützt. Die Autoren danken Dr. Aleš Marek für die Lieferung von [3H] Radioligand.

Alle Tier Handhabung wurde nach den Richtlinien von der dänischen Tier Experimente Inspektion durchgeführt.
Hinweis: Die hier beschriebene Protokoll deckt Gewebe Vorbereitung (d.h.Maus Hirngewebe), die in-vitro- autoradiographischen Assay ausreichend detailliert für den Aufbau der Methode in ein neues Labor, die Exposition gegenüber Phosphor imaging-Platten sowie anschließenden densitometrischen Analyse der Autoradiograms (Abbildung 2) mit dem Ziel der Lokalisierung und Quantifizierung von Radioligand Bindung in unterschiedlichen anatomischen Strukturen. Bei histologischen dagegen ist ein Protokoll für Cresyl violette Färbung enthalten. Darüber hinaus ist die Bestimmung der unspezifischen Bindung mit einer konkurrierenden Liganden in das Protokoll aufgenommen. Für eine detaillierte Beschreibung zur Bestimmung von K-d, Bmax oder Kichsiehe vorherige Veröffentlichung4.
(1) Gewebe Vorbereitung von Kryoschneiden
<ol><li>Einschläfern der Maus durch zervikale Dislokation und sofort das Gehirn mit Schere und Pinzette zu sezieren. Gehen Sie direkt zum nächsten Schritt, um Gewebeschäden zu vermeiden.</li>
	<li>Snap-Einfrieren des Gewebes durch Untertauchen in Pulverform Trockeneis, gasförmigen CO2 oder Isopentane. Direkt transfer gefrorene Gewebe nach einem Kryostaten mit Temperatur bis-20 ° C. Alternativ lagern Sie das Gewebe bei-80 ° C bis zur Verarbeitung. Hinweis: Vermeiden Sie wiederholtes Auftauen/Einfrieren um Gewebeschäden zu reduzieren.</li>
	<li>Lassen Sie das Gewebe auf-20 ° C in den Kryostaten für 20 min zu akklimatisieren, vor der Weiterverarbeitung um erschütternde Gewebe zu vermeiden.</li>
	<li>Decken Sie die Gewebe-Halter mit einbetten Medium außerhalb des Kryostaten ab und platzieren Sie die gefrorenen Gewebeprobe schnell in der gewünschten Richtung zu, während das einbettende Medium noch flüssig ist. Platzieren Sie zum Beispiel das Gehirn der Maus vertikal auf Kleinhirn um rostral koronalen Abschnitte zu erreichen. Transfer des Gewebe-Halters zurück zu den Kryostaten und entlarven einbetten Mittel-und Temperaturen unter-10 ° C zum Härten. Hinweis: Fragile Gewebeprobe sollte bei Einbettung Medium innerhalb der Gewebe Formen vor der Montage beschichtet werden.</li>
	<li>Position der Gewebe-Inhaber im Mikrotom des Kryostaten. Stellen Sie die Ausrichtung des Gewebes, schräge Abschnitte zu vermeiden.</li>
	<li>Schneiden Sie das Gewebe mit der Leitung einer stereotaktischen Atlas18 in Abschnitten der gewünschten Stärke (12 µm empfohlen für [3H] gekennzeichnet Liganden). Sorgfältig zu begradigen Sie und entfalten Sie Abschnitt mit einer Bürste von kleiner Größe zu, wenn nötig und Tauwetter-Mount Abschnitt auf einen Objektträger. Sammeln Sie nacheinander in den Abschnitten aus der Region von Interesse für die gewünschte technische Replikation (z.B. 4 Abschnitte pro Folie).</li>
	<li>Die Abschnitte auf den Folien für 1 h an der Luft trocknen vor der weiteren Bearbeitung zu ermöglichen. Hinweis: Zugabe von Trockenmittel, Dia Boxen minimiert Feuchtigkeit auf die Gewebeschnitte aufbauen. Alternativprodukt kann hier angehalten werden, durch die Speicherung Abschnitte langfristige in Folie Boxen bei-80 ° C.</li>
</ol>2. in-vitro- Autoradiographie
Vorsicht: Radioaktivität. Arbeiten Sie in einem zertifizierten Labor gemäß den örtlichen Bestimmungen. Tragen Sie Schutzkleidung. Gemäß den radioaktiven Zerfall entsorgen oder an ein zertifiziertes Unternehmen auslagern.
<ol><li>Tauen Sie die Abschnitte für mindestens 30 min bei Raumtemperatur (RT). Beschriften Sie die Folien mit experimentellen Bedingungen. Benutzen Sie einen Bleistift, da die Folien in Ethanol während der anschließenden Färbung gebadet werden.</li>
	<li>Legen Sie die Folien horizontal in Kunststoffschalen. Hinweis: Dias auf einer erhöhten Plattform in Kunststoffschalen Positionierung erleichtert ihre Handhabung.</li>
	<li>Pre-incubate bereinigt die Abschnitte auf den Folien in Testpuffer montiert zum Ziel in Frage (GHB Protokoll, 50 mM KHPO4 Puffer pH 6.0 verwendet wird) durch sorgfältige Anwendung eine angemessene Lautstärke auf der Folie (700 µL für Nagetier koronalen Abschnitte 3 und 4). Hinweis: Stellen Sie sicher, dass jeder Abschnitt vollständig mit Flüssigkeit bedeckt ist.<ol>
<li>Decken Sie die Kunststoff-Schalen mit Deckel zur Vermeidung von Verdampfung und inkubieren Sie vorab bei relevanten Temperatur (für GHB Protokoll Pre incubate für 30 min bei RT) unter ständige sanfte (20 u/min) auf einem Teller Shaker schütteln.</li>
		<li>Zur Bestimmung der unspezifischen Bindung ergänzen Sie Testpuffer mit entsprechenden Konzentration von ungekennzeichnete Compound (für GHB Protokoll, 1 mM GHB). Hinweis: Vorinkubation möglicherweise nicht erforderlich sein.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gießen Sie Vorinkubation Flüssigkeit aus jeder Folie und übertragen Sie die Folien an der Plastikschale zurück.</li>
