Name: Anhebung der mexikanischen Tetra Astyanax Mexicanus für Analyse der Post-larval Phänotypen und vollständig-hängen Immunohistochemistry (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 42 s
Description: Erfahren Sie die Aufzucht von Astyanax mexicanus zur Analyse postlarvaler Phänotypen mittels Ganzpräparat-Immunhistochemie. Diese Methode ermöglicht vergleichende Studien zwischen Fluss- und Höhlenmorphotypen.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem National Institutes of Health [HD089934, DK108495].

In diesem Protokoll beschriebenen Verfahren wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) an der Harvard Medical School genehmigt.
1. Zucht
Hinweis: Es gibt mehrere veröffentlichten Methoden für die Zucht von15,16,17,20 , die auch bei diesem Schritt genutzt werden kann. Vor der Zucht, sind auf eine 10:14 hell: Dunkel-Zyklus bei 23 ° C und eine Pellet-Diät gefüttert geschlechtsreifer Fische gepflegt (siehe Table of Materials) einmal täglich. Fische können in einem rezirkulierenden System mit mechanische Filtration und UV-Sterilisation gezüchtet. Zucht in statische (Rezirkulation) Panzer auch erreicht werden kann, aber Fisch sollte nicht gelassen werden in einem statischen Tank für mehr als 3 Tage, wie Wasserqualität verschlechtert sich schnell.
<ol><li>Fisch-fähigen Wasser einen 5 gal Tank einfüllen (entchlort Wasser angepasst: pH = 7.1 + /-2, Leitfähigkeit = 900 +/-150 µS, Temperatur = 23 ° C).</li>
	<li>Geben Sie Kunststoff ineinander greifen (siehe Material) in der Unterseite des Tanks. Wenn in statischen Panzer Zucht, befestigen Sie einen Durchlauferhitzer an der Seite des Tanks. Wenn in einem rezirkulierenden System Zucht, platzieren Sie eine Wasser-Heizung im System Sumpf. Hinweis: Die Kunststoffgitter verhindert, dass Erwachsene Verzehr von Eiern.</li>
	<li>Ort eine weibliche und zwei männliche A. Mexicanus Fische von mehr als 1 Jahr alt in den Tank. Lassen Sie den Fisch für 30 min zu akklimatisieren.</li>
	<li>Stellen Sie die Temperatur der Heizung auf 24 ° C (oder 1 ° C wärmer als die Anfangstemperatur).</li>
	<li>Erhöhen Sie nach 24 Stunden die Temperatur von 1 ° C.</li>
	<li>Erhöhen Sie nach 24 Stunden die Temperatur von 1 ° C. Überprüfen Sie die Tanks täglich für Eier von glänzenden eine Taschenlampe auf den Boden des Tanks. Zurückhalten Sie, die Fische aus der Nahrung in diesem 3-Tages-Zeitraum.</li>
	<li>Wenn laichen nicht nach 3 Tagen induziert wurde, schalten Sie die Heizung und lassen Sie das Wasser wieder auf Raumtemperatur (RT) bevor die Fische mit ihren ursprünglichen Tank.</li>
</ol>(2) schlüpfen befruchtete Eier
<ol><li>Sobald Eier in einem Zucht-Tank identifiziert werden, entfernen Sie die Erwachsene und Kunststoffgitter, und reduzieren Sie das Wasser bis zu einer Tiefe von 10 cm mit einem Becher oder einer Tasse. Hinweis: Zur Zeit des Laichens abschätzen zu können, verwenden Sie eine Transferpipette, um mehrere Eier in einer Petrischale zu platzieren und sie mit einem Stereomikroskop zu bestimmen, die Bühne14 und der Zeitpunkt der Befruchtung zu schätzen.</li>
	<li>Verschieben Sie den Tank in eine praktische Arbeitsfläche und entfernen Sie alle opaken Eier oder Kot, verlassen nur die durchscheinende, fruchtbaren Eier im Tank. Hinweis: Die Anzahl der befruchteten Eier kann zu diesem Zeitpunkt erfasst werden.</li>
	<li>Füllen Sie der Tank mit Fisch Wasser (siehe Punkt 1.1) und Tank ca. 6-7 Tropfen Methylenblau hinzufügen, da das Wasser füllt. Hinweis: Die Endkonzentration von Methylenblau ist etwa 1,5 ppm.</li>
	<li>Fügen Sie eine Heizung und Aquarium Bubbler (verbunden mit einer Luftpumpe mit einem Regler) in den Tank.</li>
	<li>Legen Sie die Heizung auf 24 ° C und passen Sie die Airstream-Regler um einen sanften Strom von Luftblasen zu produzieren.</li>
	<li>Setzen Sie einen Deckel auf den Tank um die Wassertemperatur zu halten. Hinweis: Die Eier sollten Schraffur innerhalb von 24 h zum Laichen mal anfangen.</li>
</ol>3. Übertragung der geschlüpften Larven zu Kindergarten Container
<ol><li>20 g Salz zugeben (siehe Material) auf 8 L von Fisch-Ready Wasser (siehe Punkt 1.1) und rühren, bis aufgelöst. Füllen Sie jede 1,5 L Baumschule Behälter (siehe Material) mit 1 L Wasser bereit.</li>
	<li>Verwenden Sie eine Transferpipette geschlüpfte Larven in vorbereiteten Kinderzimmer Container bei einer Dichte von 20 Fische pro Container zu bewegen. Hinweis: Eine Stirnlampe kann nützlich sein, zu lokalisieren und die geschlüpften Larven zu übertragen.</li>
	<li>Nachdem alle sichtbaren geschlüpften Larven entfernt haben, Regen Sie das Wasser in den Tank durch Rühren und/oder die Kanten und Ecken des Behälters mit der Pipette Wasserstrahlen hineinblasen. Hinweis: Dies wird helfen, Larven zu offenbaren, die beim ersten Durchgang wurden verfehlt.</li>
	<li>Entsorgen Sie ungenutzte Larven in diesem Stadium unter Beachtung der Richtlinien von Office Labor Wohlfahrt (OLAW). Hinzufügen von Natriumhypochlorit in den Tank, eine Endkonzentration von 6,15 % zu erreichen. Warten Sie mindestens 5 min vor dem Gießen in den Ausguss.</li>
	<li>Beschriften Sie jedes Kinderzimmer Behälter mit dem Datum und der Zeitpunkt der Befruchtung. Kindergarten Container täglich sehen und weiterhin Toten Larven zu entfernen.</li>
</ol>4. Vorbereitung der Rädertierchen basierende Fischfutter
<ol><li>Weitere Informationen auf den Erhalt von Rädertierchen Tabelle der Materialien . Folgen Sie die referenzierte Protokoll zum Einrichten, pflegen und ernten Rädertierchen22.</li>
	<li>Bereiten Fisch Lebensmittel durch Zugabe von 3 mL der Algen-Mischung (siehe Tabelle der Materialien), 1 L des geernteten Rädertierchen. Diese Mischung wird direkt an die Kindergarten-Container als eine Versorgung mit Lebensmitteln hinzugefügt werden.</li>
</ol>5. Fütterung von Post-larval Fish
<ol><li>Wenn die Fische, dass 5 Tage post-Düngung (Dpf), fügen Sie 3 mL Fischfutter (vorbereitet in Schritt 4.2 hinzu) jeder Kindergarten Container. Die optimale Dichte Rädertierchen in dichten Gruppen an den Ecken der Baumschule Behälter sichtbar, und weniger sichtbar sollte in der Mitte des Behälters. Fügen Sie zusätzliche Rädertierchen Mischung, bis die entsprechende Dichte erreicht ist.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Behälter täglich auf das Vorhandensein von Rädertierchen und fügen Sie mehr hinzu, wenn die Konzentration aufgebraucht wird. Weiterhin Toten Larven zu entfernen.</li>
	<li>Wenn Fische 14 Dpf erreichen, verschieben Sie sie in einen Behälter mit einem umlaufenden System bei einer Dichte von 5 Fische/L Wasser passen. Hinweis: Die Anzahl der Überlebenden nach dem Larvenstadium Fische kann zu diesem Zeitpunkt erfasst werden.</li>
</ol>6. vollständig-hängen Immunohistochemistry Post-Larven Fische
<ol><li>Entfernen Sie nach dem Larvenstadium Fisch der gewünschten Etappe von Nahrung für 24 h durch das Gießen der Baumschule Behälter, die Fische durch eine Nylon mesh Sieb und platzieren das Sieb in ein Gefäß mit Wasser sauber Fisch-Ready (siehe Punkt 1.1). Hinweis: Es ist erforderlich, alle Speisen zu entfernen. Selbst kleine Mengen an Nahrung im Darm sind Auto-fluoreszierende und Bildgebung zu beeinflussen.</li>
	<li>Sammeln und die Fische einzuschläfern. Hinweis: Die Euthanasie-Protokoll sollten OLAW Richtlinien befolgen, und durch Ihre institutionellen Animal Care und Use Committee genehmigt werden. Wir haben festgestellt, dass Tricaine allein nicht Post-Larven Fische einzuschläfern, und die Fische beginnen sich zu bewegen, bei der Übertragung von Tricaine auf Fixiermittel, wenn die Fische nicht auch auf Eis gehalten werden.<ol>
<li>Bereiten Sie Tricaine Lösung in ein Becherglas 1 L entionisiertem Wasser 0,4 g Tricaine-S und 0,8 g Natriumbicarbonat hinzufügen, und legen Sie es auf dem Eis.</li>
		<li>Gießen Sie das Wasser mit den Fischen durch ein Sieb Nylon, die Fische zu sammeln. Vorsichtig Tauchen Sie das Sieb im eiskalten Tricaine Lösung und lassen Sie es für 10 min auf Eis.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die euthanasierten Fische zu beheben.<ol>
<li>Verwenden Sie eine Transferpipette mit einer abgeschnittenen Spitze den Fisch auf einem konischen Rohr übertragen.</li>
		<li>Entfernen Sie die Tricaine-Lösung mit einer Transferpipette und ersetzen mit Fixiermittel. Inkubieren Sie mit Schaukeln. Hinweis: Fixiermittel und Fixierung Zeit muss anhand der Antikörper verwendet ermittelt werden. 10 % Formalin-Lösung (4 % Formaldehyd, siehe Materialien) über Nacht bei 4 ° C ist ausreichend für die Antikörper, die in der Tabelle der Materialienaufgeführt. Achtung: Formalin ist giftig und brennbar. Tragen Sie persönlichen Schutzausrüstung (Handschuhe, Kittel und Splash Schutzbrille) und Griff in eine chemische Kapuze. Lösungen mit Formalin müssen als Sondermüll entsorgt werden.</li>
		<li>Verwenden Sie eine Transferpipette, um entfernen Sie vorsichtig das Fixiermittel, ohne die Fische zu stören. Fügen Sie 3 mL Phosphat gepufferte Kochsalzlösung-Triton Lösung [PBS mit 0,1 % Triton (PBST), finden Sie unter Materialien] und 15 min bei RT mit rockigen inkubieren.</li>
		<li>Entfernen Sie PBST zu und ersetzen Sie durch frisches PBST und inkubieren Sie für 15 min. Wiederholen Sie dieses "waschen" eine zusätzliche Zeit. Hinweis: Fisch kann in PBS mit 0,02 % Natriumazid bei 4 ° C für mehrere Wochen gelagert werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Durchführen Sie vollständig-hängen Immunostaining.<ol>
<li>Bereiten Sie 50 mL Lösung [PB-0.5% Triton X, 0,2 % Rinderserumalbumin (BSA), 1 % Dimethyl Sulfoxid (DMSO), 0,02 % Natriumazid, 5 % Esel Serum] zu blockieren. Achtung: Natriumazid und DMSO sind giftig. Persönlicher Schutzausrüstung (Handschuhe, Kittel und Splash Schutzbrille) sollten beim behandeln verwendet werden. Alle Lösungen sollten als Sondermüll entsorgt werden.</li>
