Messung von Form und Größe der Belebtschlamm Partikel unbeweglich in Agar mit einer Open-Source-Software-Pipeline

Die Größe und Form von Belebtschlammpartikeln ist entscheidend für die Abwasserbehandlung. Dennoch ist ihre Messung oft ad hoc. Dieses Protokoll bietet eine wiederholbare, gut definierte und halbautomatisierbare Messgröße für ihre Messung.

Der Hauptvorteil dieses Protokolls besteht darin, dass es eine große Population von Teilchen über eine Vielzahl von Morphologien messen und gleichzeitig subjektive und systematische Verzerrungen reduzieren kann. Während sich diese Technik auf Belebtschlamm konzentriert, kann technisch alles, was die gleiche Partikelmorphologie wie Mikroplastik hat, mit dieser Methode gemessen werden. Wenn Sie diese Technik zum ersten Mal versuchen, versuchen Sie, eine Platte nach der anderen zu machen und üben Sie die physikalischen Bewegungen der Herstellung dieser einen Platte.

Nehmen Sie sich auch Zeit mit der Mikroskopie. Die Videoversion dieses Artikels ist wichtig, da Sampling und Plattenvorbereitung viele kleine Techniken erfordern, die am besten visuell kommuniziert werden. Auch das Zeigen und Sehen von guten Bildern von Platten ist wichtig, um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten.

Dieses Protokoll demonstriert heute Joseph Weaver, ein Doktorand in meinem Labor. Zunächst sollten Sie eine repräsentative Probe aus einem gut gemischten Teil des Reaktors erwerben. Mischen Sie die Probe vorsichtig und gießen Sie dann sofort das ermittelte Probenvolumen in ein 15 Milliliter Zentrifugenrohr.

Als nächstes fügen Sie fünf Mikroliter von einem Prozent Methylenblau zu jeder Probe hinzu. Kappen und mischen Sie die Probe, indem Sie das Rohr mindestens dreimal sanft umkehren. Lassen Sie die Proben mindestens fünf, aber nicht mehr als 30 Minuten bei Raumtemperatur färben.

Nach der Färbung ein ausreichendes Volumen von geschmolzenem 7,5 Prozent Agar und deionisiertem Wasser in das Zentrifugenrohr übertragen, um das Gesamtrohrvolumen auf 6,5 bis 9 Milliliter zu bringen. Dann die Zentrifugenrohre rekapitulieren und mindestens dreimal sanft umkehren, um die Probe in den Agar zu mischen. Während Sie die Kappe von sich selbst wegzeigen, öffnen Sie die Kappe.

Gießen Sie den Rohrinhalt jedes Rohres in ihre eigene 100 Milliliter Kunststoff-Petrischale, während Sie die Schale sanft schaukeln, um eine vollständige, glatte Beschichtung und eine optisch gleichmäßige Verteilung der Partikel zu erreichen. Lassen Sie die Platten bei Raumtemperatur mindestens 5 Minuten abkühlen, bis sich der Agar erstarrt. Platzieren Sie die unbedeckte Platte nach oben auf der Mikroskopstufe eines Stereomikroskops, das eine 10- bis 20-fache Vergrößerung ermöglicht.

Beleuchten Sie die Probe von unten mit gleichmäßigem Licht, mit Geräten wie einem LED-Beleuchtungsständer oder einer Lichtplatte. Öffnen Sie die Bildaufnahmesoftware, und stellen Sie sicher, dass der Lichtpfad des Mikroskops auf Foto eingestellt ist. Wählen Sie dann die entsprechende Kamera aus der Kameraliste aus.

Stellen Sie das Mikroskop so ein, dass mehrere Partikel in der Brennebene mit großen, gut definierten Kanten erscheinen. Verwenden Sie eine Vergrößerung von 10 bis 20 Mal, um Partikel zu messen, während eine relativ tiefe Brennebene beibehalten wird. Entfernen Sie vorübergehend die Agarplatte und legen Sie das Mikrometer auf die Bühne.

Passen Sie den Feinfokus an, bis die Graduierungen auf dem Mikrometer in der Bildaufnahmesoftware scharf fokussiert erscheinen. Und kalibrieren Sie das Verhältnis von Pixel zu Mikrometer. Legen Sie als Nächstes den Zoom auf 100 Prozent fest, indem Sie auf die Ansicht klicken und die tatsächliche Größe auswählen.

Wählen Sie dann Optionen aus und gehen Sie zu kalibrieren. Richten Sie hier den roten Kalibrierbalken im Hauptansichtsfenster entlang der langen Achse des Mikrometers aus. Mit den vertikalen Balken zentriert auf die Null und 200 Mikron Graduierungen.

Geben Sie im Dialogfeld Kalibrieren den aktuellen Vergrößerungsgrad und die tatsächliche Länge von 200 Mikrometern ein. Wenn bereits kalibriert, wählen Sie die Vergrößerung aus der Menüleiste und dann den aktuellen Vergrößerungsgrad aus, um die Kalibrierung zu bestätigen. Gehen Sie im Menü "Messungen" zur Zeile und wählen Sie eine beliebige Zeile aus.

Klicken Sie auf den Schnittpunkt der Nullgradierung und der langen Achse des Mikrometers. Klicken Sie dann erneut auf den Schnittpunkt an der 200-Mikron-Linie und die lange Achse. Eine korrekte Kalibrierung sollte als ca. 200 Mikrometer angezeigt werden.

