Name: Erkennung von Protease-Aktivität durch fluoreszierende Peptid Zymography (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-20T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Erfahren Sie die fluoreszierende Peptid-Zymographie zur verbesserten Protease-Erkennung in biochemischen und biomedizinischen Anwendungen. Diese modulare Methode ermöglicht die gezielte Anpassung von Peptidsequenzen für Biomaterialforschung.

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Gefördert von der Ohio State University College of Engineering, Biomedical Engineering-Abteilung und dem Comprehensive Cancer Center - Arthur G. James Cancer Hospital und Richard J. Solove Research Institute.

1. Vorbereitung der Lösung von Gelschicht
<ol><li>Bereiten Sie eine 10 %-Polyacrylamid-Gel-Lösung gemäß Tabelle 1zu lösen. Fügen Sie die Tetramethylethylenediamine (TEMED) und Ammonium Bleichen (APS) unmittelbar vor dem Gießen des Gels wie ihre Ergänzung die Polymerisationsreaktion initiiert.</li>
	<li>Füllen Sie eine leere 1,5 mm Mini-Gel Kassette auf halbem Weg (5 mL) mit 10 % ige Lösung von Gel-Lösung.</li>
	<li>Fügen Sie eine dünne Schicht von Isopropanol (~ 500 µL) an die Spitze der Polyacrylamid-Gel zu produzieren eine Ebene Gel und Luftblasen zu verhindern. Verwenden Sie die übrig gebliebenen Polyacrylamid-Lösung, um die Polymerisationsreaktion verfolgen. Wenn das Polyacrylamid in das Rohr vollständig erstarrt ist, ist die Reaktion abgeschlossen (~ 40 min).</li>
</ol>2. Vorbereitung des Moleküls Azido-PEG3-Maleimide-Linker
<ol><li>Während die erste Lösung von Gelschicht dadurch ist, rufen Sie das Azido-PEG3-Maleimide-Kit von-20 ° C Speicher ab und lassen Sie die Komponenten auf Zimmertemperatur kommen. Es gibt zwei Komponenten in jedem Kit. 1 Durchstechflasche enthält eine Maleimide-NHS Ester, eine Weiß-gelbliche grau solide. 2 Fläschchen enthält Azido-PEG3-Amin, ein leicht gelbes Öl. Hinweis: Die Autoren schlagen mit dem 25 mg-Azido-PEG3-Maleimide-Kit, da es nur für kurze Zeit (1-2 Stunden) gespeichert und kann bei-20 ° C nach vorbereitet, bevor es beginnt zu erniedrigen. 25 mg reicht um 10 Peptid Gele zu produzieren. Verwenden Sie Gele innerhalb von 3 Wochen der Vorbereitung.</li>
	<li>Lösen sich die Komponenten der Ampulle 2 in der vom Hersteller empfohlenen Menge Dimethyl Sulfoxid (DMSO) und Vortex für 30 s, um die Flüssigkeiten zu gewährleisten haben gut gemischt worden.</li>
	<li>Übertragen Sie den Inhalt des Fläschchens 1 in einem sauberen, trockenen 100 mL Rundboden Kolben mit Stir Bar. Hinweis: Spülen Sie die Flasche mit Aceton und lassen Sie vollständig trocknen, vor dem Gebrauch zu verhindern, dass Feuchtigkeit stören die Reaktion.</li>
	<li>Legen Sie sofort einen Gummistopfen Septum mit einer Membran, die mit einer Spritze in den Mund des Kolbens punktiert werden kann. Arbeit schnell zu verhindern, dass Feuchtigkeit in die Flasche.</li>
	<li>Legen Sie zwei 18 Gauge Nadeln in die Membrane Spritze und verbinden zu einem inerten Gastank (z.B. Argon-Gas). Lassen Sie dem Edelgas füllen die Flasche für 3 min. Mix Komponenten Fläschchen 1 und 2 unter Schutzgas, unerwünschte Reaktionsprodukte zu verhindern. Achtung: Die zweite Spritzennadel ist ein Ventil, wodurch der atmosphärischen Luft in die Flasche, aus der Flasche zu fließen, wie es mit Inertgas füllt enthalten. Vergessen Sie nicht, eine Nadel Vent gehören!</li>
	<li>Das Inertgas ausschalten und von der Nadel lösen. Mit einer Spritze, den vollständigen Inhalt des Fläschchens 2 Spritzen Sie in den Kolben.</li>
	<li>Entfernen Sie Nadeln und Spritzen zu und lassen Sie die Komponenten für 30 min bei Raumtemperatur unter Rühren mischen.</li>
	<li>Entfernen Sie den Gummistopfen Septum und übertragen Sie den Inhalt auf eine saubere 5 mL Zentrifugenröhrchen. Die Azido-PEG3-Maleimide-Lösung muss innerhalb von 1 Stunde bei Raumtemperatur verwendet werden.</li>
</ol>3. Vorbereitung des Peptids Gelschicht zu lösen
<ol><li>Sobald die erste Lösung von Gelschicht polymerisiert ist, Gießen Sie die Isopropanol-Schicht. Spülen Sie die Spitze des Gels durch Pipettieren 1 mL deionisiertes Wasser oben auf das Gel und dann abgießen.</li>