		<li>Verwenden Sie eine Transferpipette, um die Fische auf eine 4 mL-Glasflasche mit Schraubverschluss Kappe zu übertragen. Verwenden Sie eine Transferpipette der PBST entfernen und hinzufügen 3 mL Lösung blockiert. Inkubation für 1 h bei RT mit Schaukeln.</li>
		<li>Verwenden Sie eine Transferpipette die blockierende Lösung entfernen und hinzufügen Primärantikörper in blocking-Lösung verdünnt. Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur unter Rühren. Hinweis: zum Beispiel hinzufügen 1: 250 Verdünnung von Anti-HuC/HuD neuronalen Protein Maus monoklonaler Antikörper (siehe Tabelle der Materialien für eine Liste von Antikörpern, die erfolgreich in A. Mexicanusverwendet wurden). Bei diesem Schritt beizufügen eine Reihe von Fisch mit keine primären Antikörper hinzugefügt. Volumen des Antikörpers sollte ausreichen, um decken Sie die Fische und lassen für Agitation.</li>
		<li>Waschen Sie den Fisch 3 Mal mit PBST, wie in Schritt 6.3.4 beschrieben. Ersetzen Sie PBST mit sekundären Antikörper blockieren Lösung verdünnt und Inkubation über Nacht bei RT mit Agitation. Hinweis: Optimale primäre und sekundäre Antikörper-Konzentrationen, Inkubationszeit und Inkubationstemperatur sollte für jeden Antikörper bestimmt werden. Über Nacht bei RT war effektiv für die Antikörper, die in der Tabelle der Materialienaufgeführt.</li>
		<li>Waschen Sie den Fisch 3 Mal mit PBST, bei jedem Waschen dauert 15 min, wie in Schritt 6.3.4 beschrieben.</li>
		<li>Übertragen Sie den Fisch auf PBS für kurzfristige Lagerung bevor mit sezieren, Montage, oder schneiden den Fisch.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Vergleich der Genaktivität zwischen Oberfläche und Höhle erfordert A. Mexicanus sorgfältig kontrollierten Umweltparameter und Methoden, die in Laboratorien repliziert werden können. Unser Protokoll für die Anhebung A. Mexicanus bietet konsistente Nährstoffgehalt während der Post-Larvalentwicklung. Im Anschluss an diese Fütterung kann Genfunktion souverän zwischen Populationen mit dem robusten Immunhistochemie Protokoll präsentieren wir verglichen werden. Hier besprechen wir die Bedeutung dieser Methode sowie seine Grenzen und zukünftige Anwendungen.
Um Dichte abgestimmt Wachstum zu erreichen, fanden wir, dass nach dem Larvenstadium Fisch ohne Rezirkulation Wasser für zwei Wochen im 1,5 L Container auf eine Diät von Rädertierchen angehoben werden kann. Dieses Protokoll kann auch verwendet werden, um Fische auf einem umlaufenden System zu erhöhen; Rädertierchen müssen jedoch täglich hinzugefügt werden, Ausgleich für die verlorenen durch den Tank-Abfluss. Frisch geschlüpfte Artemia -Nauplien werden häufig als Nahrungsquelle in der Aquakultur verwendet, aber wir fanden, dass die Verwendung von Rädertierchen hat erhebliche Vorteile, einschließlich: reduzierter Preis, verbesserte Biosicherheit, konsequente Ernährung und bessere Wasserqualität (siehe unten).
Erstens sind die wöchentlichen Kosten in Verbrauchsmaterialien 4 Dollar für Rädertierchen, im Vergleich zu 14 Dollar für Artemia. Über Biosicherheit, Rädertierchen sind unter kontrollierten Bedingungen im Labor angehoben, während Artemia werden gesammelt, aus der Natur und natürlichen Schwankungen in mikrobiellen oder Erreger Inhalt23. Darüber hinaus sind die Nährstoffzusammensetzung der Artemia Nauplien ökologisch entschlossen und daher unvereinbar. Nauplien gedeihen auf ihre eigenen Energiespeicher nach dem schlüpfen; Sie verlieren schnell Nährwert, wie sie sich entwickeln und optimal zu den Fischen innerhalb einiger Stunden gefüttert werden sollten. Artemia beginnen Fütterung an 12 Haus nach dem Schlupf, auf die das erste Mal, das sie ernährungsphysiologisch angereichert werden konnte; in diesem Stadium sind sie zu groß für 5 Dpf Fisch konsumieren geworden. Im Vergleich dazu fressen Rädertierchen kontinuierlich marine Mikroalgen, was zu hohen Nährstoffgehalt unabhängig davon, wann die Rädertierchen geerntet werden. Rädertierchen sind viel kleiner als Artmeia Nauplien (160 vs. 400 µm), so dass sie leichter für die Fische zu erfassen und zu schlucken. Nach dem Larvenstadium Oberfläche Fisch und Cavefish verbrauchen Rädertierchen in ähnlichen Mengen vorschlagen keinen Unterschied in der Bevorzugung oder Fähigkeit, die Rädertierchen10zu erfassen.
Schließlich beginnen Artemia Nauplien sterben in frischem Wasser mehrere Stunden nach eingeführt. Gefressenes Nauplien werden schwächer, die Wasserqualität rapide abnimmt, wenn sie nicht manuell entfernt werden. Entfernen von Toten Artemia ist zeitraubend und gefährlich für Post-Larven Fische, die sind nicht viel größer als Artemia und möglicherweise versehentlich entfernt oder verletzt. Rädertierchen können auf unbestimmte Zeit in den Kindergarten-Containern zu leben und Essen zu den Fischen jederzeit ohne Beeinträchtigung der Wasserqualität deutlich.
Während mit Rädertierchen, wie eine Nahrungsquelle erhebliche Vorteile hat, die Rädertierchen Lager, Algen halten das Kultursystem täglich hinzugefügt werden muss. Dies kann mit einem Futterautomaten, die flüssigen Algen in den Rädertierchen Kultur Behälter verzichtet (siehe Tabelle der Materialien). Rädertierchen müssen auch aus diesem Set-up alle 24-48 Stunden geerntet werden, um die Gesundheit der Kultur zu erhalten. Forscher, die Fische sehr selten (einmal jährlich, zum Beispiel) züchten und befassen sich nicht mit Vergleiche zwischen den Populationen an Post-Larvenstadien bevorzugen Artemia als Nahrungsquelle, da die verkapselten Embryonen jederzeit ausgebrütet werden können.
Es wird empfohlen, die Kontrollnummer des schraffierten und Überlebenden Larven der Erfolgskontrolle von Schlupf und das Wachstum. Wenn die meisten Embryonen oder Larven sterben, kann es durch bakterielle oder Pilzinfektionen Verschmutzung sein. Es wird empfohlen, die Wasserqualität des Fisch-Ready Wassers zu überwachen und keine Ausrüstung mit 70 % Ethanol zu sterilisieren. Kindergarten Container können wiederverwendet werden, nachdem sie gereinigt und sterilisiert werden. Um das Risiko einer Erkrankung zu minimieren, ist es auch entscheidend für jede Tote Fische aus den Kindergarten Behältern zu entfernen und Rädertierchen vor 5 Dpf nicht hinzufügen, wenn die Fische anfangen zu essen.
A. Mexicanus sind geschlechtsreif ca. ein Jahr alt. Dies ist eine Einschränkung für die Erzeugung von transgenen A. Mexicanus im Vergleich zu Danio Rerio (Zebrafisch), die bei 10-12 Wochen24züchten zu können. Immunhistochemie (IHC) ist eine alternative Methode, Genexpression und Protein Lokalisierung zu untersuchen. Das hier beschriebene Protokoll kann bei jedem Schritt angepasst und Antigene in jedem Gewebe des Interesses erkennen verwendet werden. Es ist wichtig, beachten jedoch, dass einige Gewebe möglicherweise schwieriger zu visualisieren in Oberfläche Fische durch Pigmentierung (eine Barriere, die in nichtpigmentierte Cavefish nicht vorhanden ist), welche die Interpretation vergleichender Studien beeinflussen können. Um dieses potentielle Problem zu beheben, kann Oberflächen Fisch Pigment nach der Fixierung mit 3 % Wasserstoffperoxid gebleicht werden.
IHC erfordert erfolgreiche Gewebe Fixierung, blockieren und Antikörper eindringen. Methoden für jeden je nach Gewebe und Protein des Interesses. Das Fixiermittel und Fixierung Mal muss Zellarchitektur beibehalten, unter Beibehaltung der Antigen-Epitop. Für dieses Protokoll wir verwenden eine vernetzende Fixativ (Paraformaldehyd) und Weglassen einer denaturierenden Fixativ (z. B. Methanol oder Aceton). Wir fanden, dass Inkubation in Aceton Antikörper Signal für neuronale und Pankreas Marker vermindert. Die blockierende Schritt unbedingt Antikörper aus der Bindung auf Nichtziel-Proteine im Gewebe zu verhindern. Diese Methode verwendet eine Kombination aus normalen Serum (5 %) und BSA (0,2 %) in der blockierenden Lösung. Die blockierende Lösung enthält Antikörper und Proteine, die an reaktiven Zentren auf Proteine im Gewebe, Verminderung der unspezifischen Bindung der primären und sekundären Antikörper binden.
Um Antikörper Marktdurchdringung zu erreichen, muss das Gewebe permeabilized. Dies lässt sich mit Reinigungsmitteln oder denaturierenden Lösungsmittel aber muss optimiert werden, um die Antigen-Epitop zu bewahren. Unser Protokoll verwendet eine Kombination von Triton und Dimethyl Sulfoxid (DMSO). Triton und DMSO sind jeweils während der Sperrung und Antikörper Inkubationszeit Schritte bei Konzentrationen von 0,5 % und 1 % enthalten. Mit dieser Konzentration, haben wir beobachtet Färbung im Gehirn, Bauchspeicheldrüse, Darm und Muskeln, was darauf hindeutet, dass es wahrscheinlich effektiver für die Durchdringung aller Gewebe ist. Fischgröße kann eindringen auch beeinflusst werden. Dieses Protokoll wurde nicht auf Fische, die größer als 14 Tage alt (ca. 7 mm in der Länge) getestet. Um Fleckenbildung zu beheben, empfiehlt es sich, die Fixierung, blockieren und Antikörper eindringen Schritte ändern. Es ist auch wichtig, die Reihenfolge Erhaltung die Immunogen mit A. Mexicanus Proteins des Interesses unter Verwendung der verfügbaren Genom-25zu untersuchen.
A. Mexicanus ist ein hervorragendes Modell, Entwicklung zu untersuchen, wie Populationen der gleichen Art, die in völlig unterschiedlichen Umgebungen entwickelt haben im Labor direkt verglichen werden können. Standard Tierhaltung Protokolle, sowohl innerhalb als auch zwischen Labors, sind für das Verständnis der biologischen Unterschiede zwischen Oberfläche Fisch und Cavefish. Unsere Artikel stellt eine Methode zur Entwicklung und Genaktivität in Post-Larven Fische ausgesetzt, stetiges Wachstumsparameter zu untersuchen.

