Anhebung der mexikanischen Tetra Astyanax Mexicanus für Analyse der Post-larval Phänotypen und vollständig-hängen Immunohistochemistry
December 28th, 2018
In diesem Protokoll wir zeigen, wie Astyanax Mexicanus Erwachsene zu züchten, die Larven zu erhöhen, und ganze-Mount Immunohistochemistry auf Post-Larven Fische zu vergleichen die Phänotypen der Oberfläche und Höhle Morphotypen führen.
Hier zeigen wir, wie man den mexikanischen Tetra Astyanax Mexicanus züchtet, die Larven aufzieht und eine ganzwertige Immunhistochemie an Postlarvenfischen durchführt, um die Phänotypen von Fluss- und Höhlenfischen zu vergleichen. Wir züchten die Fische mit der gleichen Dichte auf einer nährstoffreichen Ernährung von Fäifern. Diese Technik sorgt für gleichbleibendes Wachstum und bietet Vorteile in Bezug auf Kosten, Biosicherheit und Wasserqualität.
Um zu beginnen, legen Sie ein Kunststoffgewebe in den Boden eines Fünf-Gallonen-Tanks. Dann füllen Sie den Tank mit fischfertigem Wasser. Befestigen Sie einen Warmwasserbereiter an der Seite des Tanks.
Fügen Sie ein Weibchen und zwei männliche Astyanax Mexicanus Fische, die mehr als ein Jahr alt sind, in den Tank. Stellen Sie die Temperatur des Warmwasserbereiters auf 24 Grad Celsius ein. Nach 24 Stunden, erhöhen Sie die Temperatur um ein Grad Celsius.
Leuchten Sie jeden Tag eine Taschenlampe in den Boden des Tanks, um nach Eiern zu suchen. Sobald die Eier im Zuchtbecken identifiziert sind, entfernen Sie die erwachsenen Fische und das Plastikgitter. Verwenden Sie ein Becherglas, um die Wassertiefe auf 10 cm zu reduzieren.
Um den Zeitpunkt der Befruchtung abzuschätzen, verwenden Sie eine Transferpipette, um mehrere Eier in eine Petrischale zu legen und sie mit einem Stereomikroskop zu betrachten, um ihr Stadium zu bestimmen. Entfernen Sie undurchsichtige Eier oder Kot. Dann füllen Sie den Tank mit fischfertigem Wasser und fügen Sie sieben Tropfen Methylenblau ins Wasser.
Danach eine Heizung und eine Aquarienblase in den Tank geben. Stellen Sie die Heizung auf 24 Grad Celsius ein und stellen Sie den Luftstromregler ein, um einen sanften Blasenstrom zu erzeugen. Dann bedecken Sie den Tank, um die Wassertemperatur zu halten.
20 Gramm Salz in acht Liter Fischbereites Wasser geben und rühren, bis es aufgelöst ist. Dann fügen Sie einen Liter des vorbereiteten Wassers zu jedem Kindergartenbehälter hinzu. Als nächstes verwenden Sie eine Transferpipette, um 20 der geschlüpften Larven in jeden Kinderzimmerbehälter zu bewegen.
Rühre das Wasser im größeren Tank, um sicherzustellen, dass alle Larven entfernt wurden. Um das Fischfutter zuzubereiten, fügen Sie drei ml Algenmischung zu einem Liter geernteter Fälscher hinzu. Fünf Tage nach der Düngung fügen Sie drei ml fischfutter in jeden Kinderkübel.
Die Fäulnissollten in dichten Gruppen an der Ecke der Container sichtbar sein, es sei denn, sie sind in der Nähe der Mitte sichtbar. Überprüfen Sie den Behälter auf Fäder jeden Tag und fügen Sie mehr Nahrung hinzu, wenn die Konzentration erschöpft ist. Entfernen Sie alle toten Larven.
