Name: Analyse der Proteinfaltung, Transport und Abbau in lebenden Zellen durch radioaktive Puls Chase (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Erfahren Sie die radioaktive Puls-Chase-Methode mit 35S-markiertem Methionin und Cystein zur Analyse von Proteinfaltung, Transport und Abbau in lebenden Zellen. Dieses empfindliche Verfahren ermöglicht quantitative Untersuchungen der Proteindynamik.

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Die Autoren danken allen Mitgliedern des Labors Braakman, vorbei an und präsentieren, für ihre fruchtbaren Diskussionen und helfen bei der Entwicklung der Methoden in diesem Artikel vorgestellt. Dieses Projekt wird finanziell von der Europäischen Forschungsrat unter der Europäischen Union siebten Rahmenprogramms (RP7/2007-2013) N ° 235649 und der Niederlande Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO) unter der ECHO-Programm N ° 711.012.008.

Alle radioaktiven Reagenzien und Verfahren wurden in Übereinstimmung mit örtlichen Universität Utrecht Strahlung Regeln und Vorschriften gehandhabt.
1. Puls Chase
<ol><li>
Puls-Chase für adhärente Zellen Hinweis: Die hier angegebenen Volumen basiert auf 60 mm Zelle Kultur Gerichte. Für 35 mm oder 100 mm Schalen die Bände mit 1/2 oder 2, jeweils multipliziert. Dieses Protokoll verwendet eine Taktzeit von 0, 15, 30, 60, 120 und 240 min. 10 min und Chase Zeiten. Diese können je nach den spezifischen Proteinen untersucht (unten besprochen) variiert werden.<ol>
<li>Samen adhärente Zellen (z. B.HEK 293, HeLa, CHO) in sechs 60 mm Zelle Kultur Gerichte, so dass sie Subconfluent (80-90 %) am Tag der Jagd Puls. Verwenden Sie mindestens ein Gericht pro Zeitpunkt und/oder Zustand.</li>
		<li>Bei Bedarf transfizieren Sie Zellen mit handelsüblichen Transfektion Reagenzien gemäß den Anweisungen des Herstellers; oder Viral transduzieren8 Zellen 1 Tag vor der Puls-Jagd mit dem entsprechenden Konstrukt für Ausdruck experimentieren.</li>
		<li>Den Abwasch mit 2 mL Waschpuffer (Hank es ausgeglichen Salzlösung [HBSS]), fügen Sie 2 mL Hunger Medium (normale Kulturmedium fehlt Methionin und Cystein und fötalen Rinderserum [FBS], wie minimale wesentliche Medium [MEM] ohne Methionin und Cystein aber mit 10 mM HEPES, pH 7,4) und legen Sie die Gerichte in einem 37 ° C befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2 für 15 Minuten.</li>
		<li>Übertragen Sie die Gerichte zu den Racks in eine vorgewärmte 37 ° C Wasserbad, so dass sie in Kontakt mit Wasser aber nicht schwimmen. Einen Timer gestartet wird.</li>
		<li>Bei 40 s, Aspirieren das Hunger-Medium, 600 µL Puls-Lösung (Hunger Medien + 55 µCi/35-Millimeter-Teller zu kennzeichnen, finden Sie im vorhergehenden Schritt 1.1.1 Hinweis) erarbeiten in der Pipette, und fügen Sie es sanft in die Mitte des Tellers genau 1 min. Wiederholen Sie diesen Schritt in 1 min Abständen für t He übrigen Gerichte. Starten Sie mit der längsten Chase Probe bei Ihrem Experiment Zeit sparen. Hinweis: Beim Umgang mit radioaktiven Stoffen ist es wichtig, entsprechende Vorsichtsmaßnahmen und lokale Regeln und Vorschriften, versehentliche Belichtung und/oder Kontamination zu verhindern.</li>
		<li>Fügen Sie bei genau 11 min und für alle folgenden Gerichte, außer für die 0 min Chase Probe 2 mL Chase Medium direkt auf den Teller hinzu, aspirieren Sie es, und wieder 2 mL Chase Medium. Wiederholen Sie diesen Schritt in 1 min Abständen für die restlichen Gerichte. Übertragen Sie alle Gerichte auf einem 37 ° C Inkubator.</li>
		<li>Bei genau 16 min, fügen Sie 2 mL Chase Medium (normale Kulturmedium + 10 mM HEPES [pH 7.4], 5 mM Cystein und Methionin 5 mM) direkt an die 0 min Probenschale auf das Puls-Medium zu stoppen, Kennzeichnung; dann aspirieren Sie sofort, übertragen Sie das Gericht auf eine gekühlte Aluminiumplatte, und 2 mL eiskaltes Stop Puffer (HBSS + 20 mM N- Ethylmaleimide [NEM]). Hinweis: Dies ist die 0 min Chase Probe. In diesem Beispiel gehen Sie direkt zu Schritt 1.1.9.</li>
		<li>Jedes Gericht Chase ins Wasserbad 2 min vor jedem Chase (z. B.24 min für eine 15 min Chase) zu übertragen und, damals genaue Chase (z.B.26 min. für ein 15 min Chase) Aspirieren der Chase-Medien (oder zu einem Microcentrifuge Schlauch zu übertragen, wenn folgende Pr Otein Sekretion) und das Gericht auf eine gekühlte Aluminium-Platte übertragen. 2 mL eiskaltes Stop Puffer hinzugeben.</li>
		<li>Inkubieren Sie alle Gerichte auf dem Eis in der Stop-Puffer für ≥5 min; dann aspirieren Sie die Stop-Lösung und waschen Sie es mit 2 mL eiskalte Hand. Aspirieren Sie die Wäsche und lösen Sie Gerichte mit 600 µL Lyse Puffer (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung [PBS] + nondenaturing Waschmittel [siehe Tabelle der Materialien] Proteaseinhibitoren + 20 mM NEM). Verwenden Sie Zelle Schaber, um sicherzustellen, dass die Gerichte quantitativ lysiert werden.</li>
