Name: In Vitro Differenzierung Modell der normalen Gedächtnis B Zellen zu langlebigen Plasmazellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-20T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Erfahren Sie ein in vitro-Modell zur Differenzierung von Gedächtnis-B-Zellen zu Plasmazellen mit Mehrstufen-Kultursystemen. Diese Methode reproduziert sequenzielle Zellreifung und transkriptionelle Veränderungen für die Immunforschung.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse von INCA Französisch (Institut National du Cancer) Institut (PLBIO15-256), ANR (Tie-Skip) und ITMO Krebs (MM & TT).

Das Protokoll folgt den Richtlinien entsprechend der Deklaration von Helsinki und Vereinbarung von Montpellier Universität Krankenhauszentrum für biologische Ressourcen.
(1) in Vitro Normal Plasmazelle Differenzierung Modell
Hinweis: PCs entstehen durch ein vierstufiges Kultur11,12,13.
<ol><li>
B-Zell-Verstärkung und Differenzierung
	<ol>
<li>Verwenden Sie peripheren Blut Zellen von gesunden Probanden für das Gedächtnis B Zellen Reinigung.</li>
		<li>Verdünnen Sie 7,5 mL Blut mit 24,5 mL RPMI 1640 Medium.</li>
		<li>Ein steril 50 mL konische Röhrchen 12,5 mL Raumtemperatur Dichtegradient (z. B. Ficoll) hinzufügen. Sanft überlagern der Dichtegradient mit 32 mL verdünnte Blut. Die Vermischung der beiden Phasen zu minimieren.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie 20 min bei 500 X g mit der Bremse aus. Sammeln Sie die PBMCs von der verdünnten Plasmadichte gradient Schnittstelle und legen Sie die Zellen in einer sterilen 50 mL Tube und füllen Sie bis 45 mL mit Hank es ausgeglichene Salzlösung.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Zellen für 5 min bei 500 X g. Nehmen Sie des Überstands vorsichtig und halten Sie das Pellet.</li>
		<li>45 mL RPMI1640/10% fetalen Kälberserum (FCS) und Zentrifuge 5 min bei 500 X gzugeben. Nehmen Sie des Überstands vorsichtig und halten Sie das Pellet. 30 mL PBS/2% FCS hinzugeben.</li>
		<li>
Entfernen Sie CD2 + Zellen mit magnetischen Beads Anti-CD2. 4 Perlen für eine Zielzelle hinzufügen. 30 min bei 4 ° c inkubieren
		<ol>
<li>Separate Wulst-gebundenen Zellen aus ungebundenen Zellen mit Hilfe eines Magneten für Zelle Trennung Anwendung. Ungebundene Zellen sammeln und 15 Minuten bei 4 ° C (2 µL des Antikörpers für 106 Zellen) Zelle Pellet mit anti-CD19 APC und anti-CD27 PE Antikörper inkubieren.</li>
			<li>Zweimal in PBS/10% Ziegenserum waschen.</li>
			<li>Entfernen Sie kontaminierende Ereignisse auf FSC und SSC Grundstücken. Plot-Unterhemden auf FSC-A Vs FSC-H und SSC-A Vs SSC-H Plots, Ablagerungen zu entfernen und die Bevölkerung insgesamt Leukozyten auszuwählen. Wählen Sie B Speicherzellen CD19/CD27 und CD19+CD27+.</li>
			<li>MBCs, mit einer Zelle Sorter mit einer Reinheit von 95 % zu reinigen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Alle Schritte Kultur mit IMDM und 10 % FCS, ergänzt mit 50 mg/mL menschlichen Transferrin und 5 mg/mL Humaninsulin.</li>
		<li>
Platte MBCs in sechs Brunnen Kultur Platten gereinigt (1,5 x 105 MBCs/mL in 5 mL/gut), für 4 Tage, mit IL-2 (20 U/mL), IL-10 (50 ng/mL) und IL-15 (10 ng/mL).
		<ol>
<li>Fügen Sie Phosphorothioat CpG ODN 2006, Histidin-markierten rekombinanten menschlichen lösliche CD40L (sCD40L; 50 ng/mL) und Anti-Polyhistidine mAb (5 mg/mL) für MBCs-Aktivierung (Abbildung 1). Aktivierung von sCD40L oder ODN nur mit der gleichen Zytokin cocktail Erträge niedriger Verstärkung12. Die Kombination der beschriebenen Aktivierung Signale hier verbleit, die maximale Anzahl von B-Zellen und PrePBs11,12 (Abbildung 1) aktiviert.</li>
			<li>Gene Expression Profiling, reinigen CD38–/CD20– PrePBs, am Tag 4, mit einer Zelle Sorter (Abbildung 2).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Plasmablastic Zellgeneration
	<ol>
<li>Am Tag 4 zählen Sie die Zellen.</li>
		<li>Platte Zellen in Kultur 12-Well Platten 2,5 x 105/mL in 2 mL/gut.</li>
		<li>Differenzierung durch Entfernung von CpG-Oligonukleotiden und sCD40L und Zugabe von ein neues Nährmedium mit einer neuen Zytokin cocktail einschließlich IL-2 induzieren (20 U/mL), IL-6 (50 ng/mL), IL-10 (50 ng/mL) und IL-15 (10 ng/mL) (Abbildung 1). Zellkulturen für 3 Tage (ab Tag 4 bis Tag 7) bei 37 ° C.</li>
		<li>Gene Expression Profiling, reinigen CD38+/CD20– PBs, an Tag 7, mit einer Zelle Sorter (Abbildung 2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Frühe Plasmazelle generation
	<ol>
<li>Am 7. Tag zählen Sie die Zellen.</li>
		<li>Typenschild Zellen in Kultur 12-Well-Platten an 5 x 105/mL in 2 mL/gut.</li>
		<li>PB in frühen PCs mit frischem Nährmedium mit IL-6 zu unterscheiden (50 ng/mL), IL-15 (10 ng/mL) und IFN-α (500 U/mL) für 3 Tage bei 37 ° C. Gene Expression Profiling, reinigen CD20–/CD38+/CD138+ frühen PCs, an Tag 10, mit einer Zelle Sorter (Abbildung 2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Langlebige Plasma Zellgeneration
	<ol>
<li>Frühen PCs in langlebigen PCs durch Ändern der Kulturbedingungen zu unterscheiden.</li>
		<li>Kultur der Zellen in Kultur 12-Well Platten am 5 x 105/mL in 2 mL/gut oder in Kultur 24-Well-Platten in 1 mL/auch bei 37 ° C mit IL-6 und Stromazellen Zelle konditionierten Medium und APRIL (200 ng/mL).</li>
		<li>Stromale Zelle konditioniertes Medium durch Kultivierung Stromazellen Zellen für 5 Tage mit Nährmedium zu erhalten. Filtern Sie die stromale Zellkultur überstand (0,2 µm) und Einfrieren.</li>
		<li>Fügen Sie 50 % der Stromazellen Zelle konditioniertes Medien PC Kulturen mit Erneuerung jede Woche. Generierte langlebigen PCs konnte für Monate13gehalten werden. Langfristige Überleben von PCs konnte mit IL-6 und APRIL nur als gemeldete13abgerufen werden.</li>
		<li>Maßnahme Ig Sekret Durchflusszytometrie sortiert PCs.</li>
		<li>Kultur-PCs bei 106 Zellen/mL für 24 h und Ernte Kultur überstand. Messen Sie IgG und IgA mit menschlichen Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA) Kits11,12,13. Die mittlere IgG-Sekretion reichte von 10 Pg/Zelle/Tag bei 10 bis 17 Pg/Zelle/Tag um Tag 6013.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. molekulare Atlas von B zu PC-Differenzierung
Hinweis: Wir bauten eine bequeme und open Access Bioinformatik zu extrahieren und zu visualisieren, die prominenteste Informationen von Affymetrix GEP Daten in Bezug auf PC Differenzierung (GenomicScape)15. GEP sind öffentlich zugänglich, aus ArrayExpress-Datenbank (http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/) einschließlich der gereinigten MBCs, PrePBs, PBs und EPC: E-MTAB-1771, E-MEXP-2360 und E-MEXP-3034 und BMPC E-MEXP-236014,15. Genomicscape ist eine frei verfügbare Webtool.
<ol><li>
Auswahl der B PC-Dataset
	<ol>
<li>Wählen Sie B PC-Dataset im Menü Durchsuchen Daten in GenomicScape open-Access Bioinformatic Tool (http://www.genomicscape.com) namens menschlichen B-Zellen zu Plasmazellen. Visualisierung des Genexpressionsprofils eindeutig Gens oder eine Liste von Genen steht zur Verfügung, mit dem Ausdruck Coexpression Bericht -Werkzeug in der Analyse-Tools zur Verfügung, auf der Startseite.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Betreute Analyse und Hauptkomponentenanalyse (PCA)
	<ol>
<li>Wählen Sie Analysetools | WebSAM , das SAM-Tool zu laden.</li>
		<li>Wählen Sie das Dataset menschlichen B-Zellen zu Plasmazellen und die Gruppen der Proben zu vergleichen.</li>
		<li>Verwenden Sie die verschiedenen Filter zur Verfügung, um die Filteroptionen von Interesse gelten.</li>
		<li>Um gen Expressionsprofile mit SAM-Tools vergleichen, ändern Sie die Filteroptionen inklusive Falte, Anzahl der Permutationen, False Discovery Rate und die Art des Vergleichs. GenomicScape wird die Analyse zu berechnen und Gene differentiell zwischen den ausgewählten Gruppen.</li>
		<li>Führen Sie Hauptkomponentenanalyse Principal Component Analysis im Analyse-Tools -Menü auswählen.</li>
		<li>Wählen Sie das Dataset menschlichen B-Zellen zu Plasmazellen und die Gruppen von Interesse.</li>
		<li>Fügen Sie eine Liste von Genen von Interesse oder wählen Sie Gene nach der Varianz. Eine Liste von Genen einfügen, wählen eine Liste der Gene/NcRNAs analysieren klicken Sie hier... Genomicscape wird PCA berechnen, die visualisiert und heruntergeladen werden können.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Shapiro-Shelef, M., Calame, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+plasma-cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regulation of plasma-cell development.</a> Nature Reviews Immunology. 5 (3), 230-242 (2005).</li>