	<li>Um Austrocknung zu vermeiden, sofort inkubieren Sie die Abschnitte mit entsprechenden Konzentration von Radioligand in Testpuffer gewünschten Bedingungen (für GHB-Protokoll, 1 nM [3H] HOCPCA für 1 h bei RT) durch Abdecken der Abschnitte komplett mit der Radioligand Lösung (700 µL für Nagetier koronalen Abschnitte 3 und 4).<ol>
<li>Inkubieren Sie unter unter ständige sanfte (20 u/min) Schütteln der Kunststoffschalen mit geschlossenem Deckel. Hinweis: Die Radioligand Konzentration kann durch zählen ein Aliquot in einem flüssigen Szintillationszähler validiert werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die Inkubation Lösung durch Gießen die Flüssigkeit entfernen und die Folien Folie einbauen möchten Mikroskop zu übertragen. Gehen Sie sofort zum nächsten Schritt zu Abschnitt Austrocknung zu vermeiden.</li>
	<li>Waschen Sie die Folien. Für die GHB-Protokoll mit eiskalten Testpuffer zweimal für 20 s und dann spülen waschen Sie zweimal durch Eintauchen der Folie Rack in die Schalen gefüllt mit eiskaltem destilliertes Wasser, Salze zu entfernen. Positionieren Sie die Folien vertikal in Racks für mindestens 1 h bei RT Lufttrocknung oder trocknen Sie die Folien für 5 min mit einem Gebläse auf kalten Temperatur einstellen. Hinweis: Waschen muss optimiert werden, z.B.umfangreiche waschen kann zur Verringerung der unspezifischen Bindung nützlich sein.</li>
	<li>Übertragen Sie die Folien auf einem Fixateur mit Paraformaldehyd (PFA) Pulver für Übernachtung Fixierung mit PFA-Dämpfen bei RT zum Schutz die Integrität des Komplexes Liganden-Ziel. Achtung: PFA ist giftig. Positionthe Fixateur in Rauch Haube und Haut/Augenkontakt mit PFA vermeiden.</li>
	<li>Übertragen Sie am Folgetag die Folien auf einen Exsikkator Karton mit Silica-Gel für 3 h bei RT, Feuchtigkeit zu beseitigen.</li>
</ol>3. Belastung durch Phosphor-Imaging-Platten und Scannen
<ol><li>Legen Sie die Abschnitte in einer Strahlung abgeschirmt bildgebenden Platte Kassette mit dem Gewebe nach oben. Gehören Sie für nachfolgende Quantifizierung von Radioligand Bindung eine [3H] Microscale in jede Kassette. Ordnen Sie die Abschnitte nach dem Zufallsprinzip und setzen Sie in den Abschnitten zum direkten Vergleich in der gleichen Kassette.</li>
	<li>Löschen Sie die Tritium-Sensitive Phosphor imaging Platte unmittelbar vor Gebrauch, um angesammelte Signale aus dem Speicher zu entfernen und Hintergrund Signale zu beseitigen. Daher laden Sie die Platte in Phosphor bildgebenden Gerät und setzen Sie es sichtbar/Infrarot Licht entsprechend den Anweisungen des Herstellers.</li>
	<li>Entfernen Sie die Platte aus Phosphor bildgebenden Gerät und legen Sie es sofort auf die Abschnitte in der Kassette. Stellen Sie sicher, dass die Kassette komplett geschlossen ist. Setzen Sie in den Abschnitten, die Phosphor-Bildplatte für 3 Tage bei RT vor Licht geschützt.</li>
	<li>Da Licht Signal die Speicherfolie löscht, sorgfältig öffnen der Kassette im Dunkeln und sofort übertragen die Bildplatte in den dunklen Kasten von einem Phosphor Imager oder Phosphor Imager in einem dunklen Raum zu platzieren. Hinweis: Stellen Sie sicher, die räumliche Anordnung der Folien während der Belichtung um einzelne Probe auf das digitale Bild nach Analyse identifizieren zu notieren. Phosphor Bildplatten zeigen daher auch eine Ecke in einem deutlichen Winkel zu senken, um die korrekte Ausrichtung der Platte auf dem digitalen Bild zu identifizieren.</li>
	<li>Scannen Sie die Platte mit der höchsten Auflösung möglich, ein digitales Bild zu erhalten.</li>
</ol>4. optional: Cresyl violette Färbung der Gewebeschnitte
<ol><li>Bereiten Sie 1 % Cresyl violette Lösung durch Mischen von 5 g Cresyl violett-Acetat in 500 mL entionisiertem Wasser (dH2O) bis (ca. 2 h) aufgelöst. Filtern Sie durch ein Filterpapier mit einem Trichter in eine neue 500 mL Flasche. Stellen Sie ein pH-Wert 3,5-3,8.</li>
	<li>Positionieren Sie die Folie Färbung Satz unter Abzug. Bereiten Sie Tabletts mit den folgenden Lösungen in weißen Polypropylen Schalen (mit Ausnahme von Xylol): a. 50 % ethanol/50% dH2O b. 70 % ethanol/30% dH2O c. 100 % ethanol d. 100 % ethanol e. 100 % dH2O f. 1 % Cresyl violett g. 0,07 % Essigsäure (250 mL dH2O 175 µL Essigsäure hinzufügen). h. 100 % Xylol in grünen lösemittelbeständig Tabletts i. 100 % Xylol in grünen lösemittelbeständig Tabletts</li>
	<li>Übertragen Sie die Folien auf der Dunstabzugshaube und legen Sie sie in einem Dia-Rack.</li>
	<li>Lösen Sie die Lipide durch zunehmende abgestuften Reihe von Ethanol in dH2O durch Eintauchen der Folien für 1 min in 100 % igem Ethanol (Fach a-d auf).</li>
	<li>Rehydrieren Sie die Proben, dH2O durch absteigende Konzentrationen von Ethanol (Fach a-d in umgekehrter Reihenfolge, gefolgt von Fach e) durch Eintauchen der Folien für 1 min.</li>
	<li>Tauchen Sie die Exemplare in Cresyl violette Lösung für 10 Minuten.</li>
