Name: Hochdurchsatz-Nitrobenzoxadiazole-Label Cholesterin-Efflux-Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Lernen Sie einen hochdurchsatzfähigen NBD-Cholesterin-Efflux-Assay zur Bewertung kardiovaskulärer Risiken in Makrophagen-Zellmodellen kennen. Diese fluoreszenzbasierte Methode bietet eine sichere Alternative zu radioaktiven Techniken.

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Diese Arbeit wurde teilweise von unterstützt die Forschung gewährt FIS (PS12/00866) vom Instituto de Salud Carlos III, Madrid, Spanien; Fondo Europeo Para el Desarrollo Regional (FEDER); Red de Investigación En SIDA (RIS), ISCIII-RETIC (RD16/0025/0002) und CERCA Programm / Generalitat de Catalunya. Die Autoren danken den Retrovirology und virale Immunpathologie Labor des Institut d'Investigacions Biomèdiques August Pi I Sunyer (IDIBAPS). Wir danken T. Escribà, C. Rovira und C. Hurtado für ihre Unterstützung und S. Cufí vom Wissen und der Technologie-Transfer-Büro für ihre Führung in der Erfindung zu schützen.

Für diese Studie wurden Ethikkommission Genehmigung (Comitè Ètic d' Investigacio Clínica, Klinik, Barcelona, Zulassungsnummer HCB/2014/0756) und schriftliche, informierte Zustimmung aller Fachrichtungen erhalten.
(1) NBD-Cholesterin Vorbereitung
<ol><li>Auflösen der NBD-Cholesterin (MW 494.63; siehe Tabelle of Materials) in reinem Ethanol um das Lager (2 mM) zu erhalten. Lösen Sie für eine 10 mg Ampulle die gesamte Fläschchen Inhalte in einem 10,1 mL Volumen von Ethanol, ein 2 mM Lager zu erhalten auf.</li>
	<li>Verdünnen Sie die NBD-Cholesterin aus dem Bestand RPMI 1640 mit 10 % fetalen bovine Serum und 5 % Penicillin/Streptomycin (R10 Medium) ergänzt um eine Endkonzentration von 5 μM zu erreichen (z. B., erhalten 10 mL NBD-Cholesterin bei 5 μM Endkonzentration) durch verdünnen 25 μL der NBD-Cholesterin (2 mM) vorrätig R10 Medium. Diese Menge reicht für eine 96-Well-Platte.</li>
</ol>2. Handy-Kultur und Seeding (2.Tag)
<ol><li>Kultur-THP-1-Zellen in R10-Medium bei 37 ° C, 5 % CO2. Passen Sie auf 0,3 x 106 Zellen/mL alle 3 Tage.</li>
	<li>Samen der Zellen in einem weißen 96-Well-Platte mit einem flachen, klaren Boden bei 0,2 x 106 Zellen/Well in R10 Medium (100 μL pro Well).</li>
	<li>Behandlung der Zellen mit 100 nM Phorbol Myristate-12 13-Acetat (PMA; aus einem Bestand von 10 μM) für 48-72 h, Inkubation bei 37 ° C, 5 % CO2 THP-1 zu unterscheiden Zellen in DmTHP-1. Hinweis: Es wird empfohlen, 5 μL der PMA Lager (10 μM) verwenden in 500 μL der R10 Medium. Davor bereiten Sie eine 10 μM PMA Lager durch Auflösen einer Durchstechflasche lyophilisierten 1 g in 10 mL Dimethyl Sulfoxid (DMSO), aliquoten und Lager bei-20 ° C.</li>
	<li>Alternativ (Vorschlag) kombinieren Schritte 2.2 und 2.3 für besseren Homogenisierung. Bereiten Sie 10 mL THP-1-Zellen in der 15 mL Tube vor, fügen Sie 200 μL der PMA Lager (10 μM), mischen Sie vorsichtig und sofort Samen Sie 100 μL pro Well auf den Teller. Inkubieren Sie die Zellen, wie unter Punkt 2.3 beschrieben.</li>
</ol>(3) Apolipoprotein B erschöpft Serum (ABDS) Vorbereitung (Tag 2 oder 3)
<ol><li>Zur Vorbereitung einer Polyethylenglykol (PEG) Lösung verdünnen Sie Glycin in 10 % PBS (mit sterilen H2O) zu einer Konzentration von 200 mM bei pH 7,4. 40 mL 200 mM Glycin hinzufügen 10 g PEG 8000 PEG erhalten 20 % (w/V). Mischen Sie die Lösung kräftig zu homogenisieren.</li>
	<li>Gelten 4 Teile von 20 % pro 10 Teile von Serum/Plasma auf jede Serum/Plasma-Probe in einer 1,5 mL Tube PEG und lassen Sie die Mischung auf dem Eis für 25 min17 (z. B. für 100 μL Plasma oder Serum, fügen Sie 40 μL 20 % PEG Lösung).</li>