Die mexikanische Tetra ist Astyanax Mexicanus, einer einzigen Art von Fisch, die als Fluss lebende Populationen (Oberfläche Fisch) vorhanden ist und eine Reihe von höhlenbewohnenden Populationen (Cavefish) benannt nach den von die ihnen bewohnten Höhlen (d. h. Tinaja, Molino, Pachón). Eine wachsende Zahl der Forscher verwenden A. Mexicanus , um die genetischen und Entwicklungsstörungen Grundlagen der Verhaltenstherapie1,2,3,4, metabolische5,6 untersuchen ,7,8und morphologischen Evolution9,10,11. Verfügbare Ressourcen für Studien von A. Mexicanus gehören ein Genom sequenziert und annotiert12; Transkriptom-13; Developmental staging Tabelle14; und Methoden für die Zucht von15,16,17, Erstellen von gentechnisch veränderten Pflanzen18, und Gene19bearbeiten. Verbreitung von Zusatztools und aktualisierte Standardprotokolle beschleunigt Wachstum der Forschungsgemeinschaft Cavefish (siehe diese Methoden Sammlung20).
Unser Ziel ist es, um das bestehende Repertoire von Tools hinzufügen, indem Sie eine robuste Methode zur Bewertung von Gen-Aktivität in Situ in Post-Larven A. Mexicanus, in gewissem Sinne zwischen Labors vergleichbar. Es gibt zwei Herausforderungen zur Erreichung dieses Ziels. Erstens gibt es eine Notwendigkeit für standardisierte Regelungen für das Ausbrüten und erhöhen die Fische zwischen Labors, wie Unterschiede in den Parametern wie Fütterung und Dichte beeinflussen Wachstum und Reifung, damit Auswirkungen auf die Aktivität der Gene. Zweitens gibt es eine Notwendigkeit für eine standardisierte aber anpassungsfähige Methode für die Prüfung der Muster der Genaktivität in der Post-Larven Fisch. Wir gehen diesen Fragen hier, Einführung standard Praktiken zum Fisch zu Post-Larvenstadien anheben und eine robuste ganz-Mount Immunhistochemie (IHC) Protokoll für die Beurteilung der Genexpression in A. MexicanusEinführung.
Wir führen zunächst durch natürliche laichen die Fische züchten und befruchtete Eier zu identifizieren. Beschrieben weiter ist, wie man befruchtete Eier (Larven) schlüpfen und übertragen Sie sie auf Kindergarten Container, wo sie sind bei einer Dichte von 20 Fische pro Container für zwei Wochen gedacht ohne Rezirkulation oder das Wasser zu wechseln. Bei 5-Tage Post Befruchtung der Fisch entwickelt, um einen Post-Larvenstadien (nicht mehr mit einer Eigelb-Versorgung) und dienen als eine nährstoffreiche Nahrungsquelle, die keinen täglichen Nachschub benötigen Algen gefüttert Brachionus Plicatilis (Rädertierchen). Diese Methode bietet konsistente Wachstumsparameter für Larven und Post-larvale Entwicklung.
Genfunktion bewerten, demonstrieren wir entfernen die Fische vom Kindergarten Container und vollständig-hängen IHC durchführen. Die IHC-Methode vorgestellt wird von Protokollen entwickelt für den Einsatz mit Danio Rerio21 angepasst und ist wirksam für die Prüfung von Antigenen in allen A. Mexicanus Geweben getestet, einschließlich Gehirn, Darm und Bauchspeicheldrüse. IHC ist eine schnellere Alternative zur Erzeugung transgener Tiere zur Untersuchung der Genexpression und Protein-Lokalisierung. Dieses Protokoll wird für Studien, die darauf abzielen, A. Mexicanus wächst und vergleichen die Phänotypen der Oberfläche Fischen und Cavefish bei Post-Larvenstadien nützlich sein.