		<li>Übertragen Sie auf einer 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch und Zentrifuge für 10 min bei 15.000-20.000 X g und 4 ° C zu die Kernen Pellets die lysate.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Puls-Jagd nach Aussetzung Zellen Hinweis: Um effiziente Kennzeichnung zu gewährleisten, sollte die Zellen in einer Konzentration von 3 x 106 , 5 x 106 Zellen/mL gepulst werden und sollen Chase Mengen 4 x das Puls-Volumen. Im folgenden Beispiel, gepulst wir 5 x 106 Zellen in einem Volumen von 1 mL für 10 min, weichen jagen fünf Mal Punkte (0, 15, 30, 60 und 120 min.) von 1 mL, 1 x 106 Zellen pro Zeitpunkt. Alle Lösungen sind die gleichen wie in Abschnitt 1.1.<ol>
<li>Kultur der Aussetzung Zellen (z. B.3 t 3, Jurkat) gemäß einer zuvor veröffentlichten Protokoll9 so dass es eine ausreichende Anzahl von Zellen zum Zeitpunkt des Experiments, mindestens 1 x 106 Zellen pro Zeiteinheit zeigen und/oder Zustand.</li>
		<li>Bei Bedarf transfizieren Sie Zellen mit handelsüblichen Transfektion Reagenzien gemäß den Anweisungen des Herstellers, oder Viral transduzieren Sie8 Zellen 1 Tag vor der Puls-Jagd mit dem entsprechenden Konstrukt für Ausdruck experimentieren.</li>
		<li>Pellet-5 x 106 Zellen pro Zustand in ein 50 mL-Tube für 5 min bei 250 X g bei Raumtemperatur, waschen Sie sie 1 X mit 5 mL der Hunger Medien, pellet-sie wieder und Aufschwemmen ihnen in 1 mL der Hunger Medien.</li>
		<li>Übertragen Sie die Zellen auf 37 ° C Wasserbad und inkubieren sie für 10-25 min. rühren den Röhren alle 10-15 min zu verhindern, dass die Zellen unten absetzen.</li>
		<li>Der Timer gestartet wird. Bei genau 1 min 275 µCi (55 µCi/1 x 106 Zellen) unverdünnt Beschriftung der Röhrchen mit Zellen direkt hinzufügen und wirbeln um zu mischen. Hinweis: Beim Umgang mit radioaktiven Stoffen ist es wichtig, entsprechende Vorsichtsmaßnahmen und lokale Regeln und Vorschriften, versehentliche Belichtung und/oder Kontamination zu verhindern.</li>
		<li>Vor genau 11 min Halt Kennzeichnung durch Zugabe von 4 mL Chase Medien. Mischen Sie die Probe und sofort übertragen Sie 1 mL auf eine 15 mL-Tube auf Eis, mit 9 mL eiskalte Hand. Hinweis: Dies ist die 0 min Chase Probe.</li>
		<li>Wiederholen Sie diese Schritte für jeden aufeinanderfolgenden Zeitpunkt. Sobald alle Zeitpunkte gesammelt sind, pellet-Zellen für 5 min bei 250 X g bei 4 ° C. Aspirieren Sie das Medium (oder an eine neue 15 mL Tube übertragen Sie, wenn Protein Sekretion nach). Waschen Sie die Zellen mit 5 mL Stopp-Lösung und pellet-Zellen für 5 min bei 250 X g bei 4 ° C.</li>
		<li>Aspirieren Sie die Stop-Lösung, komplett lösen Sie die Zellen mit 300 µL Puffer eiskalte lyse und inkubieren sie für 20 min auf Eis, um eine komplette Lyse zu gewährleisten. Übertragen Sie auf einer 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch und Zentrifuge für 10 min bei 15.000-20.000 X g bei 4 ° C zu die Kernen Pellets die lysate.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) Immunopräzipitation
<ol><li>Antikörper zu kombinieren (siehe die Diskussion) und 50 µL Immunopräzipitation Perlen (z. B. Protein A-Sepharose) (10 % Suspension [V/V] Lyse Puffer + 0,25 % Rinderserumalbumin [BSA]) in einem Microcentrifuge Rohr und inkubieren sie bei 4 ° C für ca. 30 min in einen Shaker geben.</li>
	<li>Pellet-die Perlen für 1 min bei 12.000 X g bei Raumtemperatur und den Überstand abgesaugt. Die Antikörper-Korn-Mischung 200 µL lysate hinzu und brüten bei 4 ° C in einem Shaker für 1 h oder Kopf-über-Kopf verlangt die Immunopräzipitation > 1 h.</li>
	<li>Pellet-die Perlen für 1 min bei 12.000 X g bei Raumtemperatur. Den Überstand abgesaugt und 1 mL Immunopräzipitation Waschpuffer. Legen Sie die Probe in einem Shaker für 5 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Pellet-Perlen wie unter Punkt 2.3 beschrieben, und wiederholen Sie die Wäsche 1 X. Dann Aspirieren überstand und Aufschwemmen der Perlen in 20 µL TE-Puffer, pH 6,8 (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA). Wirbel der Probe.</li>
	<li>Fügen Sie 20 µL 2 x Probenpuffer ohne das Reduktionsmittel, Wirbel, erhitzen Sie es wieder für 5 min bei 95 ° C und Wirbel. Hinweis: Wenn nur die Proben vorbereiten, 2 µL von 500 mM DTT sollte an dieser Stelle hinzugefügt werden. Dann fahren Sie mit Schritt 2.7.</li>
	<li>Pellet-Perlen wie unter Punkt 2.3 beschrieben. 19 µL des Überstands nonreduced zu einem frischen Microcentrifuge Schlauch mit 1 µL von 500 mM DVB-t übertragen, Zentrifugieren der Probe und Wirbel es schon wieder für 5 min bei 95 ° C erhitzt.</li>
	<li>Spin-down der Probe für 1 min bei 12.000 X g; Dies ist die reduzierte Stichprobe. Die reduzierte und die nonreduced Probe 1,1 µL 1 m NEM hinzufügen und auf Zimmertemperatur abkühlen. Wirbel und Spin-down der Proben.</li>