	<li>Zentrifugieren des PEG-Apolipoprotein B Niederschlags bei 13.000 X g für 15 min bei 4 ° C.</li>
	<li>Verwerfen Sie den Niederschlag. Übertragen Sie den Überstand auf einen neuen Schlauch. Hinweis: Wir empfehlen Ihnen, Vorbereitung der ABDS am Tag 3 (frisch). Wenn es nicht möglich ist, bereiten Sie die ABDS am 2. Tag und halten Sie es über Nacht bei 4 ° C.</li>
</ol>4. NBD-Cholesterin Zelle laden (Tag 2)
<ol><li>Entsorgen Sie das Kulturmedium des DmTHP-1 und waschen Sie die Zellen zweimal mit 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS).</li>
	<li>Die Wägezellen mit 5 μM NBD-Cholesterin (100 μL pro Well) in R10 Medium und Inkubation über Nacht bei 37 ° C, 5 % CO2.</li>
</ol>(5) Inkubation mit Cholesterin Akzeptoren (Tag 3)
<ol><li>Entsorgen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen mit 2 – 5 % ABDS oder die gewünschte Konzentration von gereinigten Lipid-Akzeptor (HDL, ApoA, ApoE, etc.) verdünnt in farblos RPMI 1640 Medium (100 μL pro Well) für 4 – 6 h bei 37 ° c Hinweis: Enthalten Sie eine Negativkontrolle (c-) bestehend aus farblos RPMI 1640 Medium ohne Akzeptoren und eine Positivkontrolle (C +) (z. B. ABDS aus einem Pool von gesunden Spendern) oder gereinigte HDLs. Beachten Sie, dass die Positivkontrolle gilt, vor allem wenn Patientenproben (Erkrankungen) analysiert (ergänzende Abbildung1).</li>
	<li>Bereiten Sie eine 200 mL Brühe der Zelle Lysis Lösung 1 (50 mM Tris-Puffer, 150 mM NaCl, H2O). Mischen Sie die Zelle Lysis Lösung 1 bei 1:1 (V: V) Verhältnis mit reinem Ethanol die Lyse Lösung 2 zu erhalten.</li>
</ol>(6) fluoreszierendes Signal zu erfassen (Tag 3)
<ol><li>
Medien-NBD-Cholesterin-Erkennung
	<ol>
<li>Die Zelle Medium von den Platten zu entfernen und in eine neue weiße 96-Well-Platte mit einer undurchsichtigen flachen Boden zu sammeln.</li>
		<li>Fügen Sie für eine optimale Fluoreszenz Signalerkennung in den Medien Proben 100 μL von reinem Ethanol 100 μL jeder mittlere Probe auf ein 1:1 Verhältnis in der weißen 96-Well-Platte zu erhalten hinzu.</li>
		<li>Halten Sie der Platte mit den behandelten Medien weitere Maßnahme der Fluoreszenzintensität (FI) bei einer 463⁄536 nm (Anregung/Emission) Wellenlänge in die Luminometer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Intrazelluläre NBD-Cholesterin-Erkennung
	<ol>
<li>Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS.</li>
		<li>Um den intrazellulären Cholesterinspiegel zu erhalten, lösen Sie die Zellen durch Inkubation sie mit 100 μL pro Well-Lyse Lösung 2 und schütteln Sie die Platte bei Raumtemperatur (RT) für 25 min.</li>
		<li>Für eine optimale Fluoreszenz Signalerkennung in die Zelle lysate Proben, erfassen der Fluoreszenzintensität der Zelle Lysates in der gleichen weißen 96-Well-Platte mit klaren flachen Boden (die gleiche Platte in dem in Schritt 2.2 Zellen ausgesät wurden).</li>
	</ol>
</li>
	<li>6.3 während der Einstellung des Empfindlichkeit Parameters auf 50 in der Software der Fluoreszenzintensität (FI) in der Luminometer messen (siehe Tabelle der Materialien).</li>
</ol>7. die Ergebnisermittlung
<ol><li>Drücken Sie die Cholesterin-Efflux-Rate einer Probe als Prozentsatz berechnet, indem die Formel aus: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58891/58891eq1.jpg">
</li>
	<li>Erhalten Sie das endgültige Maß der Cholesterin-Efflux (CE) durch Subtraktion der CE von der negativen Kontrolle (Beispiel mit NBD-Cholesterin geladen aber inkubiert mit farblosen RPMI 1640 Medium, ohne Cholesterin Akzeptoren) aus dem UZ der ein Muster gegeben: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58891/58891eq2.jpg">
</li>
</ol>

