In Vitro Differenzierung Modell der normalen Gedächtnis B Zellen zu langlebigen Plasmazellen

Plasmazellen sind seltene Zellen mit 30 Differenzierungsstadien, die an anatomischen Orten stattfinden und die vollständige biologische Charakterisierung beeinträchtigen, insbesondere beim Menschen. Unser In-vitro-Plasmazelldifferenzierungsmodell B2 reproduziert die sequenzielle Zelldifferenzierung und -reifung in den verschiedenen Organen in vivo. Dieses In-vitro-Modell rekapituliert die koordinierten Transkriptionsänderungen und den Phänotyp der verschiedenen B2-Plasmazellstadien, die in vivo nachgewiesen werden können.

Wir haben auch ein open-access bioinformatic-Tools entwickelt, um die prominentesten Informationen aus Explorationsdaten im Zusammenhang mit der Plasmazelldifferenzierung zu analysieren. Demonstriert wird das Verfahren von Hugues de Boussac, einem Postdoc aus meinem Labor. Um zu beginnen, erhalten periphere Blutzellen von gesunden Probanden für Gedächtnis B Zellreinigung.

Verdünnen Sie 7,5 Milliliter Blut mit 24,5 Milliliter rpMI 1640 medium. Als nächstes fügen Sie 12,5 Milliliter Raum-Temperatur-Gradient zu einem sterilen 50-Milliliter konischen Rohr hinzu. Überlagern Sie vorsichtig den Dichtegradienten mit den 32 Millilitern verdünntem Blut, um die Vermischung der beiden Phasen zu minimieren.

Zentrifuge für 20 Minuten bei 500-facher Schwerkraft mit abbremsender Bremse. Sammeln Sie die peripheren mononukleären Blutzellen aus der verdünnten Plasma- und Dichtegradientenschnittstelle. Übertragen Sie die Zellen in ein steriles 50-Milliliter-Rohr und füllen Sie das Rohr bis zu 45 Milliliter mit Hanks Balanced Salt Solution.

Zentrifuge bei 500-facher Schwerkraft für fünf Minuten. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und halten Sie das Pellet auf. Fügen Sie dann 45 Milliliter RPMI 1640 medium hinzu, ergänzt durch 10%FCS.

Zentrifuge bei 500-facher Schwerkraft für fünf Minuten. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und halten Sie das Pellet auf. Fügen Sie 30 Milliliter PBS hinzu, ergänzt durch 2%FCS.

Verwenden Sie Anti-CD-Magnetperlen, um CD2-positive Zellen zu entfernen, indem Sie vier Perlen für eine Zielzelle hinzufügen. Bei vier Grad Celsius für 30 Minuten inkubieren. Trennen Sie die perlengebundenen Zellen mithilfe eines Magneten für die Zelltrennungsanwendung von den ungebundenen Zellen.

Sammeln Sie die ungebundenen Zellen und inkubieren Sie sie mit Anti-CD19 APC und Anti-CD27 PE Antikörper für fünfzehn Minuten bei vier Grad Celsius. Waschen Sie die Zellen zweimal in PBS, die 10% Ziegenserum enthalten. Verwenden Sie dann den Zellsortierer, um die Speicher-B-Zellen auf eine Reinheit von 95 % zu reinigen.

Fügen Sie anschließend löslichen CD40-Ligand und monoklonalen Anti-Polyhistidin-Antikörper für die Aktivierung der B-Speicherzelle hinzu. Die gereinigten Speicher-B-Zellen vier Tage lang in Sechs-Well-Kulturplatten mit Interleukin-2, Interleukin-10 und Interleukin-15 verätzen. Verwenden Sie für die Genexpressionsprofilierung einen Zellsortierer, um die CD38-negativen CD20-negativen Preplasmablasten an Tag vier zu reinigen.

Zählen Sie die Zellen am vierten Tag und verkleben Sie sie in 12-Well-Kulturplatten mit einer Zelldichte von 250.000 Zellen pro Milliliter, indem Sie jedem Brunnen zwei Milliliter Zellsuspension hinzufügen. Um eine Differenzierung zu induzieren, entfernen Sie die CPG-Oligonukleotide und löslichen CD40-Ligand und fügen Sie ein neues Kulturmedium hinzu, das einen neuen Zytokin-Cocktail enthält, einschließlich Interleukin-2, Interleukin-6, Interleukin-10 und Interleukin-15. Kultur die Zellen für drei Tage bei 37 Grad Celsius.

Verwenden Sie für die Genexpressionsprofilierung einen Zellsortierer, um die CD38-positiven, CD20-negativen Plasmablasten an Tag sieben zu reinigen. Zählen Sie am siebten Tag die Zellen. Die Zellen in 12-Well-Kulturplatten mit einer Zelldichte von 500.000 Zellen pro Bohrkörper verkleben, indem Sie jedem Brunnen zwei Milliliter Zellsuspension hinzufügen.