</ol>(3) SDS-PAGE
<ol><li>Bestimmen Sie zuerst die entsprechende SDS-PAGE Lösung von Gel Prozentsatz für das Protein von Interesse. Zum Beispiel HIV-1 gp120, wenn Deglycosylated, läuft bei ~ 60 kDa und wird in einem 7,5 % Gel analysiert.</li>
	<li>Bereiten Sie die Lösung von Gel-Mischung ohne TEMED gemäß den Anweisungen des Herstellers (x % Acrylamid, 375 mM Tris-HCl [pH 8,8,] 0,1 % SDS [w/V], und 0,05 % Ammonium bleichen [APS] [w/V]) und unter Vakuum für entgasen > 15 min. Während die Gel-Mischung Entgasung ist, gründlich reinigen Sie die Gel-Glasplatten mit 70 % Ethanol und fusselfreien Gewebe und legen Sie sie in einer Gießvorrichtung.</li>
	<li>Die Lösung von Gel-Mischung (auf eine Endkonzentration von 0,005 % [V/V]) TEMED hinzu, mischen, und pipette zwischen Glasplatten, ~1.5 cm Freiraum für das Stapeln Gel. Sorgfältig überlagern Sie das Gel mit entionisiertem H2O oder Isopropanol und lassen Sie es zu polymerisieren.</li>
	<li>Sobald die Lösung von Gel polymerisiert hat, bereiten die Stapeln Gel-Mischung (4 % Acrylamid, 125 mM Tris-HCl [pH 6,8], 0,1 % SDS [w/V], und 0,025 % APS [w/V]).</li>
	<li>Spülen Sie oben auf die Lösung von Gel mit entionisiertem H2O, und entfernen Sie dann alle Wasser. Hinweis: Verwenden Sie Filterpapier, um die letzten Tropfen zu entfernen.</li>
	<li>Die Stapelung Gel-Mischung (0,005 % [V/V]) TEMED hinzu, mischen Sie, und überlagern Sie das Auflösen von Gel mit Stapeln Gel und legen Sie einen 15-Well-Kamm. Sobald das stapelnde Gel polymerisiert hat, überträgt es auf eine laufende Kammer und füllen Sie die oberen und unteren Kammern mit Puffer ausgeführt (25 mM Tris-HCl, 192 mM Glycin [pH 8,3] und 0,1 % SDS [w/V]).</li>
	<li>10 µL der Probe pro Bahn in einem 15-spurige Minigel zu laden. Vermeiden Sie das Laden der Proben in der ersten und der letzten Spur auf das Gel und laden Sie die nonreducing Probenpuffer in allen leeren Spuren zu verhindern, dass das Lächeln der Bands. Führen Sie die Gele bei konstanten 25 mA/Gel, bis Farbstoff vorne an der Unterseite des Gels ist.</li>
	<li>Entfernen Sie die Gele aus Glasplatten, färben die Gele mit Protein-Färbelösung (10 % Essigsäure und 30 % Methanol in H2O + 0,25 % brilliant blue R250 [w/V]) für 5 min. unter Rühren, und dann für 30 min mit entfärben (Färbung Lösung destain Lösung ohne brilliant blue R250).</li>
	<li>Ordnen Sie die Gele verdeckt auf einem Kunststoff wickeln und dann legen Sie 0,4 mm Chromatographiepapier auf ihnen. Legen Sie die Gel Sandwich Chromatographie Papier-Seite nach unten auf ein Gel Trockner. Trocknen Sie nach den Anweisungen des Herstellers die Gele für 2 h bei 80 ° C.</li>
	<li>Die getrockneten Gele auf einer Kassette übertragen und mit Autoradiographie Film oder Phosphor-Bildschirm überlagern. Wenn Autoradiographie Film verwenden, muss dieser Schritt in einem dunklen Raum durchgeführt werden.</li>
</ol>

<ol><li>Ellgaard, L., McCaul, N., Chatsisvili, A., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-+and+Post-Translational+Protein+Folding+in+the+ER%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Co- and Post-Translational Protein Folding in the ER.</a> Traffic. 17 (6), 615-638 (2016).</li>
<li>Pisoni, G. B., Molinari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Five+Questions+%28with+their+Answers%29+on+ER-Associated+Degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Five Questions (with their Answers) on ER-Associated Degradation.</a> Traffic. 17 (4), 341-350 (2016).</li>
<li>Lamriben, L., Graham, J. B., Adams, B. M., Hebert, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Glycan-based+ER+Molecular+Chaperone+and+Protein+Quality+Control+System%3A+The+Calnexin+Binding+Cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">N-Glycan-based ER Molecular Chaperone and Protein Quality Control System: The Calnexin Binding Cycle.</a> Traffic. 17 (4), 308-326 (2016).</li>
<li>Snapp, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+topology+around+the+cleavage+site+regulate+post-translational+cleavage+of+the+HIV-1+gp160+signal+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Structure and topology around the cleavage site regulate post-translational cleavage of the HIV-1 gp160 signal peptide.</a> Elife. 6, 26067(2017).</li>
<li>Braakman, I., Hoover-Litty, H., Wagner, K. R., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+influenza+hemagglutinin+in+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Folding of influenza hemagglutinin in the endoplasmic reticulum.</a> Journal of Cell Biology. 114 (3), 401-411 (1991).</li>
<li>Jansens, A., van Duijn, E., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+nonvectorial+folding+in+a+newly+synthesized+multidomain+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Coordinated nonvectorial folding in a newly synthesized multidomain protein.</a> Science. 298 (5602), 2401-2403 (2002).</li>