<li>Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+generation+of+antibody-secreting+plasma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">The generation of antibody-secreting plasma cells.</a> Nature Reviews Immunology. 15 (3), 160-171 (2015).</li>
<li>Shaffer, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blimp-1+orchestrates+plasma+cell+differentiation+by+extinguishing+the+mature+B+cell+gene+expression+program%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Blimp-1 orchestrates plasma cell differentiation by extinguishing the mature B cell gene expression program.</a> Immunity. 17 (1), 51-62 (2002).</li>
<li>Minnich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+role+of+the+transcription+factor+Blimp-1+in+coordinating+plasma+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Multifunctional role of the transcription factor Blimp-1 in coordinating plasma cell differentiation.</a> Nature Immunology. 17 (3), 331-343 (2016).</li>
<li>Klein, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+IRF4+controls+plasma+cell+differentiation+and+class-switch+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Transcription factor IRF4 controls plasma cell differentiation and class-switch recombination.</a> Nature Immunology. 7 (7), 773-782 (2006).</li>
<li>Gass, J. N., Gunn, K. E., Sriburi, R., Brewer, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stressed-out+B+cells%3F+Plasma-cell+differentiation+and+the+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Stressed-out B cells? Plasma-cell differentiation and the unfolded protein response.</a> Trends in Immunology. 25 (1), 17-24 (2004).</li>
<li>Goldfinger, M., Shmuel, M., Benhamron, S., Tirosh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+synthesis+in+plasma+cells+is+regulated+by+crosstalk+between+endoplasmic+reticulum+stress+and+mTOR+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Protein synthesis in plasma cells is regulated by crosstalk between endoplasmic reticulum stress and mTOR signaling.</a> European Journal of Immunology. 41 (2), 491-502 (2011).</li>
<li>Yoshida, H., Matsui, T., Yamamoto, A., Okada, T., Mori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XBP1+mRNA+is+induced+by+ATF6+and+spliced+by+IRE1+in+response+to+ER+stress+to+produce+a+highly+active+transcription+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">XBP1 mRNA is induced by ATF6 and spliced by IRE1 in response to ER stress to produce a highly active transcription factor.</a> Cell. 107 (7), 881-891 (2001).</li>
<li>Shaffer, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XBP1%2C+downstream+of+Blimp-1%2C+expands+the+secretory+apparatus+and+other+organelles%2C+and+increases+protein+synthesis+in+plasma+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">XBP1, downstream of Blimp-1, expands the secretory apparatus and other organelles, and increases protein synthesis in plasma cell differentiation.</a> Immunity. 21 (1), 81-93 (2004).</li>
<li>Reimold, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+cell+differentiation+requires+the+transcription+factor+XBP-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Plasma cell differentiation requires the transcription factor XBP-1.</a> Nature. 412 (6844), 300-307 (2001).</li>
<li>Jourdan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+transitional+preplasmablast+population+in+the+process+of+human+B+cell+to+plasma+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Characterization of a transitional preplasmablast population in the process of human B cell to plasma cell differentiation.</a> Journal of Immunology. 187 (8), 3931-3941 (2011).</li>
<li>Jourdan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+model+of+differentiation+of+memory+B+cells+into+plasmablasts+and+plasma+cells+including+detailed+phenotypic+and+molecular+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">An in vitro model of differentiation of memory B cells into plasmablasts and plasma cells including detailed phenotypic and molecular characterization.</a> Blood. 114 (25), 5173-5181 (2009).</li>
<li>Jourdan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-6+supports+the+generation+of+human+long-lived+plasma+cells+in+combination+with+either+APRIL+or+stromal+cell-soluble+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">IL-6 supports the generation of human long-lived plasma cells in combination with either APRIL or stromal cell-soluble factors.</a> Leukemia. , (2014).</li>
<li>Kassambara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+miRNA+expression+analysis+identifies+novel+key+regulators+of+plasma+cell+differentiation+and+malignant+plasma+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Global miRNA expression analysis identifies novel key regulators of plasma cell differentiation and malignant plasma cell.</a> Nucleic Acids Research. 45 (10), 5639-5652 (2017).</li>
<li>Kassambara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GenomicScape%3A+an+easy-to-use+web+tool+for+gene+expression+data+analysis.+Application+to+investigate+the+molecular+events+in+the+differentiation+of+B+cells+into+plasma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">GenomicScape: an easy-to-use web tool for gene expression data analysis. Application to investigate the molecular events in the differentiation of B cells into plasma cells.</a> PLOS Computational Biology. 11 (1), 1004077(2015).</li>
<li>Miremadi, A., Oestergaard, M. Z., Pharoah, P. D., Caldas, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+genetics+of+epigenetic+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Cancer genetics of epigenetic genes.</a> Human Molecular Genetics. 16, Spec No 1 28-49 (2007).</li>
<li>Pei, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histone+methyltransferase+MMSET+regulates+class+switch+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The histone methyltransferase MMSET regulates class switch recombination.</a> Journal of Immunology. 190 (2), 756-763 (2013).</li>
<li>Le Gallou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-2+requirement+for+human+plasma+cell+generation%3A+coupling+differentiation+and+proliferation+by+enhancing+MAPK-ERK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">IL-2 requirement for human plasma cell generation: coupling differentiation and proliferation by enhancing MAPK-ERK signaling.</a> Journal of Immunology. 189 (1), 161-173 (2012).</li>
<li>Cocco, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+generation+of+long-lived+human+plasma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">In vitro generation of long-lived human plasma cells.</a> Journal of Immunology. 189 (12), 5773-5785 (2012).</li>
<li>Leung-Hagesteijn, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xbp1s-negative+tumor+B+cells+and+pre-plasmablasts+mediate+therapeutic+proteasome+inhibitor+resistance+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Xbp1s-negative tumor B cells and pre-plasmablasts mediate therapeutic proteasome inhibitor resistance in multiple myeloma.</a> Cancer Cell. 24 (3), 289-304 (2013).</li>
<li>Orlowski, R. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+proteasome+inhibitors+cannot+ERADicate+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Why proteasome inhibitors cannot ERADicate multiple myeloma.</a> Cancer Cell. 24 (3), 275-277 (2013).</li>
<li>Ding, B. B., Bi, E., Chen, H., Yu, J. J., Ye, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-21+and+CD40L+synergistically+promote+plasma+cell+differentiation+through+upregulation+of+Blimp-1+in+human+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">IL-21 and CD40L synergistically promote plasma cell differentiation through upregulation of Blimp-1 in human B cells.</a> Journal of Immunology. 190 (4), 1827-1836 (2013).</li>
<li>Tsai, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galectin-1+promotes+immunoglobulin+production+during+plasma+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Galectin-1 promotes immunoglobulin production during plasma cell differentiation.</a> Journal of Immunology. 181 (7), 4570-4579 (2008).</li>