	<li>Spülen Sie die Exemplare mit 0,07 % Essigsäure durch Anheben der Folien oben und unten für 4-8 s. Waschen sanft die Folien durch Eintauchen in dH2O für 1 min.</li>
	<li>Austrocknen der Proben durch Eintauchen der Folien für 30 s in aufsteigender Konzentration von Ethanol (Fach a-d).</li>
	<li>Übertragen Sie die Proben durch zwei Schalen mit 100 % Xylol (Fach h und ich) das Ethanol zu stillen.</li>
	<li>Rehydrieren Sie die Proben, dH2O durch absteigende Konzentrationen von Ethanol (Fach a-d in umgekehrter Reihenfolge, gefolgt von Fach e) durch Eintauchen der Folien für 1 min.</li>
	<li>Entfernen Sie die Folien aus Kochsalzlösung mit der Pinzette. Tropfen Sie ein paar der organischen Lösungsmittel Montage Medien pro Folie und fügen Sie ein Deckglas 24 x 60 mm nach oben, um Proben zu schützen. Entfernen Sie durch leichtes Drücken auf das Deckglas Luftblasen zwischen der Probe und dem Deckglas. Hinweis: Halten Sie die verbleibenden Folien in Xylol bei der Montage um Austrocknen zu verhindern.</li>
	<li>Trocknen über Nacht die Folien in einer Dampfhaube bei RT</li>
	<li>Ein Bild der Probe mit einem Mikroskop und 1,25 X Objektiv zu erhalten.</li>
</ol>5. densitometrische Analyse des digitalen Bildes
<ol><li>Messen Sie die relative optische dichten (Stangen) von jedem Kalibrierstandard von [3H] Microscale mit einer Bildanalyse-Software.<ol>
<li>Wählen Sie einen Bereich von gleicher Größe für jeden Punkt der [3H] Microscale mithilfe eines Tools für die Erstellung der Region über den Menüpunkt Region Entschlossenheit. Weisen Sie eine Nummer zu jedem ausgewählten Bereich durch Klicken auf Nummer unter dem Menüpunkt Etikett.</li>
		<li>OD-Werte für jeden Punkt des Kalibrierstandards zu exportieren, indem Sie auf Datei | E Xport | 2D-Region Bericht. ROD-Werte in eine Tabelle übertragen und durch die Größe des ausgewählten Bereichs zu normalisieren. Führen Sie die lineare Regression um eine Standardkurve für weitere densitometrische Analysen zu erhalten. Hinweis: Stellen Sie sicher, dass die ausgewählten Bereiche gekennzeichnet sind, um passende Rute Werte und Muster zu identifizieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quantifizierung der Autoradiograms mit der eigenen imaging-Software durch Auswahl der Region durchführen von Interesse (ROI) verwenden ein Tool zur Erstellung der Region in jedem Abschnitt und Messung der ODs. Wählen Sie aus derselben Region in jedem Abschnitt durch Erstellen einer Vorlage für die Region von Interesse, die kopiert und manuell eingestellt, geringfügige Abweichungen in der Gehirn-Anatomie für jedes Autoradiogram. Identifizieren Sie die Anatomie des ROI durch Vergleich der Autoradiograms mit einem Gehirn-Atlas-18. Wenn mehrere Behandlungen verglichen werden, führen Sie die Analyse blind und randomisiert um einseitige Auswahl des ROIs zu vermeiden.</li>
	<li>Exportieren ROD Werte und Größen der ausgewählten Bereiche in einer Tabelle durch Klicken auf Datei | E Xport | 2D-Region Bericht.</li>
	<li>Teilen Sie die gemessene Rute des ausgewählten ROI durch seine Fläche um die Dichte pro bestimmte Fläche zu erhalten.</li>
	<li>Den Stab des Hintergrunds der Platte zu messen und entsprechende ROD Werte und Flächengröße in eine Tabellenkalkulation exportieren. Subtrahieren Sie die durchschnittliche Hintergrundsignal aus jeder Stab Wert jedes ROI.</li>
	<li>Durchschnitt der Stäbe der technischen Wiederholungen, d.h., Abschnitt repliziert mit Gewebe vom selben Tier.</li>
	<li>Verwenden die Standardkurve Stäbe in Einheiten von Radioligand Bindung, d.h.umwandeln., nCi/mg Gewebe Äquivalente (TE). Hinweis: Der Begriff TE wird verwendet, da Normen mit Materialien simulieren Gewebe erzeugt werden.</li>
	<li>Drücken Sie Bindung durch Umwandlung des nCi/mg und Nmol/mg TE entsprechend der spezifischen Aktivität von Radioligand (Gleichung 1). <img alt="Berechnungsformel für die Ligandenbindung, Gleichung zur Beschreibung von nmol/mg TE, relevant für biochemische Untersuchungen." src="/files/ftp_upload/58879/58879eq1v2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation">(1)</li>
	<li>Um bestimmte verbindliche Werte zu erhalten, subtrahieren Sie unspezifischen Bindung aus insgesamt Bindung.</li>
	<li>Durchschnittliche repliziert die Bindung von jedem biologischen replizieren mithilfe des Durchschnitts der technischen jedes Tieres (erhältlich im Schritt 5.6).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Die Qualität einer autoradiographischen Assay wird am häufigsten durch die Empfindlichkeit der Radioligand bestimmt. Ein wichtiger Faktor ist die ausgewählte Radioisotop, die durch die Verfügbarkeit von bekannten Liganden oder durch die Machbarkeit von spezifischen Kennzeichnung Techniken Liganden mit entsprechenden spezifischen Aktivität (d. h., die Menge an Radioaktivität Ausbeute gegeben ist pro Einheit Mol ein Radioligand)23und mit begrenzten Mengen an chemischen Abbau. Eine große Anz...