<li>Land, A., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+glycoprotein+in+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Folding of the human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein in the endoplasmic reticulum.</a> Biochimie. 83 (8), 783-790 (2001).</li>
<li>Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+Transduction+of+Helper+T+Cells+as+a+Genetic+Approach+to+Study+Mechanisms+Controlling+their+Differentiation+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54698(2016).</li>
<li>Das, A. T., Land, A., Braakman, I., Klaver, B., Berkhout, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+evolves+into+a+nonsyncytium-inducing+virus+upon+prolonged+culture+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">HIV-1 evolves into a nonsyncytium-inducing virus upon prolonged culture in vitro.</a> Virology. 263 (1), 55-69 (1999).</li>
<li>Chen, W., Helenius, J., Braakman, I., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cotranslational+folding+and+calnexin+binding+during+glycoprotein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cotranslational folding and calnexin binding during glycoprotein synthesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (14), 6229-6233 (1995).</li>
<li>Daniels, R., Kurowski, B., Johnson, A. E., Hebert, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-linked+glycans+direct+the+cotranslational+folding+pathway+of+influenza+hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">N-linked glycans direct the cotranslational folding pathway of influenza hemagglutinin.</a> Molecular Cell. 11 (1), 79-90 (2003).</li>
<li>Ferreira, L. R., Norris, K., Smith, T., Hebert, C., Sauk, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+Hsp47%2C+Grp78%2C+and+Grp94+with+procollagen+supports+the+successive+or+coupled+action+of+molecular+chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Association of Hsp47, Grp78, and Grp94 with procollagen supports the successive or coupled action of molecular chaperones.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 56 (4), 518-526 (1994).</li>
<li>Hoelen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+primary+folding+defect+and+rescue+of+DeltaF508+CFTR+emerge+during+translation+of+the+mutant+domain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The primary folding defect and rescue of DeltaF508 CFTR emerge during translation of the mutant domain.</a> PLoS One. 5 (11), 15458(2010).</li>
<li>Kleizen, B., van Vlijmen, T., de Jonge, H. R., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+CFTR+is+predominantly+cotranslational%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Folding of CFTR is predominantly cotranslational.</a> Molecular Cell. 20 (2), 277-287 (2005).</li>
<li>Hagiwara, M., Ling, J., Koenig, P. A., Ploegh, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranscriptional+Regulation+of+Glycoprotein+Quality+Control+in+the+Endoplasmic+Reticulum+Is+Controlled+by+the+E2+Ub-Conjugating+Enzyme+UBC6e%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Posttranscriptional Regulation of Glycoprotein Quality Control in the Endoplasmic Reticulum Is Controlled by the E2 Ub-Conjugating Enzyme UBC6e.</a> Molecular Cell. 63 (5), 753-767 (2016).</li>
<li>Copeland, C. S., Doms, R. W., Bolzau, E. M., Webster, R. G., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+influenza+hemagglutinin+trimers+and+its+role+in+intracellular+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Assembly of influenza hemagglutinin trimers and its role in intracellular transport.</a> Journal of Cell Biology. 103 (4), 1179-1191 (1986).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Puls-Jagd-Methoden wurden wesentlich für die Entwicklung von wissenschaftlichen Verständnis der Proteinfaltung in intakten Zellen. Während wir versucht haben, ein Verfahren zu schaffen, die so allgemein wie möglich ist, hat dieser Ansatz das Potenzial für nahezu grenzenlose Variationen, verschiedene Prozesse zu studieren, die während der Faltung, den Transport und das Leben der Proteine in der Zelle auftreten.
Bei der Durchführung einer Puls-Verfolgungsjagd mit adhärenten Zellen in Gerichte un...

Die Faltung auch relativ einfache Proteine umfasst viele verschiedene klappbaren Enzyme, molekulare Chaperone und kovalente Modifikationen1. Eine vollständige Wiederherstellung der diese Prozesse in Vitro ist praktisch unmöglich, angesichts die Vielzahl von verschiedenen Komponenten beteiligt. Es ist daher höchst wünschenswert, Proteinfaltung in Vivo, in lebenden Zellen zu studieren. Radioaktiven Puls-Jagd Techniken beweisen ein leistungsfähiges Werkzeug für das Studium der Synthese, Falten, Transport und Abbau von Proteinen in ihrer natürlichen Umgebung.