<ol><li>The top 10 causes of death. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death">http://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death</a> (2018).</li>
<li>Hansson, G. K., Hermansson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+system+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">The immune system in atherosclerosis.</a> Nature Immunology. 12 (3), 204-212 (2011).</li>
<li>Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+challenges+in+translating+the+biology+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis.</a> Nature. 473 (7347), 317-325 (2011).</li>
<li>Ilhan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerosis+and+the+role+of+immune+cells%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Clinical+Cases%22%5BJournal%5D)">Atherosclerosis and the role of immune cells.</a> World Journal of Clinical Cases. 3 (4), 345(2015).</li>
<li>Greaves, D. R., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunity%2C+atherosclerosis+and+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunity, atherosclerosis and cardiovascular disease.</a> Trends Immunol. 22, (2001).</li>
<li>Yamamoto, S., Narita, I., Kotani, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+macrophage+and+its+related+cholesterol+efflux+as+a+HDL+function+index+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">The macrophage and its related cholesterol efflux as a HDL function index in atherosclerosis.</a> Clinica Chimica Acta. 457, 117-122 (2016).</li>
<li>Escolà-Gil, J. C., Rotllan, N., Julve, J., Blanco-Vaca, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+macrophage-specific+RCT+and+antioxidant+and+antiinflammatory+HDL+activity+measurements%3A+New+tools+for+predicting+HDL+atheroprotection%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">In vivo macrophage-specific RCT and antioxidant and antiinflammatory HDL activity measurements: New tools for predicting HDL atheroprotection.</a> Atherosclerosis. 206 (2), 321-327 (2009).</li>
<li>Santos-Gallego, C. G., Ibanez, B., Badimon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDL-cholesterol%3A+Is+it+really+good%3F+Differences+between+apoA-I+and+HDL%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">HDL-cholesterol: Is it really good? Differences between apoA-I and HDL.</a> Biochemical Pharmacology. 76 (4), 443-452 (2008).</li>
<li>Rothblat, G. H., Phillips, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+lipoprotein+heterogeneity+and+function+in+reverse+cholesterol+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Lipidology%22%5BJournal%5D)">High-density lipoprotein heterogeneity and function in reverse cholesterol transport.</a> Current Opinion in Lipidology. 21 (3), 229-238 (2010).</li>
<li>Hafiane, A., Genest, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDL-mediated+cellular+cholesterol+efflux+assay+method%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Clinical+and+Laboratory+Science%22%5BJournal%5D)">HDL-mediated cellular cholesterol efflux assay method.</a> Annals of Clinical and Laboratory Science. 45 (6), 659-668 (2015).</li>
<li>Szalaia, R., Hadzsiev, K., Melegh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+P450+Drug+Metabolizing+Enzymes+in+Roma+Population+Samples%3A+Systematic+Review+of+the+Literature%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cytochrome P450 Drug Metabolizing Enzymes in Roma Population Samples: Systematic Review of the Literature.</a> Current Medicinal Chemistry. 23, 1-26 (2016).</li>
<li>Mcintosh, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Sterols+for+the+Study+of+Cholesterol+Trafficking+in+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Probes+and+Tags+to+Study+Biomolecular+Function%3A+for+Proteins%2C+RNA%2C+and+Membranes%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Sterols for the Study of Cholesterol Trafficking in Living Cells.</a> Probes and Tags to Study Biomolecular Function: for Proteins, RNA, and Membranes. , 1-33 (2008).</li>
<li>Ostašov, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLIM+studies+of+22-+and+25-NBD-cholesterol+in+living+HEK293+cells%3A+Plasma+membrane+change+induced+by+cholesterol+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+and+Physics+of+Lipids%22%5BJournal%5D)">FLIM studies of 22- and 25-NBD-cholesterol in living HEK293 cells: Plasma membrane change induced by cholesterol depletion.</a> Chemistry and Physics of Lipids. 167, 62-69 (2013).</li>
<li>Song, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+fluorescent+NBD-cholesterol+efflux+in+THP-1-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine+Reports%22%5BJournal%5D)">Characterization of fluorescent NBD-cholesterol efflux in THP-1-derived macrophages.</a> Molecular Medicine Reports. 12 (4), 5989-5996 (2015).</li>
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<li>Low, H., Hoang, A., Sviridov, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol+Efflux+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Cholesterol Efflux Assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), 5-9 (2012).</li>
<li>Gimpl, G., Gehrig-Burger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol+reporter+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience+Reports%22%5BJournal%5D)">Cholesterol reporter molecules.</a> Bioscience Reports. 27 (6), 335-358 (2007).</li>
<li>Zhang, J., Cai, S., Peterson, B. R., Kris-Etherton, P. M., Heuvel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vanden+Development+of+a+Cell-Based%2C+High-Throughput+Screening+Assay+for+Cholesterol+Efflux+Using+a+Fluorescent+Mimic+of+Cholesterol%5BTitle%5D)+AND+%22ASSAY+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">Vanden Development of a Cell-Based, High-Throughput Screening Assay for Cholesterol Efflux Using a Fluorescent Mimic of Cholesterol.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 9 (2), 136-146 (2011).</li>
<li>Rader, D. D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulation+of+HDL+metabolism+and+function%3A+implications+for+novel+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Molecular regulation of HDL metabolism and function: implications for novel therapies.</a> Journal of Clinical Investigation. 116 (12), 3090-3100 (2006).</li>
<li>Davidson, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+apolipoprotein+B+depletion+on+HDL+subspecies+composition+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">The effects of apolipoprotein B depletion on HDL subspecies composition and function.</a> Journal of Lipid Research. 57 (4), 674-686 (2016).</li>
<li>Park, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sage+weed+%28Salvia+plebeia%29+extract+antagonizes+foam+cell+formation+and+promotes+cholesterol+efflux+in+murine+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Sage weed (Salvia plebeia) extract antagonizes foam cell formation and promotes cholesterol efflux in murine macrophages.</a> International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1105-1112 (2012).</li>
<li>Litvinov, Y., Savushkin, E. V., Garaeva, E. A. D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol+Efflux+and+Reverse+Cholesterol+Transport%3A+Experimental+Approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cholesterol Efflux and Reverse Cholesterol Transport: Experimental Approaches.</a> Current Medicinal Chemistry. 371 (25), 2383-2393 (2016).</li>
<li>Phillips, A., Mucksavage, M. L., Wilensky, R. L., Mohler, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol+efflux+capacity%2C+high-density+lipoprotein+function%2C+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Cholesterol efflux capacity, high-density lipoprotein function, and atherosclerosis.</a> N Engl J Med. 364 (2), 127-135 (2011).</li>
<li>Rohatgi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDL+Cholesterol+Efflux+Capacity+and+Incident+Cardiovascular+Events%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">HDL Cholesterol Efflux Capacity and Incident Cardiovascular Events.</a> New England Journal of Medicine. 371 (25), 2383-2393 (2014).</li>
</ol>