	<li>Rufen Sie die Thiol-funktionalisiert fluoreszierende Peptid von-80 ° C Speicher ab und lassen Sie es bei Raumtemperatur auftauen. Hinweis: Die Thiol-funktionalisiert Peptid kann vorbereitet werden, wie oben beschrieben11,12. Kommerziell verfügbare Peptide können auch verwendet werden, sondern erfordern der Zusatz eines terminal Cystein-Rückstands zu ermöglichen, die Maleimide-Thiol klicken Reaktion. Lösen Sie das Peptid Lager Konzentration von 10 mM zu, und bewahren sie bei-80 ° C im kleinen (30 uL) Aliquote, wiederholte Frost-Tau-Wechseln zu begrenzen.</li>
	<li>Bereiten Sie eine 10 % Lösung von Gel-Lösung mit dem Azido-PEG3-Maleimide-Linker-Molekül und das fluoreszierende Peptid gemäß Tabelle 1. Fügen Sie die TEMED und APS unmittelbar vor dem Gießen des Gels wie ihre Ergänzung die Polymerisationsreaktion initiiert.</li>
	<li>Füllen Sie die Hälfte des verbleibenden Teils der Gel-Kassette (3 mL) mit das Peptid Gel Lösung zu lösen. Hinweis: Ein mehrschichtige Lösung von Gel Ansatz reduziert die Menge von Peptid und Linker für jedes Gel erforderlich. Die Größe der die Peptid-Lösung von Gelschicht kann angepasst werden einen größeren Bereich von Molekulargewichten nach Bedarf.</li>
	<li>Pipette eine dünne Schicht von Isopropanol (~ 500 µL) an die Spitze der Polyacrylamid-Gel zu produzieren eine Ebene Gel und Luftblasen zu verhindern. Verwenden Sie die übrig gebliebenen Polyacrylamid-Lösung, um die Polymerisationsreaktion verfolgen. Wenn das Polyacrylamid in das Rohr vollständig erstarrt ist, ist die Reaktion abgeschlossen (~ 40 min). Hinweis: Das fluoreszierende Peptid ist lichtempfindlich. Halten Sie die Gele, abgedeckt mit Alufolie, Immunofluoreszenz während Gel Vorbereitung, Elektrophorese, Wasch- und Entwicklung zu verhindern.</li>
	<li>Gießen Sie die Isopropanol-Schicht und spülen Sie die Spitze des Peptids Gel mit entionisiertem Wasser wie in Schritt 3.1 zu lösen.</li>
	<li>Wenn mit der Gele sofort, fahren Sie mit Schritt 4, ansonsten Tauchen Sie die vorbereiteten Gele in 100 mL 1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) bei 4 ° C in einer Plastikbox, die Gele Austrocknen verhindert wird. Wickeln Sie die Box in Alufolie, Immunofluoreszenz zu verhindern. Gele können mit PBS-Puffer für bis zu 3 Wochen vor dem Gebrauch gespeichert werden.</li>
</ol>4. Vorbereitung des stapelnden Gels
<ol><li>Bereiten Sie eine 5 % Stapeln Gel Lösung gemäß Tabelle 1. Fügen Sie die TEMED und APS unmittelbar vor dem Gießen des Gels wie ihre Ergänzung die Polymerisationsreaktion initiiert.</li>
	<li>Füllen Sie den verbleibenden leeren Teil des Gel-Kassette (~ 2 mL) mit Stapeln Gel-Lösung.</li>
	<li>Legen Sie schnell einen 1,5 mm Gel Kamm in Stapeln Gelschicht, sicherstellen, dass keine Luftblasen unter dem Brunnen gefangen bleiben. Verwenden Sie die übrig gebliebenen Polyacrylamid-Lösung, um die Polymerisationsreaktion verfolgen. Wenn das Polyacrylamid in das Rohr vollständig erstarrt ist, ist die Reaktion abgeschlossen (~ 10 min).</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig den Kamm und das Klebeband von der Rückseite der Kassette Gel.</li>
</ol>5. Vorbereitung des biologischen Proben für Elektrophorese
<ol><li>Bereiten Sie konditionierten Zelle Medien, Zelle Lysates, Gewebe Homogenates und MMP-Standards, wie an anderer Stelle unter nicht-reduzierenden Bedingungen2beschrieben. Erwärmen Sie Proben nicht.</li>
	<li>Zum Beispiel bereiten Sie konditioniert Zelle Medien wie folgt:<ol>
<li>Platte 40.000 Zellen/cm2 Zellen in einem 6-Well-Platte in Kulturmedien 10 % fetalen bovine Serum (FBS). Inkubieren Sie Zellen in eine feuchte Kammer (5 % CO2 bei 37 ° C) für 24 Stunden und es ermöglichen Sie ihnen, Zusammenfluss von 70-80 % zu erreichen. Hinweis: Wenn die Zellen nicht die gewünschte Konfluenz nach 24 Stunden erreicht haben, können sie für weitere 24 Stunden in 10 % FBS Nährmedien wachsen.</li>
		<li>Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS und 2 mL Serum-freie Kultur Medien. Inkubieren Sie die Zellen in eine feuchte Kammer (5 % CO2 bei 37 ° C) für weitere 24 Stunden.</li>