Die metabolische Kennzeichnung von Proteinen während eines kurzen Impuls mit 35S-Label Methionin/Cystein, gefolgt von einer Verfolgungsjagd in Ermangelung eines radioaktiven Labels, können spezielle Tracking einer Bevölkerung der neu synthetisierten Proteine im weiteren zellulären Milieu. Dann können Zielproteine isoliert über Immunopräzipitation und analysiert per SDS-PAGE oder andere Techniken. Für viele Proteine zeichnet sich ihre Reise durch die Zelle durch Änderungen, die auf SDS-PAGE Gel sichtbar sind. Beispielsweise wird der Transport des glykosylierten Proteinen aus dem endoplasmatischen Retikulum (ER) an der Golgi-Komplex oft durch Modifikationen von Glykoproteinen N verbunden oder die Zugabe von O-linked Glykane2,3begleitet. Diese Änderungen verursachen hohe Zuwächse in die scheinbare molekulare Masse, die durch Mobilität Veränderungen im SDS-PAGE zu sehen ist. Reifung kann auch gekennzeichnet werden, durch proteolytische Spaltungen, wie Signal-Peptid Spaltung oder die Entfernung von Pro-Peptide, was zu Veränderungen in der scheinbaren molekulare Masse, die SDS-PAGE Gel4leicht verfolgt werden können. Radioaktivität hat erhebliche Vorteile gegenüber vergleichbaren Techniken wie Cycloheximide jagt, wo wird Roman Proteinsynthese vorgebeugt, da längere Behandlungen giftig für Zellen sind und schließen nicht die Mehrheit der älteren, stationäre Proteine aus, die Analyse, wie einige Proteine haben Halbwertszeiten von Tagen. Der Vergleich der Proteine unter beide nonreducing und reduzierenden Bedingungen erlaubt die Analyse von Disulfid Bindung Bildung, ein wichtiger Schritt bei der Faltung von vielen Sekretorische Proteine4,5,6, 7.
Hier beschreiben wir eine allgemeine Methode für die Analyse der Proteinfaltung und Transport in intakten Zellen mit einem radioaktiven Puls-Chase-Ansatz. Während wir haben die Methode als bereitstellen soll detailliert wie möglich, das Protokoll hat ein fast grenzenloses Potential für Anpassungsfähigkeit und ermöglicht die Optimierung des Lesers bestimmte Proteine zu studieren.
Zwei alternative Puls-Jagd-Protokolle, eine für adhärente Zellen (Schritt 1.1 des Protokolls, die hier vorgestellten) und eine für Aussetzung Zellen (Schritt 1.2 des hier vorgestellten Protokolls) stehen zur Verfügung. Die Bedingungen zur Verfügung gestellt, hier sind ausreichend, um ein Protein mit Medium-High Ausdruck Niveaus ausgedrückt zu visualisieren. Wenn der Leser mit schlecht ausgedrückten Proteine oder verschiedenen Behandlungsgruppen Bedingungen, z. B. mehrere Immunperoxidase funktioniert ist es notwendig zu Gericht vergrößern oder Handy-Nummer entsprechend.
Für Aufhängung Puls Chase sind Chase Proben, die zu jedem Zeitpunkt alle aus einem einzigen Rohr Zellen getroffen. Die Wäsche Schritte nach dem Puls der Zeit entfallen; Stattdessen wird weiter Aufnahme von 35S durch Verdünnung mit einem hohen Überschuss der unbeschrifteten Methionin und Cystein verhindert.
Die vorgestellten Protokolle verwenden radioaktiven 35S-Label Cystein und Methionin-Proteinfaltung Zellprozesse folgen. Alle Operationen mit radioaktiven Reagenzien sollten durchgeführt werden, über geeignete Schutzmaßnahmen zur Minimierung des Bedieners und der Umwelt gegenüber radioaktiver Strahlung ausgesetzt und in einem bestimmten Labor durchgeführt werden. Als der Puls-Chase Kennzeichnung Technik ist relativ ineffizient bei kurzen Impulszeiten (< 15 min), weniger als 1 % des Grundbetrags von Radioaktivität in die neu synthetisierte Proteine aufgenommen wird. Nach der Anreicherung von Ziel-Protein über Immunopräzipitation enthält die Probe für SDS-PAGE weniger als 0,05 % des Grundbetrags der Radioaktivität.
Obwohl die 35S Methionin und Cystein Kennzeichnung Mischung wird stabilisiert, wird einige Zersetzung, nachgiebig flüchtige radioaktive Verbindungen auftreten. Um der Forscher und das Gerät zu schützen, sollten einige Vorkehrungen getroffen werden. Der Forscher sollte immer die lokalen Strahlung Sicherheitsregeln einhalten und kann eine Kohle Pflege Maske, neben einem Laborkittel und (Doppel-) Handschuhe tragen. Lager Fläschchen mit 35S Methionin und Cystein sollte immer unter einem Abzug oder unter einem lokalen Aspiration Punkt geöffnet werden. Bekannte Labor Kontamination Spots sind Zentrifugen, Pipetten, Wasserbäder, Inkubatoren und Schüttele-Apparat. Die Kontamination von diesen Bereichen wird reduziert, indem Pipettenspitzen mit einem Aktivkohlefilter, Positive Dichtung Mikrozentrifugenröhrchen (siehe Tabelle der Materialien), Aquarium Holzkohle Schwämme in Wasser Bäder, Holzkohle Filterpapiere geklebt in der Puls-Chase-Gerichte, Holzkohle Wache in die Aspiration und die Platzierung der Speisen mit Holzkohle Körner in Inkubatoren und Lagerbehälter.