<li>Tsai, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galectin-1+and+galectin-8+have+redundant+roles+in+promoting+plasma+cell+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Galectin-1 and galectin-8 have redundant roles in promoting plasma cell formation.</a> Journal of Immunology. 187 (4), 1643-1652 (2011).</li>
<li>Anginot, A., Espeli, M., Chasson, L., Mancini, S. J., Schiff, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galectin+1+modulates+plasma+cell+homeostasis+and+regulates+the+humoral+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Galectin 1 modulates plasma cell homeostasis and regulates the humoral immune response.</a> Journal of Immunology. 190 (11), 5526-5533 (2013).</li>
<li>Belnoue, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homing+and+adhesion+patterns+determine+the+cellular+composition+of+the+bone+marrow+plasma+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Homing and adhesion patterns determine the cellular composition of the bone marrow plasma cell niche.</a> Journal of Immunology. 188 (3), 1283-1291 (2012).</li>
<li>Belnoue, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APRIL+is+critical+for+plasmablast+survival+in+the+bone+marrow+and+poorly+expressed+by+early-life+bone+marrow+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">APRIL is critical for plasmablast survival in the bone marrow and poorly expressed by early-life bone marrow stromal cells.</a> Blood. 111 (5), 2755-2764 (2008).</li>
<li>Huard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APRIL+secreted+by+neutrophils+binds+to+heparan+sulfate+proteoglycans+to+create+plasma+cell+niches+in+human+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">APRIL secreted by neutrophils binds to heparan sulfate proteoglycans to create plasma cell niches in human mucosa.</a> Journal of Clinical Investigation. 118 (8), 2887-2895 (2008).</li>
<li>Ame-Thomas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mesenchymal+stem+cells+isolated+from+bone+marrow+and+lymphoid+organs+support+tumor+B-cell+growth%3A+role+of+stromal+cells+in+follicular+lymphoma+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human mesenchymal stem cells isolated from bone marrow and lymphoid organs support tumor B-cell growth: role of stromal cells in follicular lymphoma pathogenesis.</a> Blood. 109 (2), 693-702 (2007).</li>
<li>Ramachandrareddy, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BCL6+promoter+interacts+with+far+upstream+sequences+with+greatly+enhanced+activating+histone+modifications+in+germinal+center+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">BCL6 promoter interacts with far upstream sequences with greatly enhanced activating histone modifications in germinal center B cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (26), 11930-11935 (2010).</li>
<li>Li, G., Zan, H., Xu, Z., Casali, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics+of+the+antibody+response%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Epigenetics of the antibody response.</a> Trends in Immunology. 34 (9), 460-470 (2013).</li>
<li>Miles, R. R., Crockett, D. K., Lim, M. S., Elenitoba-Johnson, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+BCL6-interacting+proteins+by+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Analysis of BCL6-interacting proteins by tandem mass spectrometry.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 4 (12), 1898-1909 (2005).</li>
<li>McManus, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+Pax5+regulates+its+target+genes+by+recruiting+chromatin-modifying+proteins+in+committed+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">The transcription factor Pax5 regulates its target genes by recruiting chromatin-modifying proteins in committed B cells.</a> The EMBO Journal. 30 (12), 2388-2404 (2011).</li>
<li>Ahmadnejad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+expression+of+DNMT1+is+associated+with+increased+expansion+and+proliferation+of+hematopoietic+stem+cells+co-cultured+with+human+MSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Research%22%5BJournal%5D)">Elevated expression of DNMT1 is associated with increased expansion and proliferation of hematopoietic stem cells co-cultured with human MSCs.</a> Blood Research. 52 (1), 25-30 (2017).</li>
<li>Beguelin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EZH2+is+required+for+germinal+center+formation+and+somatic+EZH2+mutations+promote+lymphoid+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">EZH2 is required for germinal center formation and somatic EZH2 mutations promote lymphoid transformation.</a> Cancer Cell. 23 (5), 677-692 (2013).</li>
<li>Herviou, L., Cavalli, G., Cartron, G., Klein, B., Moreaux, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EZH2+in+normal+hematopoiesis+and+hematological+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">EZH2 in normal hematopoiesis and hematological malignancies.</a> Oncotarget. 7 (3), 2284-2296 (2016).</li>
<li>Beguelin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EZH2+enables+germinal+centre+formation+through+epigenetic+silencing+of+CDKN1A+and+an+Rb-E2F1+feedback+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">EZH2 enables germinal centre formation through epigenetic silencing of CDKN1A and an Rb-E2F1 feedback loop.</a> Nature Communications. 8 (1), 877(2017).</li>
<li>Herviou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRC2+targeting+is+a+therapeutic+strategy+for+EZ+score+defined+high-risk+multiple+myeloma+patients+and+overcome+resistance+to+IMiDs%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Epigenetics%22%5BJournal%5D)">PRC2 targeting is a therapeutic strategy for EZ score defined high-risk multiple myeloma patients and overcome resistance to IMiDs.</a> Clinical Epigenetics. 10 (1), 121(2018).</li>
<li>Asangani, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+EZH2-MMSET+histone+methyltransferase+regulatory+axis+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Characterization of the EZH2-MMSET histone methyltransferase regulatory axis in cancer.</a> Molecular Cell. 49 (1), 80-93 (2013).</li>
<li>Pei, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MMSET+regulates+histone+H4K20+methylation+and+53BP1+accumulation+at+DNA+damage+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MMSET regulates histone H4K20 methylation and 53BP1 accumulation at DNA damage sites.</a> Nature. 470 (7332), 124-128 (2011).</li>
<li>Cui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EHMT2+inhibitor+BIX-01294+induces+apoptosis+through+PMAIP1-USP9X-MCL1+axis+in+human+bladder+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+International%22%5BJournal%5D)">EHMT2 inhibitor BIX-01294 induces apoptosis through PMAIP1-USP9X-MCL1 axis in human bladder cancer cells.</a> Cancer Cell International. 15 (1), 4(2015).</li>
<li>Santo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+activity%2C+pharmacodynamic%2C+and+pharmacokinetic+properties+of+a+selective+HDAC6+inhibitor%2C+ACY-1215%2C+in+combination+with+bortezomib+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Preclinical activity, pharmacodynamic, and pharmacokinetic properties of a selective HDAC6 inhibitor, ACY-1215, in combination with bortezomib in multiple myeloma.</a> Blood. 119 (11), 2579-2589 (2012).</li>
<li>Amengual, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+Targeting+of+Protein+Degradation+Pathways+with+the+Selective+HDAC6+Inhibitor+ACY-1215+and+Bortezomib+Is+Synergistic+in+Lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Dual Targeting of Protein Degradation Pathways with the Selective HDAC6 Inhibitor ACY-1215 and Bortezomib Is Synergistic in Lymphoma.</a> Clinical Cancer Research. 21 (20), 4663-4675 (2015).</li>
<li>Schoenhals, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forced+KLF4+expression+increases+the+generation+of+mature+plasma+cells+and+uncovers+a+network+linked+with+plasma+cell+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Forced KLF4 expression increases the generation of mature plasma cells and uncovers a network linked with plasma cell stage.</a> Cell Cycle. 15 (14), 1919-1928 (2016).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben

