Ein Ansaugsystem für gruppierte Spaltöffnungen durch Zucker Lösung eintauchen Behandlung in Arabidopsis Thaliana Sämlinge
15. Februar 2019
Das Ziel dieses Protokolls ist zu zeigen, wie induzieren gruppierte Spaltöffnungen in Keimblätter von Arabidopsis Thaliana Sämlinge durch Immersion Behandlung mit einer zuckerhaltigen Lösung für mittlere und intrazelluläre Strukturen wie Chloroplasten beobachten und Mikrotubuli in der gruppierten Schließzellen mit konfokale laser-Mikroskopie.
Diese Methode hat eine Schlüsselfrage der Pflanzenentwicklungsbiologie beantwortet. Das heißt, welche Bedeutung hat die räumliche Verteilung von Stomata? Unser Induktionssystem für geclusterte Stomata mit Saccharoselösung ist ziemlich einfach und direkt auf transgene oder mutierte Linien von Arabidopsis thaliana anwendbar.
Zunächst 1,1 Gramm Murashige-Skoog-Mittelsalze und 15 Gramm Saccharose zu einem Becher geben. 490 Milliliter destilliertes Wasser in den Becher geben und mit der Rührstange vermischen. Verwenden Sie Kaliumhydroxid, um den pH-Wert auf 5,8 einzustellen.
Anschließend die Lösung mit 500 Milliliter n. Wasser verdünnen und die verdünnte Lösung in eine mittlere Flasche geben. Danach autoklavieren Sie die Lösung. Bereiten Sie die Sterilisationslösung entsprechend dem Textprotokoll vor.
Dann, unter aseptischen Bedingungen arbeiten, legen Sie etwa 50 transgene A.thaliana Samen mit einem fluoreszierenden Marker in eine 1,5 Milliliter-Röhre. Als nächstes fügen Sie einen Milliliter 70% Ethanol in die Röhre und mischen, indem Sie das Rohr fünfmal invertieren. Nachdem Sie die Samen auf den Boden der Röhre sinken lassen, entfernen Sie das Ethanol vorsichtig mit einer Mikropipette.
Fügen Sie den Samen einen Milliliter Sterilisationslösung hinzu und kehren Sie die Röhre fünfmal um, um sie zu mischen. Entfernen Sie die Sterilisationslösung vorsichtig mit einer Mikropipette aus den Samen. Dann fügen Sie einen Milliliter steriles Wasser hinzu.
1,5 Milliliter der Murashige-Skoog-Lösung zu jedem Brunnen einer 24-Well-Platte hinzufügen. Dann fügen Sie zwei sterilisierte Samen zu jedem Brunnen. Mit zwei Schichten Parafilm, band den Deckel auf die Platte.
Als nächstes übertragen Sie die Platte in eine Wachstumskammer, um sie für 14 Tage zu inkubieren. Zuerst übertragen Sie 30 Mikroliter Murashige-Skoog-Lösung von der 24 Well-Platte in die Mitte einer Glasrutsche. Entfernen Sie das Cotyledon mit einer Sezschere von einem 14 Tage alten Sämling.
Schwimmen Sie das Kotyledon mit der Beobachtungsseite nach oben auf den Tropfen der Murashige-Skoog-Lösung. Bereiten Sie das Kotyledon gemäß den zuvor im Journal of Visualized Experiments beschriebenen Methoden vor. Stellen Sie die Probe auf die Stufe eines konfokalen Lasermikroskops.
Verwenden Sie schließlich die helle Feldbeleuchtung, um gruppierte Schutzzellen für die Beobachtung auszuwählen. In diesem Protokoll wurde stomatale Clusterbildung bei A.thaliana Sämlingen induziert. Die in der Saccharose angebauten Wachzellen mit größeren Chloroplasten als Schutzzellen, die unter saccharosefreien Bedingungen angebaut werden.
Die Vergrößerung der Chloroplasten wurde mit einem Chloroplasten-Stroma-Marker und Chlorophyll-Autofluoreszenzen bestätigt, was darauf hindeutet, dass die Saccharosebehandlung zu einer Stärkekornansammlung in den Chloroplasten führte. Zusätzlich ergab die konfokale Beobachtung der GFP-Wanne-6, dass die kortikalen Mikrotubuli in den saccharosebehandelten Zellen radial ausgerichtet waren, genau wie in den saccharosefreien Schutzzellen. Eigentlich haben wir diese Methode zufällig entdeckt.
Nach dem Fund untersuchten wir die Umweltreaktion von clustered stomata. Wir glauben, dass unser System helfen könnte, die Bedeutung der Stomata-Verteilung zu untersuchen.