		<li>Mit einer serologischen Pipette, sammeln Sie die konditionierten Medien aus jedem Brunnen. Zentrifugieren Sie die Medien bei 1200 u/min für 3 Minuten, jede Zelle Ablagerungen zu entfernen. Den Überstand und mit einem 15 mL, 10 kDa Molekulargewicht cutoff zentrifugale Filtereinheit. Zentrifugieren Sie die Filtereinheiten an 4.000 x g für 15 min in eine schwingende Eimer Rotor oder 5.000 x g für 15 min in einem festen Winkel Rotor. Hinweis: Diese Schritt ist optional, jedoch kann die Intensität der proteolytischen Bands die Peptid-Zymography-Gele erhöhen.</li>
		<li>Übertragen Sie das konzentrierte Filtrat auf eine frische 1,5 mL Zentrifugenröhrchen. Aliquoten und Store Proben bei-80 ° C für bis zu drei Gefrier-Tau-Zyklen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Protein-Inhalt mit einem standard Protein Quantifizierung Assay zu quantifizieren (z. B. BCA, Bradford-Test, etc.).</li>
</ol>6. Elektrophorese von biologischen Proben in Peptid Zymography Gele
<ol><li>Proben in konventionellen Zymography Probenpuffer auflösen (62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8, 25 % Glycerin, 4 % SDS, 0,01 % Bromophenol blue). Für Zellen und Gewebe Proben, ~ 30 µg des Gesamt-Protein pro Bohrloch wird empfohlen, und 50-100 ng Protein für MMP-Standards.</li>
	<li>Fügen Sie 400 mL 1 x Tris-Glycin SDS laufen Puffer auf den Gel-Apparat. Laden Sie bis zu 35 µL Probe pro Bohrloch. Laufen Sie die Proben bei 120 V bei 4 ° C, 1,5 Stunden oder bis die Molekulargewicht Normen zeigen, dass die Proteasen von Interesse in das Peptid Gelschicht sind (hat eine sichtbare orange Farbe) zu lösen. Hinweis: Die meisten MMPs und deren Varianten liegen im Bereich von 35-100 kDa. Wenn die Molekulargewicht Standards zeigen, dass diese Gewichte in das Peptid Gelschicht zu lösen sind, kann die Elektrophorese gestoppt werden. Das gleiche Prinzip kann auf andere Klassen von Proteasen mit bekannten Molekulargewichten angewendet werden. Wenn es ein Interesse bei der Aufdeckung von mehreren Proteasen über einen größeren Bereich der Molekulargewichte, reduzieren Sie die Größe der Lösung von Gelschicht und vergrößern Sie die Peptid-Lösung von Gelschicht.</li>
	<li>Entfernen Sie nach Elektrophorese die Gele aus Kunststoff Kassette und waschen Sie Gele dreimal für 10 min bei Raumtemperatur unter schonenden rühren in Renaturierungen Puffer mit 2,5 % Triton x-100, 1 µM ZnCl2und 5 mM CaCl2 in 50 mM Tris-HCl, pH 7,5.</li>
	<li>Transfer Gele zu entwickelnden Pufferlösung mit 1 % Triton x-100, 1 µM ZnCl2 und 5 mM CaCl2 in 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 für 15 min. ersetzen mit der Entwicklung von frischen Lösung zu puffern und inkubieren Sie Gele bei 37 ° C unter sanften Agitation für 24 Stunden , dafür sorgen die Gele sind vollständig in die Lösung eingetaucht.</li>
</ol>7. Darstellung der Peptid-Zymography Gele
<ol><li>Nach 24 Stunden gel Bild Gele mit einer fluoreszierenden Scanner/Imager entsprechende Anregung und Emission Filter verwenden. Beispielsweise die Peptid-Gele in die repräsentativen Ergebnisse gezeigt werden konjugiert mit Fluorescein und wurden abgebildet mit einem Filter Anregung von 488 nm und eine Emission Filter von 521 nm. Mit den entsprechenden Filtern für Ihre Fluorophor wird der Nachweis der proteolytischen Aktivität maximieren. Hinweis: Bilder können auch mit einer Gel-Imager, ausgestattet mit einem UV-Transilluminator, oft verwendet für die Darstellung der DNA-Gele mit Interkalation Bromid befleckt getroffen werden. Die Gele mit dem UV-Transilluminator Bild (365 nm) Einstellung und eine Emission Filter von 590 nm.</li>
	<li>Führen Sie densitometrischen Auswertung der Band Intensitäten mit ImageJ wie an anderer Stelle13beschrieben.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Aktuelle Zymographic Techniken beruhen auf dem Einbau von nativen Substraten in Polyacrylamid-Gele für den Nachweis der Proteolyse. Während diese Techniken weit verbreiteten Einsatz angesammelt haben, werden sie noch in der Anzahl der Proteasen beschränkt, die Sie erkennen können. Hier wurde ein Protokoll beschrieben, in welche Leuchtstofflampen, Protease-abbaubar Peptide in der Polyacrylamid-Gel zu lösen integriert sind. Kovalente Kupplung mit ermöglicht ein Linker Azido-PEG3-Maleimide-Molekül die Trennung und Nachweis ...