In der Human-PC sind seltene Zellen mit Differenzierung Stufen statt an anatomischen stellen, die volle biologische Charakterisierung zu behindern. Haben wir einen in-vitro-B mit PC Differenzierung Modell mehrstufige Systeme wo sind verschiedene Kombinationen von Aktivierung Moleküle und Zytokine anschließend angewendet, um die sequenzielle Zelldifferenzierung im reproduzieren der verschiedene Organe/Gewebe in Vivo11,12,13.
...

Die Differenzierung der B-Zellen zu Plasmazellen (PCs) ist wichtig für die humorale Immunität und schützen die Gastgeber gegen Infektionen1. B PC Differenzierung ist verbunden mit großen Veränderungen in Transkription Kapazität und des Stoffwechsels, zu Antikörper-Sekretion unterzubringen. Die Transkriptionsfaktoren, die B auf PC Differenzierung Steuern wurden ausgiebig untersucht und offenbarten exklusive Netzwerke einschließlich B - und PC-spezifische Transkription Faktoren (TFs)2. In B-Zellen sind PAX5, BCL6 und BACH2 TFs die Hüter der B-Zell-Identität-2,-3. Induktion von IRF4, PRDM1 BLIMP1 und XBP1 PC TF-Codierung wird B-Zell-Gene zu löschen und induzieren eine koordinierte Antikörper-sezernierenden Zelle transkriptionelle Programm3,4,5. Diese koordinierte transcriptional Änderungen sind verbunden mit Ig Gene Transcription Aktivierung zusammen mit einem Wechsel von der Membran-gebundener Form zu sekretierte Form von Immunglobulin schwere Kette2,3, 4. B zu PC Differenzierung ist mit Induktion von Genen, die im endoplasmatischen Retikulum und Golgi-Apparat funktioniert mit unfolded Protein Response (UPR) Aktivierung bekannt, eine wichtige Rolle im PC zu spielen, durch die Aufnahme der Synthesis von abgesondert, Immunglobuline6,7. Die TF-XBP1 spielt eine wichtige Rolle in diesem zellulären Anpassung8,9,10.
B-Zellen und PCs sind Hauptakteure der humoralen Immunität. Verständnis der biologisches Prozesse, Kontrolle der Produktion und das Überleben der normalen Plasmazellen ist von entscheidender Bedeutung im therapeutischen Interventionen, die müssen effiziente Immunantworten zu gewährleisten und verhindern Autoimmunität oder Immunschwäche. PC sind seltene Zellen mit Frühstadium Differenzierung findet in anatomischen Standorten, die volle biologische Charakterisierung, besonders beim Menschen behindern. Mit mehrstufigen Kultur-Systemen, haben wir einen in-vitro-B PC Differenzierung Modell berichtet. Dieses Modell bildet die sequentielle Zell-Differenzierung und Reifung, die in den verschiedenen Organen in Vivo11,12,13. In einem ersten Schritt B Speicherzellen sind zunächst vier Tage lang durch CD40-Liganden, Oligodeoxynukleotiden und Zytokin-Kombination aktiviert und in Preplasmablasts (PrePBs) zu unterscheiden. In einem zweiten Schritt werden Preplasmablasts induziert, in Plasmablasts (PBs) zu unterscheiden durch CD40L und Oligodeoxynukleotiden Stimulation entfernen und ändern die Zytokin-Kombination. In einem dritten Schritt werden Plasmablasts induziert, in frühen PCs zu unterscheiden, indem Sie ändern die Cytokine Kombination11,12. Ein vierter Schritt wurde eingeführt, um ausgereifte PCs bekommen durch die Kultivierung dieser frühen PCs mit dem Knochenmark Stromazellen Zellen bedingt Medium oder Wachstumsfaktoren13ausgewählt. Diese ältere PCs in-vitro-mehrere Monate überleben und absondern, hohe Mengen an Immunglobulin (Abbildung 1). Interessanterweise, rekapituliert unsere in-vitro-Modell die koordinierte transcriptional Änderungen und dem Phänotyp der verschiedenen B PC-Stufen, die erkannten in-vivo-11,12,13,14 ,15. PCs sind seltene Zellen und unsere in-vitro-Differenzierung Modell erlaubt, um menschliche B PC Differenzierung zu studieren.