Differenzieren Sie die Plasmastrahlen in frühe Plasmazellen mit frischem Kulturmedium, das Interleukin-6, Interleukin-15 und Interferon-alpha für drei Tage bei 37 Grad Celsius enthält. Verwenden Sie für die Genexpressionsprofilierung einen Zellsortierer, um die CD20-negativen, CD38-positiven CD138-positiven frühen Plasmazellen an Tag 10 zu reinigen. Erstens, Kultur StromalZellen für fünf Tage mit Kulturmedium.

Verwenden Sie einen 0,2-Mikroliter-Filter, um den Stromalzellkultur-Überstand zu filtern, um stromalzellkonditioniertes Medium zu erhalten und einzufrieren, bis er einsatzbereit ist. Als nächstes kulturieren Sie die frühen Plasmazellen in 12-Well-Kulturplatten, wobei das zuvor erhaltene Stromalzellmedium mit Interleukin-6 und APRIL bei einer Zelldichte von 500.000 Zellen pro Bohrloch verwendet wird, indem jedem Brunnen zwei Milliliter Zellsuspension hinzugefügt werden. Inkubieren Bei 37 Grad Celsius, Erneuerung der Stromalzelle konditionierte Medium jede Woche.

Messen Sie dann die Immunglobulinsekretion aus durchFlusszytometrie sortierten Plasmazellen. Kultur die Plasmazellen mit einer Dichte von einer Million Zellen pro Milliliter für 24 Stunden und Ernte der Kultur Überstand. Mit einem ELISA-Kit, messen Sie das Immunglobulin G, und Immunglobulin A.First, starten Sie die GenomicScape Open Access Bioinformatik Web-Tool.

Wählen Sie im Menü "Daten durchsuchen" das Dataset mit dem Namen menschliche B-Zellen in Plasmazellen aus. Die Visualisierung des Genexpressionsprofils eines eindeutigen Gens oder einer Liste von Genen ist mit dem Werkzeug Expression/Coexpression Report in den Analysetools verfügbar. Wählen Sie als Nächstes Analysis Tools webSAM aus, um das SAM-Tool zu laden.

Wählen Sie das Dataset "Menschliche B-Zellen" für Plasmazellen aus, und wählen Sie die Gruppe der zu vergleichenden Proben aus. Verwenden Sie die verschiedenen verfügbaren Filter, um die gewünschten Filteroptionen anzuwenden. Um Genexpressionsprofile mit dem SAM-Tool zu vergleichen, ändern Sie die Filteroptionen einschließlich Falzänderung, Anzahl der Permutationen, falscher Ermittlungsrate und der Art des Vergleichs.

Die Software berechnet die Analyse und liefert Gene, die differenziell zwischen den ausgewählten Gruppen ausgedrückt werden. In dieser Studie werden die Expressionsveränderungen der epigenetischen Faktoren bei der normalen Plasmazelldifferenzierung untersucht. Mit Hilfe der mehrklassigen SAM-Analyse werden 71 Gene signifikant differenziell zwischen den Speicher-B-Zellen, den Präplasmablasten, den Plasmastrahlen, den frühen Plasmazellen und den Knochenmarkmark-Plasmazellen mit einer falschen Entdeckungsrate von unter 5% exprimiert. , 21,74% der Histon-Deethylasen, 4,35% der Methylbindenden proteine und 4,35% der Histon-Deacetylasen.

14 epigenetische Spielergene werden im Präplasmablast-Stadium signifikant überexprimiert, darunter 50 % der Histonmethyltransferasen, 14,28 % der DNA-Methyltransferasen, 21,43 % der Histondeacetylasen, 7,14 % der Histon-Demethylasen und 17,14 % der Histonacetyltransferasen. Im Anschluss an dieses Verfahren konnten mehrere Analysen durchgeführt werden, um Veränderungen in der Chromatinstruktur und -architektur während dieser B2-Plasmazelldifferenzierung zu identifizieren und zu verstehen. Dieses In-vitro-Differenzierungsmodell wird es ermöglichen, genügend Zellen zu erzeugen, um diese molekulare Analyse abzuschließen, um sowohl die Anwege, die an dieser gesamten Modellierung beteiligt sind, als auch ihre nachgelagerte transkriptionelle Wirkung während der B2-Plasmazelldifferenzierung aufzudecken.

Dieses aus dieser Forschung gewonnene Wissen könnte über diagnostische und therapeutische Strategien bei Plasmazellerkrankungen, wie z.B. bei multiplem Myelom, einem Krebs ohne definitive Heilung, informieren und instruieren, für den eine bessere Prognose und verbesserte therapeutische Strategien dringend erforderlich sind. Von besonderem Interesse ist die Charakterisierung und das Verständnis der epigenetischen Umbaustruktur- und Architekturveränderungen, die Chromatin während der Differenzierung von B2-Plasmazellen beeinflussen. Dies könnte mit Gensequenzierung, ERRBS, ATAC-Sequenzierung, IC und RNA-Sequenzierung erfolgen.

Eine moderate Heterogenität konnte in dem Prozentsatz der aktivierten B-Zellen, Präplasmablasten, Plasmablasten und Plasmazellen beobachtet werden, abhängig von gesundem Spenderblut, das für die Speicher-B-Zellreinigung verwendet wird.