Autoradiographie ist eine Methode, die Bilder des radioaktiven Zerfalls liefert. Die Technik wird routinemäßig eingesetzt, um die Gewebeverteilung eines Proteins des Interesses in Vitro basierend auf eine spezifische pharmakologische Interaktion zwischen einer radioaktiv Verbindung und ihr Ziel zu studieren. Dies bietet direkte Informationen über die Selektivität des Liganden für das Ziel. In-vitro- Autoradiographie kann auch verwendet werden, für die quantitative Bestimmung der pharmakologischen Bindungsparameter von Radioligands, wie z. B. die Dissoziationskonstante (K-d) und die Dichte der Bindungsstellen (Bmax), sowie für die Bestimmung die Hemmung-Konstante (Ki) von konkurrierenden Liganden1,2. Im Vergleich zu traditionellen Homogenat Radioligand Bindung, hat Autoradiographie den Vorteil des Seins in der Lage, räumliche Anatomie zu visualisieren und prägnante Angabe der regionalen Ausdruck Muster3. Die Methode der Autoradiographie ist daher eine entsprechende Alternative zu Immunocytochemistry, insbesondere in der Abwesenheit eines validierten Antikörpers. Autoradiographie ist in einem standard Radioisotop Labor angesichts der Verfügbarkeit von geeigneten Radioligand mit der erforderlichen pharmakologischen Spezifität, Zugriff auf ein Mikrotom Kryostat für die Zubereitung von Gewebeschnitten und eine geeignete Imaging einfach umsetzen. Gerät, das die Verteilung der Radioaktivität in den jeweiligen Gewebeschnitten analysieren kann. Bemerkenswert ist, ist ein wichtiges Auswahlkriterium für die Radioligand eine begrenzte Menge an Bindung an Nichtziel-Seiten. Dies kann an andere Proteine, Membranen oder Materialien wie Kunststoff oder Filter, und ist gemeinsam als unspezifische Bindung bezeichnet. In der Regel kann unspezifische Bindung ist nicht Humanserumproteine aber Humanserumproteine wenn es handelt sich um ein bestimmtes Ziel-Protein. Der beste Weg der Validierung wahre spezifische Bindung ist vergleichbar zu den Geweben fehlt das Ziel, z.B.genetisch (Knock-out) Gewebe4entwickelt.
Hier ist die Methode mit der autoradiographischen Charakterisierung der hohen Affinität Bindungsstelle für γ-Hydroxybutyric Säure (GHB) in das Gehirn von Säugetieren illustriert. Verständnis der pharmakologischen Wechselwirkung zwischen GHB und seine Bindungsstelle ist von Bedeutung, da GHB sowohl ein klinisch nützlich Medikament in der Behandlung von Narkolepsie und Alkoholismus5, sondern auch ein natürlicher Bestandteil der das Gehirn von Säugetieren und ein Erholungs-ist Droge-6. Hohe Affinität GHB Bindungsstellen wurden erstmals über [3H] GHB Bindung an Ratte Gehirn Homogenat7beschrieben. Im Laufe der Jahre weitere Autoradiographie Studien mit [3H] GHB und die analoge [3H] NCS-382 zeigte eine hohe Dichte an Bindungsstellen im Vorderhirn Regionen Ratte8,9,10, Maus9 ,11und Affe/Mensch Gehirn12Schwein. Jedoch blieben die molekulare Identität und genaue funktionelle Relevanz der diese Bindungsstellen schwer fassbaren.
Mit der Absicht, weiter die Bindungsstellen charakterisieren, und Studien über die physiologische Rolle von GHB zu erleichtern, wurden mehrere Radioligands mit verschiedenen Isotopen, ausgestattet mit verschiedenen Affinitäten entwickelt ([3H] GHB, [3 H] NCS-382, [3H] HOCPCA und [125ich] BnOPh GHB)13,14,15,16(rezensiert in17) (Abbildung 1). Die Kombination von selektiven High-Affinity Radioligands und eine sehr hohe Gewebe Dichte der Bindung, die Standorte für die Herstellung von qualitativ hochwertigen Bilder mit den Phosphor imaging Technik9,11erlaubt haben. Zusammen mit einen Überblick über die praktischen Punkte bei der Einrichtung ein autoradiographischen Experiment und eine Illustration zu Details zu veranschaulichen wird die Diskussion Abschnitt (i) die Wahl des Radionuklids, (Ii) die Wahl der Assay-Bedingungen und (Iii) die Verwendung von Phosphor betonen. Bildplatten versus Röntgenfilm. Das übergeordnete Ziel dieses Papiers ist es, die wissenschaftlichen, technischen und methodischen Details auf die Autoradiographie Technik zur Verfügung, für die Information über Gewebeverteilung und pharmakologische Analyse von Protein-Targets.