<table><tbody><tr><td>Methylenblau</td><td>Kordon</td><td>B016CBHZUS</td><td>Antimykotikum</td></tr><tr><td></td><td>Heizung Finnex</td><td>4711457836017</td><td>100W Digital Control Heizung</td></tr><tr><td>Ausströmer</td><td>Lee's Aquarium & Haustierprodukte</td><td>10838125202</td><td>Einweg-Ausströmersalz</td></tr><tr><td></td><td>Instant Ocean</td><td>51378014021</td><td>Meersalz</td></tr><tr><td>Kinderzimmerbehälter</td><td>IPC</td><td>21545-002</td><td>40 oz oder 1,5 l durchsichtige Behälter</td></tr><tr><td>Transferpipette</td><td>VWR</td><td>414004-002</td><td>Kunststoffkolbenpipetten</td></tr><tr><td>Kompaktkultursystem (CCS) Starterkit mit Brachionus plicatilis (L-Typ) Rädertierchen</td><td>Schilf-Marikultur</td><td>na</td><td>Fischfutter</td></tr><tr><td>RGcomplete</td><td>APBreed</td><td>817656016572</td><td>32 oz Flasche Rädertierfutter</td></tr><tr><td>Programmierbare automatische Dosierpumpe DP-4</td><td>Jebao</td><td>DP-4</td><td>automatische Fütterung für Rädertierchen</td></tr><tr><td>Tricane-S</td><td>Western Chemical</td><td>MS 222</td><td>Fischanästhetikum</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761-500G</td><td>für Tricanlösung</td></tr><tr><td>Nylonnetz Sieb</td><td>HIC (Harold Import Co.)</td><td>735343476235</td> Formalinlösung <td>mit einem Durchmesser von 3 Zoll</td></tr><tr><td>, neutral gepuffert, 10%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128-4L</td><td>Fixiermittel</td></tr><tr><td>10X PBS</td><td>Invitrogen</td><td>AM9625</td><td>Puffer, verdünnt auf 1X mit destilliertem Wasser</td></tr><tr><td>Triton-x 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787-250ML</td><td>Reinigungsmittel</td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002-25G</td><td></td></tr> <tr>antibakteriell<td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647-100G</td><td>Blockierungsreagenzglasfläschchen</td></tr><tr><td>mit Schraubverschluss 4 mL</td><td>Wheaton</td><td>224742</td><td>Färbefläschchen</td></tr><tr><td>Kunststoffgitter für Zuchtbecken</td><td>Pentair</td><td>N1670</td><td>Schneiden Sie in ein Rechteck, das an allen Kanten 6 mm größer ist als die Abmessungen des Bodens des Zuchtbeckens. Schneide aus jeder Ecke des Rechtecks ein 6 mm großes Quadrat aus. Biegen Sie die Ränder des Bildschirms entlang aller vier Kanten nach unten. Platzieren Sie ein Paar 6 mm vinylbeschichtete Scheibenmagnete auf beiden Seiten (oben und unten) des Netzes an jeder Ecke. Das Sieb sollte so eng wie möglich an den Seiten des Tanks anliegen. Das Sieb kann mit einem Fischnetz aus Metall aus dem Tank entfernt werden.</td></tr><tr><td>Vinylbeschichtete Scheibenmagnete</td><td>Kjmagnets</td><td>D84PC-AST</td><td></td></tr><tr><td>New Life Spectrum Thera-A Pellet Fischfutter</td><td>New Life International</td><td>na</td><td>Adult Fischfutter. Eine Liste der Einzelhändler für dieses Produkt finden Sie auf der Website des Unternehmens</td></tr><tr><td>Antibodies</td>insulin Antikörper aus Meerschweinchen Dako A0564 1:200 Glucagon-Antikörper aus Schaf Abcam ab36215 1:200 acetylierter Tubulin-Antikörper aus Maus Sigma T6793 1:500 HuD/HuC-Antikörper <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>aus Maus</td><td>Life Technologies</td><td>A-21271</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Stickstoffmonoxid-Synthase (nNOS)-Antikörper aus Kaninchen</td><td></td><td>Abcam ab106417</td><td>5&mu; g/mL</td></tr><tr><td>Cholinacetyltransferase (ChAT) aus Kaninchen</td><td>Abcam</td><td>ab178850</td><td>1:2000</td></tr><tr><td>Seratonin (5HT) aus Kaninchen</td><td>Immunostar</td><td>20080</td><td>1:500</td></tr></tbody></table>