Möchten die Autoren erklären, dass sie Erfinder der Patentanmeldung (EPA, 18382337.6-1118, 17. Mai 2018) mit dem Titel "Methode für die Bestimmung von Cholesterin Efflux" basiert auf diese Methode.

Leuchtstoff-gekennzeichnete Cholesterin ist eine vielversprechende Strategie analysieren und untersuchen die Eigenschaften und den Stoffwechsel von in-vitro-natürliche Cholesterin. Die wichtigsten Vorteile sind, dass es von den Zellen aufgenommen werden kann, ermöglicht die intrazellulären und Membran Reichweitenstudien und können auch auf Cholesterin Efflux-Assays wie in diesem Protokoll (Abbildung 7). Einige Leuchtstofflampen gekennzeichnet Sterole ermöglichen Cholesterin tracking in-vitro...

Nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation sind die aktuellen wichtigsten Todesursachen weltweit ischämischen Herzkrankheiten und Schlaganfall (Buchhaltung für insgesamt 15,2 Millionen Todesfälle)1. Beide sind Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD), die Arteriosklerose und der Bruch des Atheroms Plaques in Blutgefäßen2,3vorangestellt werden können.
Atherosklerose ist ein Schiff Wand entzündliche Erkrankung in der T-Zellen, Makrophagen, Mastzellen und dendritischen Zellen infiltrieren das Endothel und sammeln aus dem Blut, schließlich bildet arteriosklerotische Plaques. Arteriosklerotische Plaques präsentieren ein Lipid Kern und Cholesterin-Kristalle, belegt durch hochauflösende B-Mode Sonographie Messungen der a. carotis Intima Media Dicke4,5. In Makrophagen wird Cholesterin Efflux zur Lipid-Akzeptor-Partikel mit Mitteln der ATP-bindende Kassette (ABC) Rezeptoren ABCA1, ATP verbindliche Kassette Unterfamilie G Mitglied 1 (ABCG1) und der Scavenger-Rezeptor SR-BI durchgeführt. Das Ungleichgewicht der Cholesterin Zustrom und Fluth in Makrophagen gilt ein Schlüsselprozess bei Arteriosklerose Einleitung6. Cholesterin-Efflux gilt als ein wichtiger Schritt in der Cholesterin-Beseitigung von peripheren Gewebe in das Plasma und Leber in einem Prozess namens reverse Cholesterin-Transport (RCT). Cholesterin wird von Makrophagen hauptsächlich an Apolipoprotein A1 (ApoA1) gefunden auf der Oberfläche des High-density-Lipoprotein (HDL) Teilchen übertragen. HDLs transportieren dann Cholesterin zur Leber für die Ausscheidung und Verwertung7,8,9.
Traditionell hat Tritium (3H) radioaktiv markierten Cholesterin Cholesterin Efflux10eingesetzt. Die Emission Signal von Radioisotopen ist hochempfindlichen10; Allerdings stellt die radioaktiv markierten Cholesterin offensichtliche Nachteilen wie lange Protokolle, Risiko einer Exposition gegenüber ionisierender Strahlung und die Notwendigkeit für spezielle Radioaktivität Einrichtungen und Anlagen zum sicheren Umgang mit radioaktiven Emissionen zu gewährleisten. Fluoreszenz ist hingegen erfolgreich in diagnostischen Techniken aufgrund seiner Einfachheit in fluoreszierenden Signalerkennung, die unterschiedlichsten Fluorophore verfügbar und seine Sicherheit11aufgenommen worden. Mehrere Leuchtstofflampen gekennzeichnet Sterole wurden verwendet, um Cholesterin-Stoffwechsel einschließlich Dehydroergosterol (mit intrinsische Fluoreszenz), Dansyl Cholesterin, 4,4-Difluoro-3a, 4adiaza-s-Indacene (BODIPY) studieren - Cholesterin und 22-(N) (7) Nitrobenz-2-oxa-1,3-Diazol-4-YL)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-OL (NBD-Cholesterin). Insbesondere stellt NBD-Cholesterin eine effiziente Aufnahme in menschlichen Zellen12. Derzeit gibt es zwei verschiedene NBD gekennzeichnet-Cholesterin: 22-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-23,24-bisnor-5-cholen-3b-ol (22-NBD) und 25-(N-[(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)-methyl]amino)-27-norcholesterol (25-NBD; ( Abbildung 1). Cholesterin mit 22-NBD glyko-gekennzeichnet kann Cholesterin-Efflux-Studien, am besten passen, während 25-NBD-Cholesterin hauptsächlich in Zellmembran Dynamik Forschung13,14verwendet wird.
Zell-Linien in der Regel verwendet in in-vitro-Cholesterin-Efflux-Assays sind Monocyte-wie Zellen wie menschliche Leukämie abgeleitet THP-1-Zellen, murine Raw 264,7 Zellen15oder J774.1. Alle diese Zellen differenzieren sich in Makrophagen in Vitro mit Phorbol Myristate-12 13-Acetat (PMA), aber THP-1-derived Makrophagen (DmTHP-1) am besten widerspiegeln und imitieren die menschliche Makrophagen16.
In der vorliegenden Studie, wir optimieren und standardisieren eine fluoreszierende Hochdurchsatz-Methode auf, um die Cholesterin-Efflux-Kapazität der Serumproben auf DmTHP-1, ermitteln mit 22-NBD-Cholesterin als Alternative zu [3H]-Cholesterin. Darüber hinaus vergleichen wir die optimierte fluoreszierende Technik mit dem standard radioaktiven analogen.