Zuerst, um den Magen-Darm-Trakt von Lebensmitteln zu löschen, gießen Sie den Kinderzimmerbehälter mit den Fischen des gewünschten Alters durch ein Nylon-Mesh-Sieb. Legen Sie das Sieb in einen Behälter mit sauberem Fischbereitwasser und halten Sie Lebensmittel für 24 Stunden zurück. Nach der Einschläfernisierung der Fische, nach den institutionellen Richtlinien, verwenden Sie eine Transferpipette, um den Fisch in ein konisches Rohr zu übertragen.
Ersetzen Sie die Euthanasielösung durch fixative. Und bebrüten die Röhre mit Schaukeln über Nacht bei 4 Grad Celsius. Entfernen Sie danach das Fixativ und ersetzen Sie es durch PBST.
Inkubieren Sie die Röhre für weitere 15 Minuten mit Schaukeln. Und wiederholen Sie den Waschvorgang noch einmal. Als nächstes verwenden Sie eine Transferpipette, um den Fisch auf eine vier ml Glasdurchstechflasche mit einer Schraubkappe zu bewegen.
Entfernen Sie den PBST aus der Durchstechflasche und fügen Sie drei ml Blockierlösung hinzu. Die Durchstechflasche bei Raumtemperatur eine Stunde lang mit Schaukeln bebrüten. Danach verwenden Sie eine Transferpipette, um die Blockierlösung zu entfernen und durch primären Antikörper zu ersetzen, der in einer Blockierlösung verdünnt wird.
Inkubieren Sie die Durchstechflasche über Nacht bei Raumtemperatur mit Rührung. Als nächstes waschen Sie den Fisch mit PBST dreimal, wie zuvor beschrieben. Ersetzen Sie den PBST durch sekundären Antikörper, der in einer Blockierenden Lösung verdünnt wird.
Und die Durchstechflasche über Nacht bei Raumtemperatur mit Rührung bebrüten. Schließlich waschen Sie den Fisch dreimal für 15 Minuten mit PBST. Mit diesem Protokoll wurden Oberflächenfische Tinaja, Molino und Pachon Höhlenfische in statischen Zuchtbecken gezüchtet.
Die Oberfläche und Pachon laichen, mit befruchteten Embryonen, produzierten immer geschlüpfte Larven. Während die Molino und Tinaja waren einige der Zeit erfolglos. Im Allgemeinen produzierten Oberflächenfische die größte Anzahl von Larven pro Laich, gefolgt von Pachon, Tinaja und Molino.
Die ganzheitliche Immunfärbungstechnik wurde erfolgreich eingesetzt, um Neuronen und Bauchspeicheldrüsenzellen in Stadien bis zu 12,5 Tagen nach der Befruchtung zu kennzeichnen. Es ist wichtig, alle toten Fische zu entfernen, während Sie die Larven erhöhen und die Anzahl der überlebenden Fische aufzeichnen. Wenn viele Fische sterben, kann dies an einer bakteriellen oder Pilzkontamination verursacht werden.
Tanks sollten vor der Verwendung mit 70% Ethanol sterilisiert werden. Die von uns beschriebene Immunostaining-Technik wurde erfolgreich für die in der Materialtabelle aufgeführten Antikörper eingesetzt. Nach der Immunostainierung können Fische ganz montiert oder geschnitten werden, um jedes Gewebe von Interesse zu sehen.
In Kombination bieten das Züchtungs-, Brut- und Immunstainierungsverfahren eine robuste Methode zur Beurteilung der Genaktivität NC2 in einer zwischen Laboratorien vergleichbaren Weise.
Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt die Zucht von Astyanax mexicanus Erwachsenen, das Aufziehen von Larven und die Durchführung von Whole-Mount-Immunhistochemie an post-larvalen Fischen. Die Studie vergleicht die Phänotypen von Oberflächen- und Höhlenmorphotypen.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaft
- Entwicklungsbiologie
- Vergleichende Morphologie
Hintergrund
- Astyanax mexicanus zeigt deutliche Oberflächen- und Höhlenmorphotypen.