anhebung der mexikanischen tetra astyanax mexicanus für analyse der post-larval phänotypen und vollständig-hängen immunohistochemistry

Raising the Mexican Tetra Astyanax mexicanus for Analysis of Post-larval Phenotypes and Whole-mount Immunohistochemistry

Fluss und Höhle angepasste Populationen von Astyanax Mexicanus zeigen Unterschiede in der Morphologie, Physiologie und Verhalten. Forschung konzentrierte sich auf den Vergleich von adulten Forms hat die genetische Grundlage für einige dieser Unterschiede ergeben. Weniger bekannt ist, über die Unterschiede zwischen der Bevölkerungen bei Post-Larvenstadien (zu Beginn der Fütterung). Solche Studien können Einblick in wie Cavefish bis ins Erwachsenenalter in ihrer natürlichen Umgebung zu überleben. Methoden zum Vergleichen von Post-Larvalentwicklung im Labor erfordern standardisierte Aquakultur und Fütterung Regime. Hier beschreiben wir, wie Fisch auf eine Diät von nährstoffreichen Rädertierchen nicht Rezirkulation Wasser für bis zu zwei Wochen Post Befruchtung zu erhöhen. Wir zeigen, wie Post-Larven Fisch aus diesem Kindergarten-System zu sammeln und ganz-Mount Immunostaining durchführen. Immunostaining ist eine attraktive Alternative zu Transgen Expressionsanalyse für die Untersuchung von Entwicklung und Genfunktion in A. Mexicanus. Die Baumschule-Methode dient auch als ein standard-Protokoll für die Festlegung Dichte abgestimmt Bevölkerung Wachstum zu Erwachsenen.