<table><tbody><tr><td>96-Well-Sammelplatte</td><td>Corning Inc</td><td>Costar 3912</td><td>weiße 96-Well-Platte mit undurchsichtigem Boden</td></tr><tr><td>96-Well-Kulturplatte</td><td>Corning Inc</td><td>Costar 3610</td><td>weiße 96-Well-Platte mit flachem</td></tr><tr><td><>Cholesterol Efflux Assay Kit (zellbasiert)</td><td>Abcam</td><td>ab196985</td><td>kommerzielles zellbasiertes Hochdurchsatz-Assay-Kit zur Bestimmung der Cholesterinausfluss</td></tr><tr><td>farblos RPMI 1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7509</td><td>RPMI 1640 ohne Pehnolrot</td></tr><tr><td>Gen5 Datenanalysesoftware</td><td>BioTek</td><td></td><td>Version 2.0</td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8790-100G</td><td>Glycin, nicht für Tiere</td></tr><tr><td>geeignet Luminometer</td><td>Biotek</td><td>SYNERGY HT</td><td>Multi-Detection Microplate</td></tr><tr><td>Reader Lyselösung 1</td><td>hauseigene</td><td></td><td>50 mM Tris-Puffer, 150 mM NaCl und H2</td></tr><tr><td>O Lyselösung 2</td><td>hauseigene reine</td><td></td><td>Ethanol- und Zelllyselösung 1:1 (v:v)</td></tr><tr><td>NBD-Cholesterin</td><td>Thermo-Fisher</td><td>N1148</td><td>22-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-23,24-Bisnor-5-cholen-3&beta;-Ol</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813</td><td>phosphatgepuffert&nbsp; Kochsalzlösung</td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>202452-250G</td><td>Polyethylenglykol</td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>79346</td><td>Phorbol 12-Merystat B-Acetat.</td></tr><tr><td>R10</td><td>hauseigenes</td><td></td><td>RPMI 1640, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum und 5 % Penicillin/Streptomycin.</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td>RPMI 1640 mit 2 mM L-Glutamin mit 1,5 g/l Natriumbicarbonat und 4,5 g/l Glukose</td></tr><tr><td>THP-1 Zellen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ATCC, #TIB-202</td><td>Monozyten-ähnliche Linie, die aus der Leukämie eines einjährigen Babys gewonnen</td></tr><tr>wurde<td>Tween 80</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1754</td><td></td></tr></tbody></table>

hochdurchsatz-nitrobenzoxadiazole-label cholesterin-efflux-assay

High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled Cholesterol Efflux Assay

Arteriosklerose führt zu Herz-Kreislauf-Krankheit (CVD). Es ist noch unklar, ob Cholesterin HDL (cHDL) Konzentration spielt eine ursächliche Rolle in der Entwicklung von Atherosklerose. Allerdings ist ein wichtiger Faktor in frühen Stadien der Atherom Plaquebildung Cholesterin Efflux Fähigkeit, HDL (die Fähigkeit der HDL-Partikel, Cholesterin aus Makrophagen anzunehmen) um Zelle Schaumbildung zu vermeiden. Dies ist ein wichtiger Schritt bei der Vermeidung der Anhäufung von Cholesterin in das Endothel und ein Teil des umgekehrten Cholesterin-Transport (RCT), Cholesterin durch die Leber zu beseitigen. Cholesterin Efflux Fähigkeit, Serum oder Plasma in Makrophagen Zellmodellen ist ein viel versprechendes Instrument, das als Biomarker für Atherosklerose verwendet werden kann. Traditionell, [3H]-Cholesterin in Cholesterin-Efflux-Assays verwendet worden. In dieser Studie wollen wir ein sicherer und schneller mit fluoreszierenden gekennzeichnet-Cholesterin (NBD-Cholesterin)-Strategie in einem zellulären Assay, den Cholesterin Aufnahme und Fluth Prozess in THP-1-derived Makrophagen zu verfolgen. Endlich, wir optimieren und standardisieren die NBD-Cholesterin-Efflux-Methode und eine Hochdurchsatz-Analyse mit 96-Well Platten zu entwickeln.