<table><tbody><tr><td>1,5 mL Safeseal Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Sarstedt</td><td>72.706.400</td><td></td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>Sigma</td><td>A6283</td><td>Eisessig</td></tr><tr><td>BAS Lagerung Phosphorsieb 20x25 cm</td><td>GE Life Sciences</td><td>28956475</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol Blue</td><td>Sigma</td><td>B8026</td><td></td></tr><tr><td>Carestream Biomax MR-Filme</td> in Molekularbiologiequalität <td>Kodak</td><td>Z350370-50EA</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturmedien</td><td>Verschiedenes</td><td>N/A</td><td>Normale Zellkulturmedien für bestimmte verwendete Zelllinien</td></tr><tr><td>Zellkulturmedien, kein Methionin/Cystein</td><td>Verschiedenes</td><td>N/A</td><td>Gleiche Medienformulierung wie normale Nährmedien, z. B. DMEM/MEM/RPMI, ohne Methionin und Cystein</td></tr><tr><td>Aktivkohlefilterpapier</td><td>Whatman</td><td>1872047</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenspitzen mit Aktivkohlefiltrierung</td><td>Molekular bioproducts</td><td>5069B</td><td></td></tr><tr><td>Aktivkohle-Vakuumschutz</td><td>Whatman</td><td>67221001</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R250</td><td>Sigma</td><td>112.553</td><td>für Elektrophorese</td></tr><tr><td>Cystein</td><td>Sigma</td><td>C7352</td><td>Molekularbiologische Qualität, 500 mM Lagerbestand herstellen, lagern bei -20&nbsp;</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>10197777001</td><td>Molekularbiologische Qualität</td></tr><tr><td>EasyTag Express35S Proteinmarkierungsmischung</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG772014MC</td><td>Andere Größen von Markierungschargen sind je nach Verwendung erhältlich</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E1644</td> Geltrocknungsgeräte <td>in molekularbiologischer Qualität</td></tr><tr><td></td><td>Verschiedene</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td>Molekularbiologie</td></tr><tr><td>Güteklasse 3 Chromatographie-Papier</td><td>GE Life Sciences</td><td>3003-917</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>24020117</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes Zarte Arbeitstücher</td><td>VWR</td><td>21905-026</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>M3671</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma Sigma</td><td>MX0490</td> in molekularbiologischer Qualität<td></td></tr><tr><td>Methionin</td><td>Sigma</td><td>M5308</td><td>Molekularbiologie Qualität, 250 mM Lagerbestand, Lagerung bei -20</td></tr><tr><td>Minigel Gieß- / Laufausrüstung</td><td>Verschiedene</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td></td><td>NaCl</td><td>Sigma S7653</td><td>Molekularbiologische Qualität</td></tr><tr><td>N-Ethylmaleimid</td><td>Sigma</td><td>E3876</td><td>Molekularbiologische Qualität, Herstellung von 1 Mio. Lager in 100% Ethanol, Lagerung bei -20</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>P5368</td><td></td></tr><tr><td>Protein-A Sepharose-Fastflow-Kügelchen</td> in molekularbiologischer Qualität <td>GE Health-Care</td><td>17-5280-04</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat (SDS)</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td>Molekularbiologisches</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>Molekularbiologisches</td></tr><tr><td>Trizma-Base (Tris)</td><td>Sigma</td><td>T6066</td><td>Molekularbiologisches</td></tr><tr><td>Typhoon IP Biomolekularer Imager</td><td>Amersham</td><td>29187194</td><td></td></tr><tr><td>Reagenzglasgestell ohne Draht 20 mm für Wasserbad</td><td>Nalgene</td><td>5970-0320PK</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse der proteinfaltung, transport und abbau in lebenden zellen durch radioaktive puls chase

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Kennzeichnung von radioaktiven Puls-Jagd ist ein leistungsfähiges Werkzeug für das Studium der Konformationsänderungen Reifung, den Transport zu ihrer zellulären Platzes und der Verschlechterung der Zielproteine in lebenden Zellen. Mit kurzen (Puls) enzymatische Zeiten (< 30 min) und streng kontrolliert Chase Zeiten, es ist möglich, beschriften Sie nur einen Bruchteil des gesamten Protein Pools und folgen seinen Falten. In Kombination mit nonreducing/Reduzierung der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und Immunopräzipitation mit (Konformation) Antikörper kann Falten Prozesse im Detail untersucht werden. Dieses System wurde verwendet, um die Faltung von Proteinen mit eine große Variation in Eigenschaften wie lösliche Proteine, Einzel- und Multi-Pass transmembranen Proteine, stark N und O-glycosylierten Proteine und Proteine mit und ohne umfangreiche Disulfid analysieren die Verklebung. Puls-Jagd-Methoden sind die Basis für kinetische Untersuchungen in eine Reihe von zusätzlichen Funktionen, einschließlich Co- und posttranslationale Modifikationen, Oligomerisierung und Polymerisation, im wesentlichen erlaubt die Analyse eines Proteins von der Geburt bis zum Tod. Puls-Chase-Studien zur Proteinfaltung ergänzen sich mit anderen biochemischen und biophysikalischen Methoden für ein Studium Proteine in Vitro durch höhere zeitliche Auflösung und physiologische Informationen. Die Methoden, wie in diesem Dokument beschrieben sind leicht angepasst, zur Untersuchung der Faltung von fast jedem Protein, das in Säugetieren oder Insekt-Zelle Systeme ausgedrückt werden kann.