Tabelle 1 zeigt Erfolg von Zucht Oberfläche Fische und Tinaja, Molino und Pachón Cavefish in statischen Zucht Becken in einem Jahr. Oberfläche und Pachón laicht mit befruchteten Embryonen immer produziert geschlüpft Larven, während Molino und Tinaja erfolglos einige Zeit (2/6 und 2/18 Veranstaltungen laichen nicht geschlüpfte Larven bzw. produzieren). Es gibt Unterschiede in der Kupplung Größe, das Alter der Eltern Fische zugeschrieben werden nicht angezeigt wird. Tabelle 2 zeigt die Gesamtzahl der geschlüpften Larven resultierend aus einer laichen Veranstaltungen, und das Alter der Eltern Fische. Im Allgemeinen fanden wir, dass die Oberfläche Fische produzieren die größte Anzahl von Larven pro Spawn (durchschnittlich 1.550 ± 894, n = 5), gefolgt von Pachón (durchschnittliche 879 ± 680, n = 6), Tinaja (durchschnittliche 570 ± 373, n = 11), und Molino (durchschnittlich 386 ± 276, n = 3). Die Anzahl der Larven produziert wird in der Regel mehr als pro-Experiment oder für Wachstum zu Erwachsenen erforderlich sind. Wir in der Regel 6-18 Kindergarten Container (120-360 Larven) und die restlichen Fische einzuschläfern.
Um den Erfolg des Protokolls Kindergarten messen verzeichneten wir die Anzahl der geschlüpften Larven und Überlebenden nach dem Larvenstadium Fisch aus erfolgreichen Laichen Veranstaltungen. Tabelle 3 zeigt die Daten von 1 Monat der Zucht im Umluftbetrieb Panzer und enthält die Anzahl der Larven auf Kindergarten-Container, die bis 14 Dpf überlebt übertragen. In diesem Monat reichte die Überlebensrate von 41-81 Prozent in 65-293 Fisch pro Einwohner für Experimente oder Wachstum zu Erwachsenen zur Verfügung.
Um festzustellen, ob ganze-Mount Immunostaining erfolgreich ist, verglichen wir die Fluoreszenz der Proben inkubiert mit Primärantikörper für diejenigen mit nur Sekundärantikörper inkubiert. Das Fluoreszenzsignal ist nur sichtbar in den Fischen mit Primärantikörper inkubiert. Wir haben dieses Protokoll verwendet, um erfolgreich beschriften Neuronen10 (Abbildung 1) und Zellen der Bauchspeicheldrüse6 in Phasen bis zu 12,5 Dpf in beiden Oberfläche und Höhle Morphotypen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58972/58972fig1.jpg"> Abbildung 1: Neuron Kennzeichnung. Vollständig-hängen Immunostaining von A. Mexicanus. Bild von 12,5 Dpf Oberfläche Fischen (ein) und Pachón Cavefish (b). Bild von der mittleren Körperregion [geschlüpften gelben Umriss angezeigt (a) und (b)] Oberfläche Fische (c) und Pachón Cavefish (d) gebeizt mit Pan-neuronale Antikörper (Hu). (e) Confocal Bild einer Region von der Oberfläche Fischen Darm zeigen enterische Neurone (Hu) und deren Projektionen (Schimmelpilzschäden Tubulin). Für dieses Bild war Darm seziert und montiert im Medium mit DAPI um die Kerne zu beflecken. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58972/58972fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Bevölkerung</td>
			<td>Versuche</td>
			<td>laichen Veranstaltungen</td>
			<td>Kupplungen</td>
		</tr>
<tr>
<td>Oberfläche</td>
			<td>94</td>
			<td>23</td>
			<td>23</td>
		</tr>
<tr>
<td>Molino</td>
			<td>110</td>
			<td>6</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pachón</td>
			<td>167</td>
			<td>13</td>
			<td>13</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tinaja</td>
			<td>242</td>
			<td>18</td>
			<td>16</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Zusammenfassung der Daten aus einem Jahr der Zucht A. Mexicanus in statischen Panzer. Anzahl der Zucht versucht, durch Veranstaltungen, laichen und Anzahl der Ereignisse, die erzeugt Laichen geschlüpften Larven.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Bevölkerung</td>
			<td>Eltern Alter</td>
			<td>geschlüpften Larven</td>
		</tr>
<tr>
<td>Oberfläche</td>
			<td>1 Jahr</td>
			<td>989</td>
		</tr>
<tr>
<td>Oberfläche</td>
			<td>1 Jahr</td>
			<td>1050</td>
		</tr>
<tr>
<td>Oberfläche</td>
			<td>3 Jahre</td>
			<td>2214</td>
		</tr>
<tr>
<td>Oberfläche</td>
			<td>3 Jahre</td>
			<td>432</td>
		</tr>
<tr>
<td>Oberfläche</td>
			<td>3 Jahre</td>
			<td>1768</td>
		</tr>
<tr>
<td>Oberfläche</td>
			<td>4 Jahre</td>
			<td>2852</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pachón</td>
			<td>1 Jahr</td>
			<td>1194</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pachón</td>
			<td>1 Jahr</td>
			<td>1933</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pachón</td>
			<td>1,5 Jahre</td>
			<td>371</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pachón</td>
			<td>3 Jahre</td>
			<td>480</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pachón</td>
			<td>4 Jahre</td>
			<td>1190</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pachón</td>
			<td>4 Jahre</td>
			<td>110</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tinaja</td>
			<td>9 Monate</td>
			<td>259</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tinaja</td>
			<td>9 Monate</td>
			<td>253</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tinaja</td>
			<td>10 Monate</td>
			<td>1100</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tinaja</td>
			<td>11 Monate</td>
			<td>857</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tinaja</td>
			<td>1 Jahr</td>
			<td>713</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tinaja</td>
			<td>1 Jahr</td>
			<td>853</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tinaja</td>
			<td>1 Jahr</td>
			<td>542</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tinaja</td>
			<td>1,5 Jahre</td>
			<td>360</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tinaja</td>
			<td>1,5 Jahre</td>
			<td>58</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tinaja</td>
			<td>1,5 Jahre</td>
			<td>1100</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tinaja</td>
			<td>4 Jahre</td>
			<td>185</td>
		</tr>
<tr>
<td>Molino</td>
			<td>2,5 Jahre</td>
			<td>460</td>
		</tr>
<tr>
<td>Molino</td>
			<td>2,5 Jahre</td>
			<td>619</td>
		</tr>
<tr>
<td>Molino</td>
			<td>3 Jahre</td>
			<td>81</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 2: ungefähre Alter der Frau und Zahl der geschlüpften Larven von Laich Einzelveranstaltungen aus den angegebenen Populationen von A. Mexicanus.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Bevölkerung</td>
			<td>Versuche</td>
			<td>laichen Veranstaltungen</td>
			<td>Kupplungen</td>
			<td>Gelegegrösse</td>
			<td>Larven ins Kinderzimmer Tassen</td>
			<td>nach dem Larvenstadium Fisch am 14dpf</td>
			<td>Überleben (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Oberfläche</td>
			<td>4</td>
			<td>3</td>
			<td>2</td>
			<td>576 &amp; 1728</td>
			<td>360</td>
			<td>174</td>
			<td>48</td>
		</tr>
<tr>
<td>Molino</td>
			<td>4</td>
			<td>2</td>
			<td>1</td>
			<td>228</td>
			<td>159</td>
			<td>65</td>
			<td>41</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tinaja</td>
			<td>4</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1952</td>
			<td>175</td>
			<td>93</td>
			<td>53</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pachón</td>
			<td>4</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1696</td>
			<td>360</td>
			<td>293</td>
			<td>81</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 3: Zusammenfassung der Daten von einem Monat A. Mexicanus in einem umlaufenden System und erhöhen die Larven Zucht. Anzahl der Versuche, was Zucht Kupplungen laichen Veranstaltungen, die geschlüpfte Larven, durchschnittliche Anzahl der Larven pro Gelege, Larven übertragen für den Kindergarten Container und Post-Larven Fische im Kindergarten Container nach 14 Tagen produziert.