<table><tbody><tr><td>magnetische Anti-CD2-Kügelchen</td><td>Invitrogen</td><td>11159D</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD138-APC</td><td>Beckman-Coulter&nbsp;</td><td>B49219</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD19-APC</td><td>BD</td><td>555415</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD20-PB</td><td>Beckman-Coulter&nbsp;</td><td>B49208</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD27-PE</td><td>BD</td><td>555441</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD38-PE</td><td>Beckman-Coulter&nbsp;</td><td>A07779</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Histidin</td><td>R& D Systems</td><td>MAB050</td><td></td></tr><tr><td>CpG ODN(PT)Sigma</td><td></td><td></td> <td>T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*T*G*T*C* G*T*T*T*T*T*T*T*T*C*G*T*T</td></tr><tr><td>human</td><td>Transferin Sigma-Aldrich</td><td>T3309</td><td></td></tr><tr><td>IFN-&alpha;</td><td>Merck</td><td>Intron A</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Gibco</td><td>31980-022</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinan Human CD40L-hi</td><td>R& D Systems</td><td>2706-CL</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinanter Mensch APRIL</td><td>R& D Systems</td><td>5860-AP-010</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinantes humanes IL-10</td><td>R& D Systems</td><td>217-IL-Rekombinantes</td><td></td></tr> <tr><td>humanes IL-15</td><td>Peprotech</td><td>200-15-10ug</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinantes humanes IL-2-Protein</td><td>R& D Systems</td><td>202-IL-Rekombinant</td><td></td></tr> <tr><td>Human IL-6</td><td>Peprotech</td><td>200-06</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro differenzierung modell der normalen gedächtnis b zellen zu langlebigen plasmazellen