Der Cholesterin-Efflux-Test soll in Vitro die Cholesterin Efflux Kapazität eines bestimmten Serum, Plasma oder überstand mit HDL-Partikeln zu ermitteln. Die Methode besteht darin, be-gekennzeichnet Cholesterin in eine Kultur einer standard Makrophagen-Zelllinie und Kontakt mit der Teststichprobe verdünnt in FBS-freie Medien mit den Zellen induzieren. Schließlich sind die fluoreszierenden Werte aus der NBD in den Medien und Zelle lysate gemessen. Um die Messungen zu optimieren, wird das Effluxed Cholesterin aus den Zellen...

Messung der in-vitro-Cholesterin Efflux Fähigkeit, Serum oder Plasma in Makrophagen Zellmodellen ist ein viel versprechendes Instrument als Biomarker für Atherosklerose. In der vorliegenden Studie wir optimieren und standardisieren eine fluoreszierende NBD-Cholesterin-Efflux-Methode und eine Hochdurchsatz-Analyse mit 96-Well Platten zu entwickeln.

Hochdurchsatz-Nitrobenzoxadiazole-Label Cholesterin-Efflux-Assay

Atherosclerosis leads to cardiovascular disease (CVD). It is still unclear whether cholesterol-HDL (cHDL) concentration plays a causal role in ...