Gel Zymography ist ein biologischer Verfahren zur Messung der proteolytischen Aktivität in biologischen Proben, z. B. Körperflüssigkeiten oder Zelle Nährmedien1,2,3. Die Proben werden durch ihre Molmassen mit Elektrophorese durch ein Polyacrylamid-Gel eingebettet mit einem abbaubarem Substrat getrennt. Gemeinsamen abbaubaren Substrate enthalten Gelatine, Kasein, Kollagen und Elastin, die verwendet wurden, um die Aktivität von Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) -1,-2-3, -7,-8,-9 und-11, neben einer Vielzahl von Cathepsins1,2 messen , 4 , 5 , 6 , 7 , 8. nach Elektrophorese, die Enzyme sind renaturierte und durfte um das Protein innerhalb des Gels zu degradieren. In traditionellen Gel Zymography das Gel wird mit einem Protein-Farbstoff, z. B. Coomassie Blau gefärbt und Protease-Aktivität wird als Verlust des Signals, d. h. weiße Bänder (Abbau von Protein) auf einem dunkelblauen Hintergrund erkannt.
Hier beschreiben wir ein Protokoll für eine alternative Methode der Gel Zymography, in dem das abbaubare Substrat kurzer Fluorogenic Peptid kovalent in das Polyacrylamid-Gel (Abbildung 1) integriert ist. Die Substitution von synthetische Peptide als abbaubare Substrate ermöglicht eine Erfassung von einer breiteren Palette von Proteasen im Vergleich zu traditionellen Gel Zymography mit native Proteine9. Kovalente Bindung des Peptids Fluorogenic verhindert Peptid Verbreitung und Migration während der Gelelektrophorese mit bisherigen Methoden9,10beobachtet. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung eines Substrates Fluorogenic direkte Nachweis der Protease-Aktivität ohne zusätzliche Färbung und de-Färbung Schritte. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist die Erkennung von Protease-Aktivität in biologischen Proben über die kovalente Einbeziehung Fluorogenic Peptide in Zymogram Gele.