<table><tbody><tr><td>Absolutes Ethanol</td><td>Merck Millipore</td><td>107017</td><td></td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>BAS-TR2040 Speicherfolie</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>28956481</td><td>20x40 cm - Empfindlich gegen Tritium</td></tr><tr><td>Cresylviolettacetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5042-10G</td><td></td></tr><tr><td>DPX (nichtwässriges Eindeckmedium für die Mikroskopie)</td><td>Merck Millipore</td><td>100579</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. Compound, 12 x 125 mL</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td>Tissue-Tek</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16005-1KG-R</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Objektträger</td><td>VWR</td><td>631-9483</td><td>Objektträger Objektträger</td></tr><tr><td>Tissue-Tek Manuelles Objektträger-Färbeset</td><td>Sakura Finetek Dänemark ApS</td><td>4451</td><td></td></tr><tr><td>Tritium Standard auf Glas</td><td>American Radiolabeld Chemicals, Inc.</td><td>ART 0123</td><td></td></tr><tr><td>Xylol-Ersatz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5597</td><td></td></tr></tbody></table>

autoradiographie als eine einfache und leistungsfähige methode zur visualisierung und charakterisierung von pharmakologischen ziele

Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets

In-vitro- Autoradiographie zielt darauf ab, die anatomische Verteilung eines Proteins des Interesses an Gewebe von Versuchstieren sowie Menschen zu visualisieren. Die Methode basiert auf die spezifische Bindung von Radioligand zu seinem biologischen Ziel. Daher sind gefrorene Gewebeschnitte mit Radioligand Lösung inkubiert und die Bindung an das Ziel später lokalisiert ist durch den Nachweis des radioaktiven Zerfalls, z. B. mithilfe von lichtempfindlichen Film oder Phosphor imaging-Platten. Daraus resultierende digitale Autoradiograms zeigen bemerkenswerte räumlichen Auflösung, der Quantifizierung und Lokalisierung von Radioligand Bindung in unterschiedlichen anatomischen Strukturen ermöglicht. Darüber hinaus erlaubt die Quantifizierung für die pharmakologische Charakterisierung von Liganden Affinität durch Dissoziation konstanten (K-d), Hemmung konstanten (Kich) sowie die Dichte der Bindungsstellen (Bmax) in ausgewählten Geweben. So bietet die Methode Informationen über Ziel Lokalisierung und Liganden Selektivität. Hier ist die Technik mit autoradiographischen Charakterisierung der hohen Affinität γ-Hydroxybutyric Säure (GHB) Bindungsstellen im Gehirn von Säugetieren Gewebe, mit besonderem Schwerpunkt auf methodische Überlegungen bezüglich der verbindlichen Test beispielhaft dargestellt Parameter, die Wahl der Radioligand und das Nachweisverfahren.

Mit der beschriebenen Protokoll, die anatomische Verteilung der hohen Affinität GHB verbindliche Aufstellungsorte wurde visualisiert mit radioaktiv GHB analog [3H] HOCPCA im Gehirn der Maus, die in koronalen, sagittalen und horizontalen Abschnitte (Abbildung 3 geschnitten wurde ). Hohes Maß an Bindung im Hippocampus und Cortex beobachtet wurden, geringere Bindung im Striatum und keine Bindung war im Kleinhirn, entspricht früheren gemeldeten Express...

Die Methode der Autoradiographie wird routinemäßig zur Bindung von Radioligands an Gewebeschnitten zur Bestimmung der qualitativen oder quantitativen Pharmakologie zu studieren.

Autoradiographie als eine einfache und leistungsfähige Methode zur Visualisierung und Charakterisierung von pharmakologischen Ziele

In vitro autoradiography aims to visualize the anatomical distribution of a protein of interest in tissue from experimental animals as well as humans. The ...