Löschen Sie die Zeile, indem Sie auf die Schaltfläche Objekt auswählen klicken, auf die Zeile klicken, löschen und im Bestätigungsfeld "Ja" drücken. Als nächstes ersetzen Sie die Agarplatte und passen Sie den feinfeinen Fokus an, um maximale Details in der Bildverarbeitungssoftware zu erreichen. Um dies zu erreichen, erhöhen Sie zunächst die Bittiefe des maximal zulässigen Wertes, indem Sie das Optionsfeld im Bittiefenbedienfeld der Kamera-Seitenleiste auswählen.

Stellen Sie außerdem die Software so ein, dass Graustufenbilder erfasst werden, indem Sie den entsprechenden Optionsfeld im Farbstufenbedienfeld der Kamera-Seitenleiste auswählen. Reduzieren Sie nun alle offenen Seitenleistenplatten zwischen Belichtung und Histogramm. Reduzieren Sie die Verstärkung auf eins, und erhöhen Sie die Belichtung, bis ein klares Bild im Ansichtsfenster angezeigt wird und bis das Histogramm als Verteilung angezeigt wird, die von keinem der beiden Enden des Histogrammfelds abgeschnitten wird.

Passen Sie das Histogramm an, um eine Über- und Unterbelichtung zu vermeiden. Schieben Sie im Histogrammbedienfeld der Kamera-Seitenleiste die linke Begrenzung des Histogramms auf knapp außerhalb der niedrigsten Werte und die rechte Grenze auf etwas außerhalb der höchsten Werte. Speichern Sie das Bild als unkomprimierte TIF-Datei.

Fügen Sie Vergrößerungsinformationen in die Bildmetadaten ein, indem Sie beim Speichern das Kontrollkästchen Speichern mit Kalibrierungsinformationen überprüfen. Wählen Sie einen anderen Bereich aus, der die vorherigen Bilder nicht überlappt, indem Sie einem Pfad folgen, der zwischen von links nach rechts und von rechts nach links wechselt, wenn man die Platte hinunterbewegt. Erfassen Sie mindestens 500 visuell geschätzte Partikel für die Analyse.

Erfassen Sie den Partikelanalysecode, indem Sie das GIT-Repository klonen. Rufen Sie in der Befehlszeile die neueste Version des Codes ab, indem Sie den hier gezeigten Befehl eingeben. Installieren Sie den Analysecode gemäß den Anweisungen in der Textdatei Read me, die sich im Verzeichnis der obersten Ebene des geklonten Repositorys befindet.

Bearbeiten Sie anschließend eine Textdatei, in der die zu verarbeitenden Verzeichnisse zusammen mit optionalen Parametern aufgeführt sind. Eine Liste von Parametern und Beispielen finden Sie im Unterverzeichnis Beispiele und Analysen. Führen Sie nun die Analyse in der Befehlszeile aus, indem Sie den hier gezeigten Befehl eingeben.

Fidschi-Pfad ist das Verzeichnis, in dem imageJ-win64. exe befindet sich. Und paramsfile den Speicherort der Textdatei, die die Analyse-Setup beschreibt.

Der Name der ausführbaren Datei kann je nachdem, auf welchem Betriebssystem Fidschi installiert ist, unterschiedlich sein. Die Analyse wird automatisch ausgeführt und dauert je nach Größe und Anzahl der Bilder einige Minuten bis ein paar Stunden. Überprüfen Sie anschließend die Qualitätskontrolldateien im Unterverzeichnis Overlay des angegebenen Ausgabeverzeichnisses.

Beachten Sie Bilder mit falschem Nebel oder schlecht gefangenen Teilchen, die alle als schattierte Umrisse sichtbar sind, die nicht mit dem Hintergrund übereinstimmten. Das wars. Die Daten sind nun für die experimentierte Analyse und Die Generierung von Figuren bereit.

Obwohl keine Methode zur Partikelschwellenbildung perfekt ist, ist hier ein Beispiel für akzeptable Ergebnisse. Beim Auswerten von QC-Bildern werden drei häufige Fehler gefunden. Nichtkorrekte Übereinstimmung mit den Partikelgrenzen, fehlende Identifizierung von Partikeln und Einbeziehung von Artefakten.

Hier werden die Partikelverteilungen zwischen zwei Versuchsreaktoren im Laufe der Zeit angezeigt und mit qualitativen Metadaten kombiniert, die der Forscher notiert. Dieses Schaubild zeigt, daß die Reaktoren in diesem Fall im Allgemeinen ähnliche Partikelgrößenverteilungen aufwiesen, die im Laufe der Zeit zu einem größeren Mittelwert und einer breiteren Streuung tendierten. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Platte gleichmäßig mit einer dünnen Agarschicht zu beschichten, die gleichmäßig verteilte Partikel enthält.

Achten Sie darauf, zu üben und nehmen Sie sich Zeit. Über dieses Verfahren hinaus könnten interessante Partikel aus dem Agar entfernt und untersucht werden. In Bezug auf die Daten sind die resultierenden Dateien aus diesem Protokoll gut definiert und der Himmel ist die Grenze analytisch.

Diese Technik ebnete den Weg für neue Einblicke in aeroben Körnungsschlamm. Seine Morphologie ist sehr wichtig und es erlaubte uns, sie in einer Standard-Art und Weise zu messen. Abwasser ist biologisch aktiv.

Biosicherheitsstufe eins wird gefördert. Auch, wie Agar überblasen kann, wenn Mikrowelle und heiße Tröpfchen beim Öffnen der Zentrifugenröhre sprühen kann.