In Vitro Differentiation Model of Human Normal Memory B Cells to Long-lived Plasma Cells

Plasmazellen (PCs) absondern, große Mengen von Antikörpern und entwickeln von B-Zellen, die aktiviert wurden. PCs sind seltene Zellen im Knochenmark oder in der Schleimhaut und humorale Immunität zu gewährleisten. Aufgrund ihrer niedrigen Frequenz und Position, die Untersuchung von PCs ist schwierig in der menschlichen. Wir berichteten einen B an PC in-vitro-Differenzierung Modell mit ausgewählten Kombinationen von Zytokinen und Aktivierung Moleküle, die es ermöglichen, um die sequentielle Zelldifferenzierung Auftritt in vivo zu reproduzieren. In diesem in-vitro-Modell, Speicher, B-Zellen (MBCs) in Pre-Plasmablasts (PrePBs), Plasmablasts (PBs), früh PCs unterscheiden werden und schließlich in langlebigen schließen-PCs mit einem Phänotyp zu ihren Gegenstücken in den gesunden Einzelpersonen. Wir bauten auch eine open-Access-Bioinformatik Werkzeuge um die prominentesten Informationen von GEP-Daten im Zusammenhang mit PC-Differenzierung zu analysieren. Diese Ressourcen können verwendet werden, um menschliche B PC Differenzierung und in der aktuellen Studie zu studieren, untersuchten wir Ausdruck Genregulation epigenetische Faktoren während der menschlichen B PC Differenzierung.

Das gesamte Verfahren der in-vitro-normale PC-Differenzierung wird in Abbildung 1dargestellt. Mit den hier vorgestellten Protokoll, konnte wir ausreichenden Menge an Zellen generiert werden, die nicht mit ex-Vivo humanen Proben gewonnen werden konnte. Obwohl die Rolle des komplexen Netzwerks von Transkriptionsfaktoren PC Differenzierung beteiligt untersucht worden ist, bleiben die Mechanismen, die Regulierung der wichtigsten PC Differenzierung Transkription N...

Mit mehrstufigen Kultur-Systeme, berichten wir eine in-vitro-B-Zelle zur Plasmazelle Differenzierung Modell.

In Vitro Differenzierung Modell der normalen Gedächtnis B Zellen zu langlebigen Plasmazellen

Plasma cells (PCs) secrete large amounts of antibodies and develop from B cells that have been activated. PCs are rare cells located in the bone marrow or ...