<table><tbody><tr><td>1,5 mm leere Gelkassetten</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NC2015</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mm, 10 Well leere Gelkassettenkämme</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NC3510</td><td></td></tr><tr><td>1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-010-049</td><td></td></tr><tr><td>20% SDS-Lösung</td><td>Ambion</td><td>AM9820</td><td></td></tr><tr><td>3x Zymographie-Probenpuffer</td><td>Bio-Rad</td><td>1610764</td><td></td></tr><tr><td>40% (w/v) Acrylamid/Bis (19:1)</td><td>Ambion</td><td>AM9022</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Gewebekulturplatten</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>087721B</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-2 Zentrifugalfiltereinheit (10 kDa MWCO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>UFC201024</td><td></td></tr><tr><td>Ammouniumpersulfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Azido-PEG3-Maleimid-Kit</td><td>Klickchemie Werkzeuge</td><td>AZ107</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP510100</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A416P</td><td></td></tr><tr><td>Micro BCA Protein Assay Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>N N N' N'-Tetramethylethylendiamin (TEMED)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac Basic Netzteil</td><td>Bio-Rad</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Dual Color Standard</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0374</td><td></td></tr><tr><td>PrecisionGlide Injektionsnadeln</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826</td><td></td></tr><tr><td>Rundkolben (100 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-873-144</td><td></td></tr><tr><td>Septum Gummistopfen</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-872-546</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Slip-Tip-Spritze (1 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-823-434</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Trizma-Hydrochlroid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon 9410 Molecular Imager</td><td>GE Amersham</td><td>8149-30-9410</td><td></td></tr><tr><td>Zinkchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>208086</tr></tbody></table>