Dieses Protokoll ist unsere zellbasierte Methode zur Cholesterinbeendigung des Cholesterinrefluxes im ceramalen Plasma. Vor allem bei Screenings. Dies kann angewendet werden, um kardiovaskuläre samtolare Risiken zu diagnostizieren, und cholesterinsenkende Erhaltung zu identifizieren oder zu bewerten.Diese Technik vermeidet das Risiko und die Belastungen, da die Sicherheit mit dem Umgang mit abgestrahlten Materialien durch die Bereitstellung von Ergebnissen mit vergleichbaren Qualitätsniveaus, zu denen von Cholesterin-Reflux wurde berichtet, um mit So, das Plasma oder ceramal Cholesterin Reflux der akzeptierten verglichen werden kann, um unsere Referenzkontrolle und kann das Risiko, von dieser Methode leiden wird auch auf die Zelllinien angewendet werden , wie andere menschliche Zelllinien oder sogar primäre Makrophasen. Makrophasen oder und vom Menschen induzierte Sprühknopfstammzellen. Um dieses Verfahren zu beginnen, lösen Sie das NPD-Cholesterin in reinem Ethanol auf, um eine Stofflösung mit einer Endkonzentration von zwei Mikromolaren zu erhalten.Verdünnen Sie 25 Mikroliter des NBD-Cholesterinbestands in AR 10 medium, um eine Endkonzentration von fünf Mikromolaren zu erreichen. Kultur thp-1 Zellen in unserem 10 Medium bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid. Passen Sie alle drei Tage die Zelldichte auf 300000 Zellen pro Milliliter an.Dann erhalten Sie eine 96-Well-Platte mit einem flachen klaren Boden. Für eine bessere Homogenisierung 10 Milliliter thp-1-Zellen in einem 15-Milliliter-Rohr vorbereiten und 200 Mikroliter PMA-Bestand hinzufügen. Mischen Sie vorsichtig und säen Sie 100 Mikroliter der Mischung in die Plattenbrunnen bei 200. 000 Zellen pro Brunnen.Und bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für 48 bis 72 Stunden inkubieren, um die thp-1-Zellen in DM-Thp-1-Zellen zu differenzieren. Zunächst Glycin in 10%PBS mit sterilem Wasser auf eine Konzentration von 200 Mikromolaren bei pH 7,4 verdünnen. Fügen Sie 40 Milliliter verdünntes Glycin zu 10 Gramm Peg 8000 hinzu, um eine 20%peg Lösung vorzubereiten, und mischen Sie kräftig, um zu homogenisieren.Als nächstes wenden Sie vier Teile von 20% pro 10 Teile der Probe auf jedes Serum oder Plasmaprobe in einem 1,5 ml Tube. Lassen Sie die Mischung für 25 Minuten auf Eis. Zentrifugieren Sie den Peg apolipoprotein B bei 13000 mal G und bei vier Grad Celsius für 15 Minuten.Entsorgen Sie den Niederschlag und übertragen Sie den Überstand in ein neues Rohr. Holen Sie sich die Platte, die die differenzierten thp-1-Zellen enthält. Entfernen und verwerfen Sie das Kulturmedium, und waschen Sie die Zellen dann zweimal mit 1X PBS.Fügen Sie 100 Mikroliter von 5 Mikromolaren MVD-Cholesterin in AR-10 Medium zu jedem Brunnen. Über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid inkubieren. Verwerfen Sie am nächsten Tag das Medium.Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS, und fügen Sie dann 100 Mikroliter ABDS, oder gereinigten Lipid-Akzeptor in rpmi 1630 Medium verdünnt, um die gewünschte Konzentration zu jedem Brunnen. Fügen Sie eine negative Kontrolle, die keine Cholesterin-Akzeptoren enthalten, in eine positive Kontrolle ein, wie im Textprotokoll beschrieben, und brüten Sie bei 37 Grad Celsius für vier bis sechs Stunden. In der Zwischenzeit bereiten Sie einen 200 Milliliter Vorrat an Zelllyselösung eins, wie im Text beschrieben.Mischen Sie diese Lösung mit Ethanol, in einem 1:1-Volumenverhältnis, um auch eine Lyselösung zu erhalten. Für die Medien- und BD-Cholesterindetektion entfernen Sie das Zellmedium von den Platten, die in einer neuen weißen 96-Well-Platte mit einem undurchsichtigen flachen Boden gesammelt wurden. Fügen Sie 100 Mikroliter reines Ethanol zu 100 Mikrolitern jeder medium Probe hinzu, um ein Eins-zu-Eins-Verhältnis in der neuen Platte zu erhalten.Messen Sie mit Hilfe eines Beleuchtungsometers die Intensität der Fluoreszenz bei einer Anregung von 463 Nanometern und einer Emission von 536 Nanometern. Für den intrazellulären NBD-Cholesterinnachweis, waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS. Fügen Sie 100 Mikroliter Lyse-Lösung zu jedem Brunnen hinzu und brüten bei Raumtemperatur, während sie 25 Minuten schütteln.Danach messen Sie die Intensität des Fluoreszenzes, während Sie den Empfindlichkeitsparameter in der Software auf 50 einstellen. Bestimmen Sie dann die Cholesterin-Effizienz im letzten Maß des Cholesterin-Efflux, wie im Textprotokoll beschrieben. Die Verdünnung des NBD-Cholesterins in reinem Ethanol erzeugt die höchsten Fluoreszenzintensitätswerte, während ein hoher Gehalt an wässriger Lösung die Intensität senkt.Dies deutet darauf hin, dass die Fluoreszenzemission dieses Moleküls in hohem Maße vom Medium abhängt, in dem es enthalten ist. Bei verwendung einer Mischung aus Medien und Ethanol im Verhältnis eins zu eins scheint die Intensität des Fluoreszenzes proportional zu zunehmen, mit einer Konzentration des Cholesterinanalogs, was darauf hindeutet, dass sich die Sonde unter diesen Bedingungen angemessen verhält. Um die Zeit zu bestimmen, die benötigt wird, um die geladenen Zellen mit Cholesterin-Akzeptoren zu bebrüten, werden Zellmedien zu verschiedenen Zeitpunkten geerntet.Der Cholesterin-Efflux entwickelte sich linear von null auf sechs Stunden, wobei das maximale Signal sechs Stunden nach der Zulage von ABDS zu den Zellen erfasst wurde. Die Sättigungsschwelle und der Dynamikbereich werden durch Messung des Cholesterinausflusses an unterschiedlichen Prozentsätzen von HDL-haltigen Medien getestet. Im Hochdurchsatz-Asset entwickelt sich der Efflux linear von einem bis 7%ABDS und erreicht den Höhepunkt der Cholesterin-Efflux-Kapazität bei 7%Bei Konzentrationen von mehr als 7% nimmt die Intensität des Fluroeszenzinals in einer umgekehrten Beziehung mit dem ABDS-Prozentsatz ab.Die Leistung der fluoreszenzbasierten Methode wird dann durch Einen Vergleich mit der standardmäßigen radiomarkierten Technik bewertet. Beide Techniken sind stark korreliert, wenn unterschiedliche Konzentrationen von ABDS verwendet werden. Die beschriebene Methode ist empfindlich auf eine Erhöhung der Akzeptanzkonzentrationen innerhalb der Cholesterin-Efflux-Werte zwischen fünf und 15%Es ist wichtig sicherzustellen, dass der Celluarizer keine Aggregate enthält.Kritischer Punkt ist die Einfeinerung einer ethanolhaltigen Gesamtumgebung, um die Fluoreszenz in einem homogenen und optimalen Gewicht zu messen. Nach diesem Verfahren kann der Name technisches Cholesterin gemessen werden, und die Wirkung von Medikamenten im Cholesterin-Efflux-Signalweg kann bestimmt werden. Auch die Schule schließlich als Diagnose verwendet werden, um Herz-Kreislauf-Risiko zu asses.Wir glauben, dass diese Methode viel einfacher und sicherer ist als die radioaktive Standardmethode. Es ist jedoch immer noch zellabhängig. Bitte denken Sie daran, dass Ethanol entzündlich ist und entsprechend gelagert und behandelt werden sollte.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Die Cholesterin-Assay wurde entwickelt, um die Geschwindigkeit der Cholesterin-Efflux aus kultivierten Zellen und die Kapazität des Plasmas Akzeptoren, Cholesterin aus den Zellen freigesetzt akzeptieren zu quantifizieren. Der Test besteht aus Markieren von Zellen mit Cholesterin, Äquilibrierung von Cholesterin unter den intrazellulären Pools und Freisetzung von Cholesterol an einer extrazellulären Akzeptor.