Plasmazellen sind seltene Zellen mit 30 Differenzierungsstadien, die an anatomischen Orten stattfinden und die vollständige biologische Charakterisierung beeinträchtigen, insbesondere beim Menschen. Unser In-vitro-Plasmazelldifferenzierungsmodell B2 reproduziert die sequenzielle Zelldifferenzierung und -reifung in den verschiedenen Organen in vivo. Dieses In-vitro-Modell rekapituliert die koordinierten Transkriptionsänderungen und den Phänotyp der verschiedenen B2-Plasmazellstadien, die in vivo nachgewiesen werden können.Wir haben auch ein open-access bioinformatic-Tools entwickelt, um die prominentesten Informationen aus Explorationsdaten im Zusammenhang mit der Plasmazelldifferenzierung zu analysieren. Demonstriert wird das Verfahren von Hugues de Boussac, einem Postdoc aus meinem Labor. Um zu beginnen, erhalten periphere Blutzellen von gesunden Probanden für Gedächtnis B Zellreinigung.Verdünnen Sie 7,5 Milliliter Blut mit 24,5 Milliliter rpMI 1640 medium. Als nächstes fügen Sie 12,5 Milliliter Raum-Temperatur-Gradient zu einem sterilen 50-Milliliter konischen Rohr hinzu. Überlagern Sie vorsichtig den Dichtegradienten mit den 32 Millilitern verdünntem Blut, um die Vermischung der beiden Phasen zu minimieren.Zentrifuge für 20 Minuten bei 500-facher Schwerkraft mit abbremsender Bremse. Sammeln Sie die peripheren mononukleären Blutzellen aus der verdünnten Plasma- und Dichtegradientenschnittstelle. Übertragen Sie die Zellen in ein steriles 50-Milliliter-Rohr und füllen Sie das Rohr bis zu 45 Milliliter mit Hanks Balanced Salt Solution.Zentrifuge bei 500-facher Schwerkraft für fünf Minuten. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und halten Sie das Pellet auf. Fügen Sie dann 45 Milliliter RPMI 1640 medium hinzu, ergänzt durch 10%FCS.Zentrifuge bei 500-facher Schwerkraft für fünf Minuten. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und halten Sie das Pellet auf. Fügen Sie 30 Milliliter PBS hinzu, ergänzt durch 2%FCS.Verwenden Sie Anti-CD-Magnetperlen, um CD2-positive Zellen zu entfernen, indem Sie vier Perlen für eine Zielzelle hinzufügen. Bei vier Grad Celsius für 30 Minuten inkubieren. Trennen Sie die perlengebundenen Zellen mithilfe eines Magneten für die Zelltrennungsanwendung von den ungebundenen Zellen.Sammeln Sie die ungebundenen Zellen und inkubieren Sie sie mit Anti-CD19 APC und Anti-CD27 PE Antikörper für fünfzehn Minuten bei vier Grad Celsius. Waschen Sie die Zellen zweimal in PBS, die 10% Ziegenserum enthalten. Verwenden Sie dann den Zellsortierer, um die Speicher-B-Zellen auf eine Reinheit von 95 % zu reinigen.Fügen Sie anschließend löslichen CD40-Ligand und monoklonalen Anti-Polyhistidin-Antikörper für die Aktivierung der B-Speicherzelle hinzu. Die gereinigten Speicher-B-Zellen vier Tage lang in Sechs-Well-Kulturplatten mit Interleukin-2, Interleukin-10 und Interleukin-15 verätzen. Verwenden Sie für die Genexpressionsprofilierung einen Zellsortierer, um die CD38-negativen CD20-negativen Preplasmablasten an Tag vier zu reinigen.Zählen Sie die Zellen am vierten Tag und verkleben Sie sie in 12-Well-Kulturplatten mit einer Zelldichte von 250.000 Zellen pro Milliliter, indem Sie jedem Brunnen zwei Milliliter Zellsuspension hinzufügen. Um eine Differenzierung zu induzieren, entfernen Sie die CPG-Oligonukleotide und löslichen CD40-Ligand und fügen Sie ein neues Kulturmedium hinzu, das einen neuen Zytokin-Cocktail enthält, einschließlich Interleukin-2, Interleukin-6, Interleukin-10 und Interleukin-15. Kultur die Zellen für drei Tage bei 37 Grad Celsius.Verwenden Sie für die Genexpressionsprofilierung einen Zellsortierer, um die CD38-positiven, CD20-negativen Plasmablasten an Tag sieben zu reinigen. Zählen Sie am siebten Tag die Zellen. Die Zellen in 12-Well-Kulturplatten mit einer Zelldichte von 500.000 Zellen pro Bohrkörper verkleben, indem Sie jedem Brunnen zwei Milliliter Zellsuspension hinzufügen.Differenzieren Sie die Plasmastrahlen in frühe Plasmazellen mit frischem Kulturmedium, das Interleukin-6, Interleukin-15 und Interferon-alpha für drei Tage bei 37 Grad Celsius enthält. Verwenden Sie für die Genexpressionsprofilierung einen Zellsortierer, um die CD20-negativen, CD38-positiven CD138-positiven frühen Plasmazellen an Tag 10 zu reinigen. Erstens, Kultur StromalZellen für fünf Tage mit Kulturmedium.Verwenden Sie einen 0,2-Mikroliter-Filter, um den Stromalzellkultur-Überstand zu filtern, um stromalzellkonditioniertes Medium zu erhalten und einzufrieren, bis er einsatzbereit ist. Als nächstes kulturieren Sie die frühen Plasmazellen in 12-Well-Kulturplatten, wobei das zuvor erhaltene Stromalzellmedium mit Interleukin-6 und APRIL bei einer Zelldichte von 500.000 Zellen pro Bohrloch verwendet wird, indem jedem Brunnen zwei Milliliter Zellsuspension hinzugefügt werden. Inkubieren Bei 37 Grad Celsius, Erneuerung der Stromalzelle konditionierte Medium jede Woche.Messen Sie dann die Immunglobulinsekretion aus durchFlusszytometrie sortierten Plasmazellen. Kultur die Plasmazellen mit einer Dichte von einer Million Zellen pro Milliliter für 24 Stunden und Ernte der Kultur Überstand. Mit einem ELISA-Kit, messen Sie das Immunglobulin G, und Immunglobulin A.First, starten Sie die GenomicScape Open Access Bioinformatik Web-Tool.Wählen Sie im Menü "Daten durchsuchen" das Dataset mit dem Namen menschliche B-Zellen in Plasmazellen aus. Die Visualisierung des Genexpressionsprofils eines eindeutigen Gens oder einer Liste von Genen ist mit dem Werkzeug Expression/Coexpression Report in den Analysetools verfügbar. Wählen Sie als Nächstes Analysis Tools webSAM aus, um das SAM-Tool zu laden.Wählen Sie das Dataset "Menschliche B-Zellen" für Plasmazellen aus, und wählen Sie die Gruppe der zu vergleichenden Proben aus. Verwenden Sie die verschiedenen verfügbaren Filter, um die gewünschten Filteroptionen anzuwenden. Um Genexpressionsprofile mit dem SAM-Tool zu vergleichen, ändern Sie die Filteroptionen einschließlich Falzänderung, Anzahl der Permutationen, falscher Ermittlungsrate und der Art des Vergleichs.Die Software berechnet die Analyse und liefert Gene, die differenziell zwischen den ausgewählten Gruppen ausgedrückt werden. In dieser Studie werden die Expressionsveränderungen der epigenetischen Faktoren bei der normalen Plasmazelldifferenzierung untersucht. Mit Hilfe der mehrklassigen SAM-Analyse werden 71 Gene signifikant differenziell zwischen den Speicher-B-Zellen, den Präplasmablasten, den Plasmastrahlen, den frühen Plasmazellen und den Knochenmarkmark-Plasmazellen mit einer falschen Entdeckungsrate von unter 5% exprimiert. , 21,74% der Histon-Deethylasen, 4,35% der Methylbindenden proteine und 4,35% der Histon-Deacetylasen.14 epigenetische Spielergene werden im Präplasmablast-Stadium signifikant überexprimiert, darunter 50 % der Histonmethyltransferasen, 14,28 % der DNA-Methyltransferasen, 21,43 % der Histondeacetylasen, 7,14 % der Histon-Demethylasen und 17,14 % der Histonacetyltransferasen. Im Anschluss an dieses Verfahren konnten mehrere Analysen durchgeführt werden, um Veränderungen in der Chromatinstruktur und -architektur während dieser B2-Plasmazelldifferenzierung zu identifizieren und zu verstehen. Dieses In-vitro-Differenzierungsmodell wird es ermöglichen, genügend Zellen zu erzeugen, um diese molekulare Analyse abzuschließen, um sowohl die Anwege, die an dieser gesamten Modellierung beteiligt sind, als auch ihre nachgelagerte transkriptionelle Wirkung während der B2-Plasmazelldifferenzierung aufzudecken.Dieses aus dieser Forschung gewonnene Wissen könnte über diagnostische und therapeutische Strategien bei Plasmazellerkrankungen, wie z.B. bei multiplem Myelom, einem Krebs ohne definitive Heilung, informieren und instruieren, für den eine bessere Prognose und verbesserte therapeutische Strategien dringend erforderlich sind. Von besonderem Interesse ist die Charakterisierung und das Verständnis der epigenetischen Umbaustruktur- und Architekturveränderungen, die Chromatin während der Differenzierung von B2-Plasmazellen beeinflussen. Dies könnte mit Gensequenzierung, ERRBS, ATAC-Sequenzierung, IC und RNA-Sequenzierung erfolgen.Eine moderate Heterogenität konnte in dem Prozentsatz der aktivierten B-Zellen, Präplasmablasten, Plasmablasten und Plasmazellen beobachtet werden, abhängig von gesundem Spenderblut, das für die Speicher-B-Zellreinigung verwendet wird.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Wir beschreiben ein Verfahren zur Erzeugung von transformierten B-Zell-Linien mit Epstein-Barr-Virus. Wir zeigen auch eine neuartige Assays, dass B-Zellen bestimmt, Transformation bereits drei Tage nach der Infektion unterziehen identifizieren können.