In diesem Protokoll wir zeigen, wie Astyanax Mexicanus Erwachsene zu züchten, die Larven zu erhöhen, und ganze-Mount Immunohistochemistry auf Post-Larven Fische zu vergleichen die Phänotypen der Oberfläche und Höhle Morphotypen führen.

Anhebung der mexikanischen Tetra Astyanax Mexicanus für Analyse der Post-larval Phänotypen und vollständig-hängen Immunohistochemistry

River and cave-adapted populations of Astyanax mexicanus show differences in morphology, physiology, and behavior. Research focused on comparing adult ...

Hier zeigen wir, wie man den mexikanischen Tetra Astyanax Mexicanus züchtet, die Larven aufzieht und eine ganzwertige Immunhistochemie an Postlarvenfischen durchführt, um die Phänotypen von Fluss- und Höhlenfischen zu vergleichen. Wir züchten die Fische mit der gleichen Dichte auf einer nährstoffreichen Ernährung von Fäifern. Diese Technik sorgt für gleichbleibendes Wachstum und bietet Vorteile in Bezug auf Kosten, Biosicherheit und Wasserqualität.Um zu beginnen, legen Sie ein Kunststoffgewebe in den Boden eines Fünf-Gallonen-Tanks. Dann füllen Sie den Tank mit fischfertigem Wasser. Befestigen Sie einen Warmwasserbereiter an der Seite des Tanks.Fügen Sie ein Weibchen und zwei männliche Astyanax Mexicanus Fische, die mehr als ein Jahr alt sind, in den Tank. Stellen Sie die Temperatur des Warmwasserbereiters auf 24 Grad Celsius ein. Nach 24 Stunden, erhöhen Sie die Temperatur um ein Grad Celsius.Leuchten Sie jeden Tag eine Taschenlampe in den Boden des Tanks, um nach Eiern zu suchen. Sobald die Eier im Zuchtbecken identifiziert sind, entfernen Sie die erwachsenen Fische und das Plastikgitter. Verwenden Sie ein Becherglas, um die Wassertiefe auf 10 cm zu reduzieren.Um den Zeitpunkt der Befruchtung abzuschätzen, verwenden Sie eine Transferpipette, um mehrere Eier in eine Petrischale zu legen und sie mit einem Stereomikroskop zu betrachten, um ihr Stadium zu bestimmen. Entfernen Sie undurchsichtige Eier oder Kot. Dann füllen Sie den Tank mit fischfertigem Wasser und fügen Sie sieben Tropfen Methylenblau ins Wasser.Danach eine Heizung und eine Aquarienblase in den Tank geben. Stellen Sie die Heizung auf 24 Grad Celsius ein und stellen Sie den Luftstromregler ein, um einen sanften Blasenstrom zu erzeugen. Dann bedecken Sie den Tank, um die Wassertemperatur zu halten.20 Gramm Salz in acht Liter Fischbereites Wasser geben und rühren, bis es aufgelöst ist. Dann fügen Sie einen Liter des vorbereiteten Wassers zu jedem Kindergartenbehälter hinzu. Als nächstes verwenden Sie eine Transferpipette, um 20 der geschlüpften Larven in jeden Kinderzimmerbehälter zu bewegen.Rühre das Wasser im größeren Tank, um sicherzustellen, dass alle Larven entfernt wurden. Um das Fischfutter zuzubereiten, fügen Sie drei ml Algenmischung zu einem Liter geernteter Fälscher hinzu. Fünf Tage nach der Düngung fügen Sie drei ml fischfutter in jeden Kinderkübel.Die Fäulnissollten in dichten Gruppen an der Ecke der Container sichtbar sein, es sei denn, sie sind in der Nähe der Mitte sichtbar. Überprüfen Sie den Behälter auf Fäder jeden Tag und fügen Sie mehr Nahrung hinzu, wenn die Konzentration erschöpft ist. Entfernen Sie alle toten Larven.Zuerst, um den Magen-Darm-Trakt von Lebensmitteln zu löschen, gießen Sie den Kinderzimmerbehälter mit den Fischen des gewünschten Alters durch ein Nylon-Mesh-Sieb. Legen Sie das Sieb in einen Behälter mit sauberem Fischbereitwasser und halten Sie Lebensmittel für 24 Stunden zurück. Nach der Einschläfernisierung der Fische, nach den institutionellen Richtlinien, verwenden Sie eine Transferpipette, um den Fisch in ein konisches Rohr zu übertragen.Ersetzen Sie die Euthanasielösung durch fixative. Und bebrüten die Röhre mit Schaukeln über Nacht bei 4 Grad Celsius. Entfernen Sie danach das Fixativ und ersetzen Sie es durch PBST.Inkubieren Sie die Röhre für weitere 15 Minuten mit Schaukeln. Und wiederholen Sie den Waschvorgang noch einmal. Als nächstes verwenden Sie eine Transferpipette, um den Fisch auf eine vier ml Glasdurchstechflasche mit einer Schraubkappe zu bewegen.Entfernen Sie den PBST aus der Durchstechflasche und fügen Sie drei ml Blockierlösung hinzu. Die Durchstechflasche bei Raumtemperatur eine Stunde lang mit Schaukeln bebrüten. Danach verwenden Sie eine Transferpipette, um die Blockierlösung zu entfernen und durch primären Antikörper zu ersetzen, der in einer Blockierlösung verdünnt wird.Inkubieren Sie die Durchstechflasche über Nacht bei Raumtemperatur mit Rührung. Als nächstes waschen Sie den Fisch mit PBST dreimal, wie zuvor beschrieben. Ersetzen Sie den PBST durch sekundären Antikörper, der in einer Blockierenden Lösung verdünnt wird.Und die Durchstechflasche über Nacht bei Raumtemperatur mit Rührung bebrüten. Schließlich waschen Sie den Fisch dreimal für 15 Minuten mit PBST. Mit diesem Protokoll wurden Oberflächenfische Tinaja, Molino und Pachon Höhlenfische in statischen Zuchtbecken gezüchtet.Die Oberfläche und Pachon laichen, mit befruchteten Embryonen, produzierten immer geschlüpfte Larven. Während die Molino und Tinaja waren einige der Zeit erfolglos. Im Allgemeinen produzierten Oberflächenfische die größte Anzahl von Larven pro Laich, gefolgt von Pachon, Tinaja und Molino.Die ganzheitliche Immunfärbungstechnik wurde erfolgreich eingesetzt, um Neuronen und Bauchspeicheldrüsenzellen in Stadien bis zu 12,5 Tagen nach der Befruchtung zu kennzeichnen. Es ist wichtig, alle toten Fische zu entfernen, während Sie die Larven erhöhen und die Anzahl der überlebenden Fische aufzeichnen. Wenn viele Fische sterben, kann dies an einer bakteriellen oder Pilzkontamination verursacht werden.Tanks sollten vor der Verwendung mit 70% Ethanol sterilisiert werden. Die von uns beschriebene Immunostaining-Technik wurde erfolgreich für die in der Materialtabelle aufgeführten Antikörper eingesetzt. Nach der Immunostainierung können Fische ganz montiert oder geschnitten werden, um jedes Gewebe von Interesse zu sehen.In Kombination bieten das Züchtungs-, Brut- und Immunstainierungsverfahren eine robuste Methode zur Beurteilung der Genaktivität NC2 in einer zwischen Laboratorien vergleichbaren Weise.