Cholesterin Efflux-Assay

Proteoliposomen werden verwendet, um gereinigte Kanäle und Transporter zu untersuchen, die in einer gut definierten biochemischen Umgebung rekonstituiert werden. Ein experimentelles Verfahren zur Messung des durch diese Proteine vermittelten Ausflusses wird veranschaulicht. Die Schritte zur Präparation von Proteoliposomen, zur Durchführung der Aufzeichnungen und zur Analyse der Daten zur quantitativen Bestimmung der funktionellen Eigenschaften des rekonstituierten Proteins werden beschrieben.

Ein Proteoliposom Basierte Efflux-Assay auf Einzelmoleküleigenschaften von Cl Bestimmen<sup&gt; -</sup&gt; Kanäle und Transporter

Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen bakteriellen Erregern und ihren Wirten ist ein wichtiger Bereich der biologischen Forschung. Hier beschreiben wir die notwendigen Techniken Effektor - Translokation durch Coxiella burnetii während siRNA Gen - Silencing mit BlaM Substrat zu messen.

Anwenden von Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) zu untersuchen Effektor Translokation Effizienz durch<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Während siRNA Silencing

Wir beschreiben hier ein fluorometrisch zellfreie biochemischen Assays zur Bestimmung von HDL-Lipidperoxidation. Dieser schnellen und reproduzierbaren Assay kann zur HDL-Funktion in groß angelegte Studien zu bestimmen und zu unserem Verständnis der HDL-Funktion in der menschlichen Krankheit beitragen kann.

Zellfreie biochemische fluorometrisch enzymatische Assays für Hochdurchsatz-Messung der Lipidperoxidation in High-Density Lipoprotein

Das Ziel dieser Studie war es, in-vitro- Lipid-senkenden Medikament Auswirkungen Modulation der Morphologie der Cholesterin-Partikel zu bewerten. Vergleich der Lipidsenker ergab Variationen in ihrer Wirkung Modulation der morphologischen Merkmale der Cholesterin-Partikel.

Differentielle Effekte von lipidsenkenden Medikamenten Modulation Morphologie der Cholesterin-Partikel

Dieses Protokoll bietet einen effizienten Ansatz zur Messung von LDL-Cholesterin-Aufnahme mit Real-Time Zustrom Raten mit einem live Cell imaging-System in verschiedenen Zelltypen. Diese Technik bietet eine Plattform die pharmakologische Aktivität von Verbindungen beeinflussen LDL Zustrom während der Überwachung für Zellmorphologie und damit potenzielle Zytotoxizität auf dem Bildschirm.

LDL-Cholesterin-Aufnahme-Assay mit Live Cell Imaging-Analyse mit Zelle Systemüberwachung

Hier wird ein sensitiver Fluoreszenztest zur Überwachung der Apolipoprotein-N-Acyltransferase-Aktivität unter Verwendung von Diacylglycerylpeptid und Alkin-Phospholipiden als Substrate mit Klickchemie vorgestellt.

Klickchemischer fluorometrischer Assay für Apolipoprotein-N-Acyltransferase von der Enzymcharakterisierung bis zum Hochdurchsatz-Screening

Dieses Protokoll beschreibt einen in vitro Assay zur Messung der zellulären Lipidaufnahme in Endothelzellen nach Stimulation mit BODIPY-C12 und BODIPY-C16 fluoreszierenden Analoga von langkettigen und sehr langkettigen gesättigten Fettsäuren. Diese Methode ist effizient und an andere Zelltypen anpassbar und bietet einen nützlichen Ansatz zur Untersuchung des Fettstoffwechsels.

Quantifizierung der endothelialen Fettsäureaufnahme mit Hilfe von fluoreszierenden Fettsäureanaloga

Darin beschreiben wir die Protokolle zur Messung der Menge an fluoreszierendem Phospholipid, die spezifisch aus Lipidspenderpartikeln durch High-Density-Lipoprotein (HDL) entfernt wird, das im gesamten menschlichen Plasma oder Serum vorhanden ist. Wir haben gezeigt, dass diese Metrik der HDL-Funktionalität das Auftreten von Herz-Kreislauf-Erkrankungen vorhersagt.

High-Density-Lipoprotein-spezifischer Phospholipid-Efflux-Assay

Ein High-Throughput-, automatisierten Plattform zur Herstellung von Zelllinien-Entwicklung für die Herstellung von Protein-Therapeutika wird beschrieben. Implementierung von BD FACS Aria Cell Sorter hat CloneSelect Imager und Tecan Freedom EVO Liquid-Handling-System deutlich erhöht Verarbeitungskapazität in Zelllinien-Entwicklung mit verbesserten Zell-Linie Qualität und hohe Reproduzierbarkeit nachgewiesen.

Ein automatisiertes Hochdurchsatz-Plattform für die Entwicklung von Manufacturing Zelllinien für Protein Therapeutics

Lernen Sie einen hochdurchsatzfähigen NBD-Cholesterin-Efflux-Assay zur Bewertung kardiovaskulärer Risiken in Makrophagen-Zellmodellen kennen. Diese fluoreszenzbasierte Methode bietet eine sichere Alternative zu radioaktiven Techniken.

Hochdurchsatz-Nitrobenzoxadiazole-Label Cholesterin-Efflux-Assay

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