erkennung von protease-aktivität durch fluoreszierende peptid zymography

Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography

Der Zweck dieser Methode ist es, die proteolytische Aktivität von komplexen biologischen Proben zu messen. Die Proben werden durch Molekulargewicht mit Elektrophorese durch eine Lösung von Gel eingebettet mit einem abbaubarem Substrat getrennt. Diese Methode unterscheidet sich von traditionellen Gel Zymography, dass eine abgeschreckt Fluorogenic Peptid in der Lösung von Gel statt voller Länge Proteine, wie Gelatine oder Kasein kovalent eingearbeitet ist. Verwendung der Fluorogenic Peptide ermöglicht direkte Nachweis der proteolytischen Aktivität ohne zusätzliche Färbung Schritte. Enzyme in den biologischen Proben cleave das abgeschreckt Fluorogenic Peptid, was zu einem Anstieg in Fluoreszenz. Das Fluoreszenzsignal in die Gele ist dann mit einem standard Leuchtstofflampen Gel Scanner abgebildet und quantifiziert mit Densitometrie. Die Verwendung von Peptiden als abbaubare Substrat erweitert erheblich die möglichen Proteasen nachweisbar mit Zymographic Techniken.

Mit der beschriebenen Methode hier, zwei fluoreszierende Protease-abbaubar Peptide flossen in Polyacrylamid-Gele: GGPQG↓IWGQK(PEG)2C (abgekürzt als QGIW in den Text und Zahlen) und GPLA↓CpMeOBzlWARK(PEG)2 C (abgekürzt als LACW im gesamten Text und Zahlen). ↓ gibt die Site der Spaltung. QGIW ist ein Kollagen-ich abgeleitet Sequenz entwickelt, um zelluläre Collagenases14erkennen. LACW ist eine Sequenz, die für die Erkennung von MMP-14...

Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll für eine modifizierte Zymographic-Technik in der fluoreszierenden Peptide als abbaubare Substrat anstelle von native Proteine verwendet werden. Elektrophorese von biologischen Proben in fluoreszierenden Peptid-Zymogramme ermöglicht die Detektion eines breiteren Spektrums von Proteasen als frühere Zymographic Techniken.

Erkennung von Protease-Aktivität durch fluoreszierende Peptid Zymography

The purpose of this method is to measure the proteolytic activity of complex biological samples. The samples are separated by molecular weight using ...