raising-mexican-tetra-astyanax-mexicanus-for-analysis-post-larval

Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Gene-Targeting-Mutagenese ist nun möglich, in einem breiten Spektrum von Organismen unter Verwendung von Genom Bearbeitungstechniken. Hier zeigen wir ein Protokoll für eine gezielte Genmutagenese mit Talens (Talens) in Astyanax mexicanus, Fischarten , die Oberflächenfische und cavefish enthält.

Genome Editing in<em&gt; Astyanax mexicanus</em&gt; Verwendung von Transkriptionsaktivator- artigen Effektor Nukleasen (Talens)

Abbilden der Morphogenese von Insekten Embryonen mit Lichtbogen basierende Fluoreszenzmikroskopie wurde Stand der Technik geworden. Dieses Protokoll beschreibt und vergleicht drei Befestigungstechniken geeignet für Tribolium castaneum Embryonen führt zwei neue maßgeschneiderte transgenen Linien gut geeignet für die Echtzeit- Bildgebung, diskutiert wesentliche Qualitätskontrollen und zeigt den aktuellen experimentellen Beschränkungen.

Lichtblatt-basierte Fluoreszenzmikroskopie lebender oder fixiert und gefärbt<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; Embry

Immunolabeling Methoden für die unterschiedliche Populationen von Mikrotubuli in das sich entwickelnde Gehirn Zebrafisch Analyse werden hier beschrieben, die sind breit anwendbar auf andere Gewebe. Das erste Protokoll beschreibt eine optimierte Methode für Immunolabeling stabile und dynamische Mikrotubuli. Das zweite Protokoll stellt eine Methode zum Bild und speziell im Entstehen begriffenen Mikrotubuli zu quantifizieren.

Verwendung von Immunolabeling, stabilen, dynamischen und im Entstehen begriffene Mikrotubuli in Zebrafish Embryos zu analysieren

Wir beschreiben Ansätze für die Manipulation von Genen im evolutionären Modellsystem Astyanax Mexicanus. Drei verschiedene Techniken beschrieben: Tol2-vermittelte Transgenese, gezielte Manipulation des Genoms mit CRISPR/Cas9 und Zuschlag des Ausdrucks mit Morpholinos. Diese Tools sollten die direkte Untersuchung von Genen zugrunde liegen die Unterschiede zwischen Oberfläche und höhlenbewohnenden Formen erleichtern.

Manipulation der Genfunktion in mexikanischen Cavefish

Hier präsentieren wir Methoden für Hochdurchsatz-Studie eine Reihe von mexikanischen Cavefish, Verhaltensweisen und lebenswichtigen Färbung eines Mechanosensory-Systems. Diese Methoden nutzen freier Software und kundenspezifische Skripte, bietet eine praktische und kostengünstige Methode für das Studium des Verhaltens.

Verhaltens-Tracking und Neuromast Darstellung der mexikanischen Cavefish

Dieses Protokoll ermöglicht die Visualisierung der Genexpression in embryonalen Astyanax Cavefish. Dieser Ansatz wurde mit dem Ziel der Maximierung der gen-Expression-Signal, bei gleichzeitiger Minimierung der unspezifischen Hintergrundfärbung entwickelt.

Wholemount In Situ Hybridisierung für Astyanax Embryonen

Die In-vitro-Fertilisation ist eine häufig verwendete Technik mit einer Vielzahl von Modellorganismen, um Laborpopulationen zu erhalten und synchronisierte Embryonen für nachgelagerte Anwendungen zu produzieren. Hier präsentieren wir ein Protokoll, das diese Technik für verschiedene Populationen des mexikanischen Tetrafisches Astyanax mexicanusumsetzt.

Gamete Collection und In-Vitro-Fertilisation von Astyanax mexicanus

Dieser Artikel beschreibt die grundlegenden Laborbedingungen und Protokolle für ein inkrementelles Temperaturregime zur Stimulierung des maximalen Laichens beim mexikanischen Salmler Astyanax mexicanus, einem aufstrebenden Modell für Entwicklungs- und Evolutionsstudien.

Inkrementelle Temperaturänderungen für maximale Brut und Laichzeit bei Astyanax mexicanus

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Aufzuchtmethode von tortriciden Schädlingsinsekten in den Laboratorien. Die Verfahren zur Unterscheidung des Geschlechts von Insekten und zum Extrahieren von Nukleinsäuren für die Hochdurchsatzsequenzierung werden unter Verwendung von zwei Tortricid-Schädlingen festgelegt.

Massenaufzucht und molekulare Studien an Tortricidae-Schädlingen

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die funktionelle Charakterisierung von Gen- und Promotorkonstrukten im sekundären Stammgewebe von Bäumen mit mittlerem bis hohem Durchsatz innerhalb vergleichsweise kurzer Zeiträume ermöglicht. Es ist effizient, einfach zu bedienen und vielseitig einsetzbar für eine Reihe von Baumarten.

Die Verwendung von Induced Somatic Sektoranalyse (IVSS) in Holzbildung und Nebenschaft Entwicklung beteiligten Gene und Promotoren Studieren

Erfahren Sie die Aufzucht von Astyanax mexicanus zur Analyse postlarvaler Phänotypen mittels Ganzpräparat-Immunhistochemie. Diese Methode ermöglicht vergleichende Studien zwischen Fluss- und Höhlenmorphotypen.

Anhebung der mexikanischen Tetra Astyanax Mexicanus für Analyse der Post-larval Phänotypen und vollständig-hängen Immunohistochemistry (Video) | JoVE Journal

Anhebung der mexikanischen Tetra Astyanax Mexicanus für Analyse der Post-larval Phänotypen und vollständig-hängen Immunohistochemistry

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