Die Faltung und Sekretion von HIV-1 gp120 aus einem anhaftenden Puls Chase ist in Abbildung 2dargestellt. Das nonreducing Gel (Zellen NR in der Abbildung) zeigt die oxidative Faltung des gp120. Sofort nach dem Puls Kennzeichnung von 5 min (0 min. Chase) gp120 erscheint als eine diffuse Band höher in das Gel, und Fortschreiten der Jagd, die Band wandert nach unten das Gel durch noch mehr verbreitet Faltung Zwischenprodukte (IT), bis es reichert sich in den eng...

Hier beschreiben wir ein Protokoll für eine allgemeine Puls-Jagd-Methode, die die kinetische Analyse der Faltung, Transport und Abbau von Proteinen in lebenden Zellen einzuhaltenden erlaubt.

Analyse der Proteinfaltung, Transport und Abbau in lebenden Zellen durch radioaktive Puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Die radioaktive Pulsjagd mit 35 S-markiertem Methionin und Cystein ist nach wie vor die einzige biochemische Methode, um die Proteinbiosynthese mit der Zeit in lebenden Zellen zu untersuchen. Die Proteinbiosynthese umfasst sowohl Die Übersetzung, Faltung und Montage als auch den Handel und Abbau. Die Kombination der radioaktiven Pulsjagd mit der Analyse von Co- und Post-Translation-Proteinmodifikationen, wie Disulfidbindungsbildung und Acetylierung, liefert einen empfindlichen und quantitativen Assay, um den Glauben des Proteins mit der Zeit zu untersuchen.Für dieses Verfahren ist eine gute Fokussierung und experimentelle Handhabung erforderlich. Eine gute Vorbereitung ist entscheidend, wie Puffer, Ihr radioaktiver Arbeitsbereich und ein klarer Zeitplan. Dieses Video bietet eine klare Schulteransicht des radioaktiven Pulsjagdprotokolls.Demonstriert wird das Verfahren von Hui Ying Yeoh, einem pHd-Kandidaten aus unserem Labor. Um mit diesem Verfahren zu beginnen, werden Seed-Transfekten- und Kulturzellen, wie im Textprotokoll beschrieben. Vor der Pulsjagd, inspizieren Sie Ihre Zellen durch das Mikroskop.Als nächstes waschen Sie das Geschirr mit zwei Milliliter Waschpuffer. Und zwei Milliliter Hungermedium zu den Zellen und legen Sie die Gerichte in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für 15 Minuten. Stellen Sie sicher, dass Ihre Pulsjagd in Ordnung ist.Übertragen Sie das Geschirr auf die Regale im Wasserbad, vorgewärmt auf 37 Grad Celsius. Stellen Sie sicher, dass die Gerichte in Kontakt mit Wasser sind, aber nicht schwimmen. Starten Sie dann einen Timer.Mit 40 Sekunden das Hungermedium ansaugen. Mit einer Mikropipette 600 Mikroliter Pulslösung aufstellen. In genau einer Minute, fügen Sie vorsichtig die Pulslösung in die Mitte der Schale.Wiederholen Sie diesen Vorgang, indem Sie das Hungermedium entfernen und die Pulslösung für die restlichen Gerichte in einem Minutentakt hinzufügen. Bei genau 11 Minuten und für alle folgenden Gerichte, nach dem Pulsverfolgungsschema, mit Ausnahme der Null-Minuten-Jagdprobe, fügen Sie zwei Milliliter Jagdmedium direkt auf das Gericht. Das Jagdmedium ansaugen und durch zwei Milliliter frisches Jagdmedium ersetzen.Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle verbleibenden Gerichte im Minutentakt. Wenn der Timer genau 16 Minuten liest, fügen Sie zwei Militer des Verfolgermediums direkt auf die Null-Minuten-Jagdschale, auf dem Pulsmedium, um die Beschriftung zu stoppen. SofortigeSingieren Sie das Medium.Übertragen Sie die Schale auf eine gekühlte Aluminiumplatte und fügen Sie zwei Militer eiskalten Stop-Puffer. Alle anderen Gerichte bei 37 Grad Celsius in einen Brutkasten geben. Übertragen Sie jede Verfolgungsjagd vom Brutkasten zurück ins Wasserbad zwei Minuten vor dem Ende jeder Jagdzeit.Zur genauen Jagdzeit für jedes Gericht, aspirieren Sie das Jagdmedium und übertragen Sie die Schale auf eine gekühlte Aluminiumplatte. Fügen Sie zwei Milliliter eiskalten Stop-Puffer hinzu. Lassen Sie alle Gerichte auf Eis und stoppen Puffer, bis es Zeit ist, die Zellen zu lysieren.Dann die Stop-Lösung ansaugen und alle Teller waschen. Drei gleichzeitig mit zwei Millilitere eiskalte Stop-Lösung. Die Stop-Lösung vollständig ansaugen und 600 Mikroliter Lysepuffer zu zwei Gerichten gleichzeitig hinzufügen.Mit einem Zellschaber, kratzen Sie die Oberfläche der Schale gründlich, aber sanft, um das Lysat zu mischen. Lysat von jedem Gericht auf ein frisches 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr übertragen. Zentrifuge bei 15 000 bis 20 000 G bei vier Grad Celsius für 10 Minuten, um die Kerne zu pellet.Für die Pulsjagd auf Suspensionszellen sammeln sich fünf Millionen Zellen pro Zeitpunkt in einem 50-Milliliter-Rohr. Führen Sie das