Autoradiographie ist eine leistungsstarke und einfache Technik, um die Verteilung von Proteinbindungsstellen in Geweben mit spezifischen Radioligand für das Ziel zu untersuchen. Es ist auch eine geeignete Alternative zur Immunhistochemie. Diese Technik visualisiert den Proteinausdruck mit räumlicher Auflösung über digitale Bilder, die schneller als herkömmliche Filmbelichtung ist.Es kann auch für die pharmakologische Analyse von Protein-Targets verwendet werden. Die Methode umfasst Mausgewebe, die auf Glas montiert sind, kann aber auf andere Arten oder sogar auf Zellen ausgedehnt werden, die auf Deckellipsen angebaut werden. Die Demonstration des Verfahrens wird von Nane Griem-Krey, einer Doktorandin in meinem Labor, sein.Um zu beginnen, tauchen Sie das Gewebe in pulverisiertes Trockeneis, um es zu fangen einfrieren. Übertragen Sie das gefrorene Gewebe direkt in einen Kryostat, der auf minus 20 Grad Celsius eingestellt ist. Lassen Sie das Gewebe auf minus 20 Grad Celsius im Kryostat für 20 Minuten akklimatisieren.Dann bedecken Sie den Gewebehalter mit einbettendem Medium außerhalb des Kryostats und legen Sie die gefrorene Gewebeprobe schnell in die gewünschte Ausrichtung, während das Einbettmedium noch flüssig ist. Den Gewebehalter zurück in den Kryostat geben und das Einbettmedium Temperaturen unter minus 10 Grad Celsius zur Verhärtung aussetzen. Positionieren Sie den Gewebehalter im Mikrotom des Kryostats.Passen Sie die Ausrichtung des Gewebes an, um geneigte Abschnitte zu vermeiden. Schneiden Sie das Gewebe unter Anleitung eines stereotaxic Atlas in Abschnitten der gewünschten Dicke und entfalten Sie den Abschnitt mit einem kleinen Pinsel, wenn nötig. Tauen Sie den Abschnitt auf einem Mikroskopschlitten montieren.Dann sammeln Sie sequenziell die Abschnitte aus dem Interessengebiet für die gewünschte technische Wiederholung. Lassen Sie die Abschnitte auf den Dias eine Stunde lang trocknen, bevor Sie weiterhand finden. Verwenden Sie in einem zertifizierten Radioaktivitätslabor einen Bleistift, um die Dias mit den experimentellen Bedingungen zu kennzeichnen.Platzieren Sie die Dias horizontal in Kunststoffschalen. Wenden Sie sorgfältig ein entsprechendes Volumen des sA-Puffers an, der an das betreffende Ziel angepasst ist, auf die auf den Folien montierten Abschnitte an. Stellen Sie sicher, dass jeder Abschnitt vollständig abgedeckt ist.Zur Bestimmung der unspezifischen Bindung, ergänzen SA Puffer mit einer relevanten Konzentration von unbeschrifteten Verbindung. Dann bedecken Sie die Schalen mit Deckeln, um Verdunstung zu vermeiden. Vorinkubieren bei einer relevanten Temperatur für 30 Minuten auf einem Plattenschütter auf 20 Rpm eingestellt.Als nächstes gießen Sie die Vorinkubationsflüssigkeit aus jedem Dia ab und übertragen Sie die Dias wieder in die Kunststoffschale. Die Abschnitte sofort vollständig mit der entsprechenden Konzentration von Radioligand im SA-Puffer abdecken. Zur Bestimmung der unspezifischen Bindung, ergänzen Radioligand-Lösung mit einer relevanten Konzentration von unbeschrifteter Verbindung.Bedecken Sie die Schalen mit Deckeln und brüten Unter den gewünschten Bedingungen mit konstantem sanftem Schütteln bei 20 U/min. Danach die Inkubationslösung abgießen und die Dias in ein Mikroskop-Dia-Rack übertragen. Waschen Sie die Dias sofort.Für das GHB-Protokoll zweimal mit eiskaltem SA-Puffer für 20 Sekunden waschen und dann zweimal abspülen, indem Sie das Schieberegal in Schalen tauchen, die mit eiskaltem destilliertem Wasser gefüllt sind. Positionieren Sie die Schlitten vertikal in Dengestellen und trocknen Sie sie mindestens eine Stunde lang. Dann übertragen Sie die Dias auf einen Fixator, der Paraformaldehyd zur nächtlichen Fixierung bei Raumtemperatur enthält.Übertragen Sie die Dias am nächsten Tag in eine Trockenbaubox mit Kieselgel bei Raumtemperatur. Lassen Sie die Dias in der Trockenzisator-Box für drei Stunden, um Feuchtigkeit zu beseitigen. Legen Sie die Abschnitte zunächst in eine strahlungsabgeschirmte Bildkassette mit nach oben gerichtetem Gewebe.Fügen Sie eine radioaktive Mikroskala in jede Kassette für die nachfolgende Quantifizierung der Radioligand-Bindung ein. Laden Sie die tritiumempfindliche Phosphor-Bildgebungsplatte unmittelbar vor dem Einsatz in die Phosphor-Bildgebungsmaschine und setzen Sie sie gemäß den Anweisungen des Herstellers sichtbarem Infrarotlicht aus, um sie zu löschen. Entfernen Sie