Aktuelle zymographische Techniken erkennen eine begrenzte Anzahl von Proteasen. Die fluoreszierende Peptidzymographie verwendet fluoreszierende Peptide als abbaubares Substrat, das die Messung einer größeren Anzahl von Proteasen ermöglicht. Der Hauptvorteil dieser Methode ist ihr modulares Design.Die Sequenz des fluoreszierenden Peptids bestimmt, welche Proteasen detektiert werden und das fluoreszierende Peptid kann leicht mit einem Peptid einer anderen Sequenz getauscht werden, eine Fähigkeit, andere Proteasen zu erkennen. Diese Technik kann dazu beitragen, die Entwicklung der Verwendung von Peptiden als abbaubare Verknüpfungsmittel in technischen Biomaterialien, wie sie für die Arzneimittelabgabe oder Gewebetechnik verwendet werden, zu unterstützen. Die Einbeziehung dieses Peptids in diese Technik kann gewebesekrete Proteasen identifizieren, die für den Abbau des Biomaterials verantwortlich sind.Die Demonstration dieser Technik ist wichtig, um den mehrschichtigen Ansatz zu visualisieren, der im Vergleich zu anderen Zymographietechniken einzigartig ist. Diese Technik zu demonstrieren, wird Ameya Deshmukh, eine Studentin aus meinem Labor sein. Bereiten Sie zunächst eine 10%Polyacrylamid-Auflösungsgellösung vor, wie in Tabelle 1 des Textprotokolls beschrieben.Unmittelbar vor dem Gießen des Gels fügen Sie die TEMED und APS. Dann füllen und leeren 1,5 Millimeter Mini-Gel-Kassette auf halbem Weg mit der auflösenden Gel-Lösung. Fügen Sie eine dünne Schicht Isopropanol an der Oberseite des Polyacrylamid-Gels hinzu, um ein ebenein Gel zu erzeugen und Blasen zu verhindern.Verwenden Sie die übrig gebliebene Polyacrylamidlösung, um den Fortschritt der Polymerisationsreaktion zu verfolgen. Wenn das Polyacrylamid im Rohr vollständig verfestigt ist, ist die Reaktion vollständig. Während die erste auflösende Gelschicht polymerisiert ist, rufen Sie das Azido-PEG3-Maleimid-Kit bei 20 Grad Celsius aus der Lagerung ab und lassen Sie die Komponenten Raumtemperatur erreichen.Lösen Sie dann die Komponenten von Durchstechflasche zwei im vom Hersteller empfohlenen DMSO-Volumen auf. Und Wirbel für 30 Sekunden, um sicherzustellen, dass die Flüssigkeiten gut gemischt sind. Übertragen Sie den Inhalt der Durchstechflasche eins in einen sauberen, trockenen 100 Millileter runden Bodenkolben, der eine Rührstange enthält.Legen Sie sofort einen Gummiseptumstopfen mit einem Zwerchfell ein, das mit einer Spritze in den Mund des Kolbens einstechen kann. Als nächstes legen Sie zwei 18-Spur-Spritzennadeln in das Zwerchfell ein. Schließen Sie eine der Spritzennadeln an einen inerten Gastank an und lassen Sie das Gas den runden Bodenkolben für drei Minuten füllen.Schalten Sie dann das Inertgas ab und lösen Sie es von der Nadel. Mit einer Spritze den vollen Inhalt der Durchstechflasche zwei in den Kolben injizieren. Entfernen Sie sowohl die Nadeln als auch die Spritze.Lassen Sie die Komponenten 30 Minuten bei Raumtemperatur unter Rühren mischen. Danach den Gummiseptumstopfen entfernen und den Inhalt in ein sauberes Fünf-Milliliter-Zentrifugenrohr geben. Sobald die erste auflösende Gelschicht polymerisiert ist, gießen Sie die Isopropanolschicht ab.Pipet einen Milliliter entionisiertes Wasser auf das Gel und gieße dann das Wasser ab, um das Gel abzuspülen. Holen Sie das Thiol funktionalisierte fluoreszierende Peptid aus der Lagerung bei 80 Grad Celsius. Lassen Sie es bei Raumtemperatur auftauen.Bereiten Sie eine 10%lösende Gellösung vor, die das Azido-PEG3-Maleimid-Linkermolekül und das fluoreszierende Peptid enthält, wie in Tabelle 1 des Textprotokolls beschrieben. Unmittelbar vor dem Gießen des Gels fügen Sie die TMED und APS. Als nächstes füllen Sie die Hälfte des restlichen Teils der Gelkassette mit der Peptid-Auflösungslösung.Fügen Sie eine dünne Schicht Isopropanol an der Oberseite des Polyacrylamid-Gels hinzu, um ein ebenein Gel zu erzeugen und Blasen zu verhindern. Verwenden Sie die übrig gebliebene Polyacrylamidlösung, um den Fortschritt der Polymerisationsreaktion zu verfolgen. Nachdem die Reaktion abgeschlossen ist, gießen Sie die Isopropanolschicht ab.Pipet einen Milliliter entionisiertes Wasser auf das Gel und gieße dann das Wasser ab, um das Gel abzuspülen. Wenn Sie die Gele nicht sofort verwenden, lagern Sie sie, indem Sie sie in eine Plastikbox eintauchen, die mit 100 Millilitern 1x PBS bei vier Grad Celsius gefüllt ist. Wickeln Sie die Box in Aluminiumfolie, um Photobleichungen zu verhindern.Bereiten Sie zunächst eine 5%stacking Gel-Lösung vor, wie in Tabelle 1 des Textprotokolls beschrieben. Unmittelbar vor dem Gießen des Gels fügen Sie die TMED und APS. Füllen Sie den restlichen leeren Teil der Gelkassette mit der Stapelgellösung.Legen Sie schnell einen 1,5-Millimeter-Gelkamm in die Stapelgelschicht ein, um sicherzustellen, dass keine Blasen unter den Brunnen gefangen bleiben. Verwenden Sie die übrig gebliebene Polyacrylamidlösung, um den Fortschritt der Polymerisationsreaktion zu verfolgen. Wenn die Reaktion abgeschlossen ist, entfernen Sie vorsichtig den Kamm und das Band von der Rückseite der Gelkassette.Lösen Sie zunächst Proben im herkömmlichen Zymographie-Probenpuffer auf. 400 Milliliter os 1X Tris Glycen SDS Laufpuffer zum Gelgerät geben. Laden Sie bis zu 35 Mikroliter Probe pro Bohrgut.Führen Sie die Proben bei 120 Volt bei vier Grad Celsius anderthalb Stunden oder bis die Molekulargewichtsstandards darauf hinweisen, dass sich die Proteasen von Interesse innerhalb der Peptid-auflösenden Gelschicht befinden. Danach entfernen Sie die Gele aus der Kunststoffkassette. Waschen Sie die Gele dreimal im Renaturierungspuffer bei Raumtemperatur unter sanfter Rührung.Mit jeder Wäsche, dauert 10 Minuten. Übertragen Sie Gele für 15 Minuten in eine sich entwickelnde Pufferlösung. Dann ersetzen Sie die Lösung durch frisch entwickelnden Puffer und brüten bei 37 Grad Celsius unter sanfter Agitation für 24 Stunden.Verwenden Sie danach einen fluoreszierenden Gelscanner-Imager mit den entsprechenden Anregungs- und Emissionsfiltern, um die Gele abzubilden. In dieser Studie zu fluoreszierender Protease werden abbaubare Peptide in Polyacrylamidgele eingearbeitet. QGIW ist eine Kollagen-Sequenz, die entwickelt wurde, um zelluläre Kollagenzuerkennen zu erkennen, während LACW eine Sequenz ist, die für die Detektion von MMP-14 und MMP-11 optimiert wurde.Fluoreszierende Bildgebung zeigt zahlreiche Bänder innerhalb der LACW Peptid Gele, Während nur ein einziges Band in den QGIW Gelen gesehen wird. Im Vergleich zur Gelatinezymographie sind LACW-Gele in der Lage, mehr proteolytische Bänder zu erkennen, was die Fähigkeit der Peptidzymographie demonstriert, eine breitere Palette von Proteasen in biologischen Proben zu erkennen als herkömmliche Methoden mit nativen Substraten. Peptidzymographie-Zellen werden dann im Entwicklungspuffer inkubiert, der entweder GM6001, einen Breitspektrum-MMP-Hemmer, oder E64, einen allgemeinen Kathepsin-Inhibitor, enthält.Die Behandlung der LACW Peptidgele mit GM6001 verringert die Intensität der Bänder. Während die Behandlung mit E64 keine erkennbare Wirkung hat. Die Behandlung der QGIQ Peptidgele mit GM6001 führt zu einer vollständigen Ablation der bisher gesehenen Bänder.Während E64 keine Wirkung hat. Die Gelatinezymographie wird mit gereinigtem, aktiviertem MMP-9 durchgeführt, um die Empfindlichkeit der Peptidzymographie mit dem aktuellen Goldstandard zu vergleichen. LACW-Gele sind in der Lage, kleinste Konzentrationen von MMP-9 zu erkennen.Proteasen erfordern spezifische Bedingungen, um sich neu zu veranlassen und aktiviert zu werden. Bereiten Sie die Pufferlösungen sorgfältig vor, um sicherzustellen, dass die Zusammensetzung und PH korrekt sind. Diese Methode kann durch bestehende Techniken zur Überprüfung der Identität und zur weiteren Analyse der gemessenen Proteasen ergänzt werden.Dazu gehören Western Blotting, Echtzeit-PCR und Massenspektrometrie. Seien Sie vorsichtig beim Umgang mit Polyacrylamid. Unpolymerisierte Lösung gilt als starkes Neurotoxin und geeignete persönliche Schutzausrüstung sollte immer bei der Handhabung getragen werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