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Übersicht
Dieses Protokoll zeigt, wie man gruppierte Stomata in den Kotyledonen von Arabidopsis thaliana Sämlingen mithilfe eines zuckerhaltigen Mediums induziert. Es beschreibt auch die Beobachtung von intrazellulären Strukturen wie Chloroplasten und Mikrotubuli in Schließzellen mittels konfokaler Lasermikroskopie.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Pflanzen-Entwicklungsbiologie
- Stomata-Funktion
- Mikroskopie-Techniken
Hintergrund
- Stomata spielen eine entscheidende Rolle beim Gasaustausch und der Wasserregulierung in Pflanzen.
- Die räumliche Verteilung von Stomata beeinflusst die Pflanzenphysiologie und -entwicklung.
- Arabidopsis thaliana ist ein Modellorganismus für die Untersuchung der Pflanzenbiologie.
- Konfokale Lasermikroskopie ermöglicht die detaillierte Beobachtung von Zellstrukturen.
Zweck der Studie
- Um gruppierte Stomata in Arabidopsis thaliana Sämlingen zu induzieren.
- Um die intrazellulären Strukturen in Schließzellen zu untersuchen.
- Um eine Methode bereitzustellen, die für transgene oder mutierte Linien anwendbar ist.
Verwendete Methoden
- Zubereitung eines zuckerhaltigen Mediums unter Verwendung von Murashige-Skoog-Salzen und Saccharose.
- Einstellung des pH-Werts auf 5,8 mit Kaliumhydroxid.
- Eintauchen der Sämlinge in das vorbereitete Medium.
- Beobachtung von Schließzellen mittels konfokaler Lasermikroskopie.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Induktion von gruppierten Stomata in den Kotyledonen.
- Visualisierung von Chloroplasten und Mikrotubuli in Schließzellen.
- Nachgewiesene Anwendbarkeit für verschiedene Arabidopsis-Linien.
- Gewinnung von Erkenntnissen über die räumliche Verteilung von Stomata.
Schlussfolgerungen
- Die Methode ist effektiv für die Untersuchung der Stomata-Entwicklung.
- Sie verbessert das Verständnis der Stomata-Funktion in Pflanzen.
- Zukünftige Forschung kann auf diesem Protokoll aufbauen, um weitere Erkenntnisse zu gewinnen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Understanding stomatal spatial distribution informs predictive models of plant water-use efficiency and photosynthetic capacity, which are relevant to crop yield optimization and stress resilience in agricultural biotechnology. This induction system enables mechanistic interrogation of guard cell biology without genetic modification, supporting target validation in plant signaling pathways. The method provides a scalable, reproducible platform for evaluating compound effects on stomatal patterning and function in discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of spatial patterning mechanisms in stomatal development to validate targets in plant signaling pathways.
- Operational Value: Provides a non-genetic, chemically inducible system applicable to transgenic or mutant lines for target de-risking.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable phenotypic outputs (clustered stomata, chloroplast enlargement) for high-content screening of bioactive compounds.
- Operational Value: Uses standardized sucrose-MS medium and confocal readouts to ensure assay reproducibility across laboratories.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links stomatal clustering to intracellular biomarkers (chloroplast size, microtubule orientation) for mechanistic de-risking in plant stress response studies.
- Operational Value: Supports continuity from gene/target discovery to phenotypic validation in disease-relevant systems.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where phenotypic screening and target validation precede lead identification, particularly in agrochemical and plant trait development pipelines.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on stomatal spacing significance through inducible clustering without genetic alteration.
- Screening: Enables assay-ready systems with quantifiable guard cell phenotypes for compound library screening.
- Analytics: Provides quantitative confocal readouts (chloroplast size, microtubule orientation) to compare treatment effects.
- Translational Research: Connects intracellular observations to stomatal function for predictive modeling in stress response.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable induction platform applicable across mutant and transgenic Arabidopsis lines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation via phenotypic de-risking of stomatal patterning mechanisms.
- Operational Value: Standardization through defined sucrose-MS medium and pH adjustment ensures reproducibility.
- Strategic Value: Enables early go/no-go decisions on compounds affecting stomatal development, reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of targets based on phenotypic validation in clustered stomata systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant tissue culture, sterile technique, and confocal microscopy.
- Dependent on access to autoclave, growth chambers, and laser scanning microscopes.
- Necessitates standardization of seed sterilization and sucrose-medium preparation across teams.
- Adaptation to other species or tissue types may require optimization of sucrose concentration and exposure duration.
- Limited to observable phenotypes in cotyledons; scalability to whole-plant assays may need additional validation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:31
Preparation of 3% Sucrose Containing 1/2 Murashige-Skoog Medium Solution
1:12
Induction of Clustered Stomata by Sucrose-containing Medium Solution Immersion Treatment
2:30
Microscopic Observation of Clustered Stomata
3:15
Stomata Clustering Induced in A. thaliana Seedlings
4:06
Conclusion