dann die Bildplatte von der Phosphor-Bildgebungsmaschine und legen Sie sie sofort auf die Abschnitte in der Kassette.Stellen Sie sicher, dass die Kassette vollständig geschlossen ist. Setzen Sie die Abschnitte der Phosphor-Bildgebungsplatte für die optimierte Belichtungszeit bei Raumtemperatur aus, während sie vor Licht geschützt ist. Nach der Belichtung die Kassette im Dunkeln vorsichtig öffnen und die Bildplatte sofort in die dunkle Box eines Phosphor-Imagers übertragen.Scannen Sie die Platte mit der höchstmöglichen Auflösung, um ein digitales Bild zu erhalten. Öffnen Sie zunächst ein entsprechendes Bildanalyseprogramm. Bestimmen Sie die relativen optischen Dichten für jeden Kalibrierungsstandard, indem Sie die Bestimmung des Menüpunktbereichs auswählen.Wählen Sie das Werkzeug für die Regionserstellung aus, und verwenden Sie es, um einen Bereich gleicher Größe für jeden Punkt der radioaktiven Mikroskala auszuwählen. Weisen Sie jedem ausgewählten Bereich eine Nummer zu, indem Sie auf die Nummer unter der Menüelementbeschriftung klicken. Klicken Sie auf Dateiexport und dann auf 2D-Regionsbericht, um die OD-Werte für jeden Punkt des Kalibrierungsstandards zu exportieren.Verwenden Sie in der proprietären Imaging-Software ein Regionserstellungstool, um den Bereich auszuwählen, der für jeden Abschnitt von Interesse ist, und messen Sie seine ODs, um mit der Quantifizierung der Autoradiogramme zu beginnen. Wählen Sie in jedem Abschnitt den gleichen Bereich aus, indem Sie eine Vorlage für den Interessenbereich erstellen und kopieren und an kleinere Variationen der Gehirnanatomie in jedem Autoradiogramm anpassen. Klicken Sie anschließend auf Dateiexport-2D-Regionsbericht, um die ROD-Werte und -Größen ausgewählter Bereiche in eine Kalkulationstabelle zu exportieren.Bestimmen Sie die Bindung des Radioligands, wie im Textprotokoll beschrieben. In dieser Studie wird die anatomische Verteilung der hochaffinen GHB-Bindungsstellen mit dem radioaktiv markierten GHB analogen radioaktiven HOCPCA in einem Maushirn visualisiert, das in koronale, sagittale und horizontale Abschnitte geschnitten wurde. Hohe Bindungsraten sind im Hippocampus und Kortex zu beobachten, während niedrigere Bindungswerte im Striatum beobachtet werden und keine Bindung im Kleinhirn nachgewiesen wird.Wie hier gezeigt, können die anatomischen Strukturen mit verschiedenen Ebenen visualisiert werden und die anatomische Integrität kann durch kresylviolette Färbung unterstützt werden. Repräsentative Autoradiogramme einer Ratte, einer Maus und eines Schweins veranschaulichen die evolutionäre Erhaltung der hohen Affinitäts-GHB-Bindungsstellen im Säugetierhirn. Radioaktive HOCPCA-Bindungsstellen werden bei allen drei Arten nachgewiesen, die einen Vergleich der groben Hirnanatomie zwischen ihnen ermöglichen.Die hochaffinen GHB-Bindungsstellen werden mit GHB-Radioliganden untersucht, die unterschiedliche Affinitäten für die Bindungsstellen, aber vergleichbare spezifische Aktivitäten aufweisen. Radioaktives HOCPCA ist mit einer hohen Empfindlichkeit und einem ausgezeichneten Signal-Rausch-Verhältnis ausgestattet. Aufgrund der geringeren Empfindlichkeit des radioaktiven NCS-382 müssen höhere Radioligaandkonzentrationen verwendet werden, um ähnliche Bindungswerte zu erhalten.Noch höhere Radioligaand-Konzentrationen sind notwendig, damit radioaktive SGH B vergleichbare Bindungswerte erreichen können. Höhere Radioligand-Konzentrationen erhöhen jedoch auch den Grad der unspezifischen Bindung mit einem folglich niedrigeren Signal-Rausch-Verhältnis. Es ist wichtig, die Assay-Bedingungen wie die Radioligand-Konzentration, Wasch- und Belichtungszeit zu optimieren, um die besten Signal-Rausch-Verhältnisse zu erhalten, und es ist auch sehr wichtig, sich daran zu erinnern, die Platte vorher zu löschen.Das Verfahren kann auf in vivo-Bedingungen ausgedehnt werden, um eine Vorstellung von der Verbindungsbindung in einem lebenden Tier zu bekommen, die für Entdeckungsprojekte nützlich sein könnte. Denken Sie daran, in einem Labor mit zertifiziertem vollradioaktivem Material zu arbeiten und Schutzkleidung beim Umgang mit Radioaktivität oder Paraformaldehyd zu tragen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Hier beschreiben wir einen Arbeitsablauf für die schnelle Analyse und Erforschung von Sammlungen Fluoreszenzmikroskopiebilder mit PhenoRipper, eine kürzlich entwickelte Bild-Analyse-Plattform.