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Krebsforschung

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Dieses Video demonstriert die Zymographie-Gelelektrophorese-Technik zur Beurteilung der Aktivität von Matrix-Metalloproteinasen (MMPs), die in Zellkulturüberständen vorhanden sind. Die aktiven MMPs bauen das MMP-spezifische Substrat ab, das in ein Polyacrylamidgel eingebettet ist, das nach der Färbung als klare Banden auf einem dunklen gefärbten Hintergrund erscheint.

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Ein fluorogener Peptidspaltungsassay zum Screening der proteolytischen Aktivität von Proteasen

Wir beschreiben einen einfachen, quantitativen kolorimetrischen Assay, der speziell die proteolytische Aktivität von Granzym B (GzmB) bei Mensch, Maus oder Ratte misst. Dieses Protokoll kann leicht angepasst werden, um die Proteaseaktivität anderer granulierter Serinproteasen durch die Hydrolyse anderer synthetischer Peptidsubstrate mit einer geeigneten Erkennungssequenz zu bestimmen.

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Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Bestimmung der Orientierung und Topologie von integralen Membranproteinen in lebenden Zellen. Dieses einfache Protokoll beruht auf der selektiven Proteaseempfindlichkeit der Chimären zwischen dem Protein von Interesse und GFP.

Bestimmen Membrane Protein Topologie Mit Fluorescence Protease Schutz (FPP)

Hier präsentieren wir Ihnen Auszüge mit MALDI-TOF-Massenspektrometrie ein Protokoll Protease Spezifität im Rohöl Maus Gewebe zu bestimmen.

Die Bestimmung der Protease Spezifität im Maus-Gewebe extrahiert durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie: PH um Spezifität Änderungen führen zu manipulieren

Hier präsentieren wir Ihnen die Einzelheiten des Verfahrens einer neu entwickelten Protease Assays Plattform nutzen N-terminalen Hexahistidine/Maltose-bindendes Protein und fluoreszierende Protein fusioniert rekombinante Substrate an der Oberfläche der Nickel-Nitrilotriacetic befestigt saure magnetische Agarose Korne. Eine anschließende Gelanalyse der Assay-Proben durch Natrium-Dodecyl-Sulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese getrennt wird ebenfalls dargestellt.

Einsatz von rekombinanten Fusionsproteinen in eine fluoreszierende Protease-Assay-Plattform und ihre In-Gel-Renaturierung

Wir präsentieren einen Fluorogenic Peptid Spaltung-Assay, der eine schnelle Screening der proteolytischen Aktivität der Proteasen auf Peptide repräsentieren die Spaltstelle virale Fusion Peptide ermöglicht. Diese Methode kann auch auf andere Aminosäure-Motiv in eine Proteinsequenz verwendet werden, für die Protease-Aktivität zu testen.

Ein Fluorogenic Peptid Spaltung Assay zum Bildschirm für die proteolytische Aktivität: Anwendungen für Coronavirus spike Protein-Aktivierung

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Einstufige Extraktion und zymographische Analyse von bakteriellen Gelatinasen

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Erkennung von Protease-Aktivität durch fluoreszierende Peptid Zymography

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