Verhungerungsverfahren wie im Text beschrieben aus. Nach dem Hungervorgang im Wasserbad für 15 Minuten, starten Sie den Timer.In genau einer Minute 275 Mikrocuries unverdünnter Etiketten direkt in das Rohr geben, das Zellen enthält, und wirbeln, um es zu mischen. Fügen Sie bei genau 11 Minuten vier Milliliter Verfolgungsmedien hinzu, um die Beschriftung zu stoppen. Und sofort einen Milliliter auf eine 15 Milliliter Tube auf Eis übertragen, die neun Milliliter eiskalte Stop-Lösung enthält, um die Etikettierung zu stoppen.Wiederholen Sie diesen Vorgang der Übertragung eines Milliliters Verfolgungsjagd auf eine Röhre auf Eis, die neun Milliliter Stop-Lösung für jeden aufeinanderfolgenden Verfolgungszeitpunkt enthält. Nach der Immunpräzipitation die letzte Wäsche vollständig ansaugen. Die Perlen in 20 MikroliterTE Puffer und Wirbel wieder aussetzen.Fügen Sie 20 Mikroliter zweiX-Probenpuffer ohne den Reduktionsmittel hinzu. Wirbeln Sie die Proben und erhitzen Sie sie dann bei 95 Grad Celsius für fünf Minuten. Wirbeln Sie die Proben wieder.Zentrifuge bei 12.000 mal G bei Raumtemperatur für eine Minute. Übertragen Sie 19 Mikroliter des nicht reduzierten Überstandes in ein frisches Mikrozentrifugenrohr, das einen Mikroliter 500 Millimolar DDT enthält. Zentrifugieren Sie bei Bedarf schnell die Probe, so dass sich alle Flüssigkeiten am Boden befinden.Und bei 95 Grad Celsius fünf Minuten erhitzen. Lassen Sie die reduzierte Probe abkühlen und dann wirbeln. Zentrifugieren Sie sowohl die reduzierten als auch die nicht reduzierten Proben bei 12.000-fachem G bei Raumtemperatur für eine Minute, und fügen Sie dann 1,1 Mikroliter eines Molaren-NEM zu allen Proben hinzu.In dieser Studie wird ein radioaktiver Pulsjagdansatz verwendet, um die Proteinfaltung und den Transport in intakten Zellen zu analysieren. Die Faltung und Sekretion von HIV ein GP120 aus einer haftenden Pulsjagd wird hier gezeigt. Das nicht reduzierende Gel zeigt die oxidative Faltung von GP120.Unmittelbar nach der Pulsbeschriftung erscheint es als diffuses Band höher im Gel. Während die Verfolgungsjagd voranschreitet, wandert das Band durch noch diffusere Faltzwischenprodukte nach unten, bis es sich im engen Band ansammelt, das bei GP120 nativ gefaltet ist. Dies tritt auf, da die Bildung von Disulfidbindungen die Kompaktheit des Proteins erhöht, wodurch es schneller wandert als das vollständig reduzierte Protein.Auf dem reduzierenden Gel wurden die Disulfidbindungen und alle Moleküle reduziert und haben keinen Einfluss auf die Mobiilty. Daher sind Unterschiede in der Mobilität nur das Ergebnis von Veränderungen der Molekularmasse. Die Verschiebung im Laufe der Zeit von der reduzierten Signalpeptid uncleaved Form zu dem reduzierten Signal Peptid spaltenForm stellt die post-translationale Signal Peptid Spaltung von GP120.Die Beweglichkeit erhöht sich durch den Verlust des Signalpeptids, das während der Verfolgungsjagd zunimmt, da mehr Proteine die native Falte erreichen und ihr Signalpeptid verlieren. Sowohl beim nicht reduzierenden als auch beim reduzierenden Gel beginnt das Signal aufgrund der Sekretion von GP120 ab etwa einer Stunde zu sinken. Dies kann durch die Analyse der Medien überwacht werden.Diese Methode ist auf jede Zelllinie anwendbar, einschließlich organoider Zellmodelle. Aber der Erfolg hängt stark von der Expressionsebene des Proteins von Interesse ab. Bevor Sie mit diesem Verfahren beginnen, markieren Sie Ihre Gerichte und halten Sie diese Reihenfolge während des gesamten Experiments.Stellen Sie sicher, dass alles vorbereitet ist, bevor Sie ein Hungermedium hinzufügen. Dies ist der Beginn des Experiments. Und Deine Laborzeit ist dein Freund, aber du kannst dein größter Feind sein, wenn du nicht vorbereitet bist.Bills Verfolgungsjagd kann mit einer begrenzten Proteolyse kombiniert werden, um den vollständigen Nachlass von Proteinen mit der Zeit zu untersuchen. Auch verschiedene gewählte Gefriertruhen-Methoden ermöglichen die Analyse von Spül- oder Rigormorisierungs- oder Ladungsunterschieden. Um den Forscher und das Gerät zu schützen, müssen alle lokalen Strahlenschutzvorschriften eingehalten werden.Und es sollten Schutzmaßnahmen nach Protokoll getroffen werden. Beachten Sie, dass Ihr Acrylamid, das für Ihre STH-Seite verwendet wird, neurotoxisch ist.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

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Analyse der Proteinfaltung, Transport und Abbau in lebenden Zellen durch radioaktive Puls Chase

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