Schnelle Analyse und Exploration von Fluoreszenzmikroskopie Images

Dieses Protokoll beschreibt, wie die Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie verwendet wird, um einzelne Rezeptoren auf der Oberfläche lebender Zellen sichtbar zu machen und zu verfolgen und dadurch die laterale Beweglichkeit der Rezeptoren, die Größe von Rezeptorkomplexen sowie die Visualisierung transienter Rezeptor-Rezeptor-Wechselwirkungen zu analysieren. Dieses Protokoll kann auf andere Membranproteine ausgeweitet werden.

Hochauflösende Räumlich-zeitliche Analyse der Rezeptordynamik von Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie

Rezeptor-moduliert Signalisierung und Zellen gegenüber Liganden und ist selbst in Reaktion auf Zellbedingungen, einschließlich Liganden-induzierte Signalisierung. Hier beschreiben wir eine leistungsfähige und flexible Methode zur quantitativen Beurteilung der Arzneimittel-induzierte Rezeptor-Verwendung von Immunmarkierung und colocalizational Analyse.

Tracking-Drug-induzierte Veränderungen der Post-Rezeptor-Internalisierung Handel durch Colocalizational Analysis

Ein Protokoll für das Screening kleiner molekularer Wirkstoffe, das auf der In-situ-Synthese von ultrakleinen fluoreszierenden Gold-Nanoclustern (Au-NCs) unter Verwendung von wirkstoffbeladenen Proteinen als Template basiert, wird vorgestellt. Diese Methode ist einfach, um die Bindungsaffinität von Wirkstoffen an ein Zielprotein durch ein sichtbares Fluoreszenzsignal zu bestimmen, das von den Protein-Template-Au-NCs emittiert wird.

Eine schnelle und quantitative fluorimetrische Verfahren zur Protein-Targeting kleines Molekül als Wirkstoff-Screening

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Beschreibung der Lokalisation von Angiotensin-II-Typ-1-Rezeptoren im Rattengehirn durch quantitative,  densitometrische In-vitro-Rezeptor-Autoradiographie unter Verwendung eines Jod-125-markierten Analogons von Angiotensin II.

Rezeptor-Autoradiographie-Protokoll für die Lokalisierte Visualisierung von Angiotensin II-Rezeptoren

Wir beschrieben hier, ein High-Content bildgebendes Verfahren zur Quantifizierung des Transports von Rhodopsin Mutanten mit Retinitis Pigmentosa verbunden. Eine Multiple-Wellenlänge scoring Analyse wurde zur Rhodopsin Proteine auf der Zelloberfläche oder in der ganzen Zelle zu quantifizieren.

Ein Rhodopsin Transport Test von High-Content Imaging-Analyse

Hier stellen wir ein Protokoll zur vollautomatischen Radiobeschriftung von [11C]SNAP-7941 und zur Analyse der Echtzeitkinetik dieses PET-Tracers auf P-gp-extierende und nicht-extierende Zellen dar.

Technischer Aspekt der automatisierten Synthese und Echtzeit-Kinetik-Evaluierung von [11C]SNAP-7941

Wir beschreiben Protokolle zur Bewertung des Grades der Transduktion durch zelldurchdringende Peptide unter Verwendung von Ex-vivo-Bildgebungssystemen, gefolgt von Paraffineinbettung, Schnitt- und konfokaler Fluoreszenzmikroskopie am Beispiel von Kardial-Targeting-Peptid. In unserem Protokoll kann ein einzelnes Tier verwendet werden, um beide Arten der bildgebenden Bewertung der gleichen Organe zu erwerben, wodurch die Anzahl der Tiere, die für Studien benötigt werden, um die Hälfte wird.

In Vivo Imaging von Transduktionseffizienzen des Kardialen Peptids

Dieses Protokoll stellt eine Reihe von Experimenten vor, die für die Evaluierung von photoschaltbaren Antikrebspeptiden verwendet wurden, die für das präklinische Screening solcher Verbindungen verwendet werden können. Dazu gehören die Bewertung der Zytotoxizität in 2D- und 3D-Zellkulturen, die Bewertung der Ex-vivo-Photoisomerisierungseffizienz (Modellgewebe) und der In-vivo-Wirksamkeit.

In-vitro - und In-vivo-Evaluierung photokontrollierter biologisch aktiver Substanzen - potenzielle Wirkstoffkandidaten für die Krebspharmakologie

Wir stellen ein Protokoll vor, um metabolische Aktivitäten in Zellen, die durch Aminosäuren reguliert werden, direkt sichtbar zu machen, indem wir Deuteriumoxid (schweres Wasser D2O) mit sondierter stimulierter Raman-Streuung (DO-SRS) verwenden, die in die Zwei-Photonen-Anregungsfluoreszenzmikroskopie (2PEF) integriert ist.

Bioorthogonale chemische Bildgebung des Zellstoffwechsels, der durch aromatische Aminosäuren reguliert wird

Dieses Protokoll stellt ein detailliertes Verfahren zur Herstellung von vier Kohlenstoff-11-Radiotracern mittels der "Schleifenmethode" [11C]methylierung vor. Wir beschreiben das Verfahren zur Synthese von [11C]ER-176 mit Daten für drei weitere Radiotracer: [11C]MRB, [11C]mHED und [11C]PiB. Die Loop-Methode bietet eine effiziente Synthese mit erhöhter radiochemischer Ausbeute gegenüber der herkömmlichen Reaktionsgefäß-Methylierung [11C].

Verbesserung der Effizienz und der Radiomarkierungsausbeute von Kohlenstoff-11-Radioliganden für die klinische Forschung mit der Loop-Methode

Lernen Sie Autoradiographie zur Visualisierung von Proteinbindungsstellen in Mausgeweben mit hoher räumlicher Auflösung. Diese Methode ermöglicht schnellere digitale Bildgebung als herkömmliche Verfahren.

Autoradiographie als eine einfache und leistungsfähige Methode zur Visualisierung und Charakterisierung von pharmakologischen Ziele (Video) | JoVE Journal

Autoradiographie als eine einfache und leistungsfähige Methode zur Visualisierung und Charakterisierung von pharmakologischen Ziele

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