Gründung des Epstein-Barr Virus Growth-transformierten lymphoblastoiden Zelllinien

Die Synthese von humanen monoklonalen Antikörpern ist der erste Schritt in Studien, die darauf abzielen, die pathophysiologischen Mechanismen von Autoantikörper-vermittelten Immunantworten zu entschlüsseln. Wir haben ein Protokoll zur Erzeugung rekombinanter monoklonaler Immunglobulin G (IgG)-Antikörper aus blutsortierten B-Zellen entwickelt, einschließlich B-Zellisolierung, Antikörperklonierung und In-vitro-Synthese.

Erzeugung von rekombinanten humanen IgG monoklonalen Antikörpern aus Immortalisierte Sortiert B Cells

Menschliches peripheres Blut wird häufig zur Beurteilung der humoralen Immunantwort verwendet. Im Folgenden werden die Methoden zur Isolierung humaner B-Zellen aus peripherem Blut, zur Differenzierung humaner B-Zellen in Antikörper (Ab)-sezernierende B-Zellen (ASCs) in Kultur und zur Aufzählung der Gesamt-IgM- und IgG-ASCs über einen ELISpot-Assay beschrieben.

Die Isolation, Differenzierung und Quantifizierung von Human-Antikörper-sezernierenden B-Zellen aus Blut: ELISpot als Functional Readout der humoralen Immunität

Dieses Protokoll beschreibt die reproduzierbare Erzeugung und Phänotypisierung von humanen regulatorischen T - Zellen induziert (iTregs) von naiven CD4 + T - Zellen in vitro. Verschiedene Protokolle für FOXP3 Induktions ermöglichen die Untersuchung spezifischer iTreg Phänotypen mit jeweiligen Protokollen erhalten.

In vitro Differenzierung von humanen CD4 + FOXP3 + Induced regulatorischer T - Zellen (iTregs) von Naïve CD4 + T - Zellen unter Verwendung eines TGF-β-enthaltende Protokoll

Eine einfache roten Blutkörperchen die Lyse Verfahren zum Aufbau B-LCLs mit hoher Immortalisierung Effizienz entwickelt, eine kleine Menge von Blut benötigt und die Zeit von der Initiierung der Gefrierkonservierung zu speichern.

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Wir beschreiben eine Methode zur Herstellung von menschlichen Antikörpern, die spezifisch für ein Antigen des Interesses, ausgehend von seltenen B-Zellen im menschlichen Blut zirkulieren. Generation dieser natürliche Antikörper ist rasch und effizient, und die Antikörper erhalten können sehr ähnliche Antigene unterscheiden.

Generation von diskriminierendem menschlichen monoklonalen Antikörpern aus seltenen Antigen-spezifische B-Zellen im Blut zirkulierenden

Dieser Artikel beschreibt eine neuartige Methode zur Erzeugung von Tumorantigen-spezifischen induzierten pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten thymischen Auswanderern (iTE) durch ein dreidimensionales (3D) thymische Kultursystem. iTE sind eine homogene Teilmenge von T-Zellen, die eng mit naiven T-Zellen verwandt sind und die Fähigkeit zur Proliferation, Gedächtnisbildung und Tumorunterdrückung haben.

Ein dreidimensionales thymisches Kultursystem zur Generierung von murine induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Tumor-Antigen-spezifischen thymischen Auswanderern

Die BSelex-Methode zur Identifizierung und Wiederherstellung einzelner antigenspezifischer Antikörper aus menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen kombiniert Durchflusszytometrie mit einzelliger PCR und Klonen.

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