- Das Verständnis phänotypischer Unterschiede kann Einblicke in Anpassungsmechanismen geben.
- Whole-Mount-Immunhistochemie ist eine wertvolle Technik zur Visualisierung zellulärer Strukturen.
- Konsistente Wachstumsbedingungen sind für zuverlässige experimentelle Ergebnisse unerlässlich.
Zweck der Studie
- Ein Zuchtprotokoll für Astyanax mexicanus zu etablieren.
- Die Phänotypen von Fluss- und höhlenangepassten Fischen zu vergleichen.
- Immunhistochemie für die zelluläre Analyse zu nutzen.
Verwendete Methoden
- Zucht von Erwachsenen in einer kontrollierten Umgebung.
- Aufzucht von Larven mit einer nährstoffreichen Kost aus Rotatoria.
- Durchführung von Whole-Mount-Immunhistochemie an post-larvalen Fischen.
- Dokumentation von Überlebensraten und phänotypischen Ergebnissen.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Zucht von Oberflächen- und Höhlenmorphotypen wurde erreicht.
- Oberflächenfische produzierten mehr Larven pro Laich als Höhlenfische.
- Die Immunfärbung kennzeichnete effektiv Neuronen und Pankreaszellen.
- Überlebensraten wurden überwacht, um Gesundheits- und Kontaminationsrisiken zu beurteilen.
Schlussfolgerungen
- Das etablierte Protokoll bietet eine zuverlässige Methode zur Zucht und Analyse von Astyanax mexicanus.
- Vergleichende Studien können das Verständnis evolutionärer Anpassungen verbessern.
- Immunhistochemie ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung der Entwicklungsbiologie.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Establishing standardized post-larval culture and immunostaining protocols for Astyanax mexicanus enables comparative phenotypic analysis of surface and cave morphotypes. This approach supports target validation by providing a disease-relevant system to study adaptive traits and developmental gene function. The method enhances predictive confidence in early discovery by allowing mechanistic de-risking of conserved pathways through cross-population comparison.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by comparing phenotypic divergence in post-larval stages between surface and cave populations.
- Operational Value: Provides a standardized aquaculture system for generating density-matched larval cohorts, reducing biological variability in target validation assays.
- Scientific Value: Supports functional target validation through whole-mount immunostaining to assess gene expression patterns in neurons and pancreatic cells without transgenic reporters.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates reproducible post-larval phenotypes suitable for high-content screening of compounds affecting developmental pathways.
- Operational Value: Standardizes larval rearing on rotifer diets in static systems, ensuring consistent growth and minimizing confounding variables in assay readouts.
- Scientific Value: Enables quantitative phenotypic measurements via immunostaining, supporting assay standardization and cross-laboratory data comparability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates translational biomarker alignment by linking post-larval phenotypic differences to adult survival traits in cavefish environments.
- Operational Value: Supports preclinical model development by establishing nursery protocols that can scale to adult rearing for long-term phenotypic studies.
- Scientific Value: Promotes mechanistic de-risking by allowing comparison of conserved developmental pathways implicated in adaptation and disease resistance.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing a standardized platform for phenotypic screening and target validation prior to lead identification efforts.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of developmental genes by comparing immunostaining patterns between surface and cave-derived post-larval fish.
- Screening: Delivers assay-ready larval populations with consistent growth and survival metrics, supporting reproducible compound screening campaigns.
- Analytics: Generates quantitative immunohistochemical readouts that allow teams to compare protein expression levels across experimental conditions.
- Translational Research: Connects early phenotypic screening to adult adaptive traits, supporting risk-adjusted advancement decisions in preclinical development.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable nursery and immunostaining platform applicable across multiple studies investigating developmental gene function in vertebrate models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target selection by reducing mechanistic ambiguity through direct phenotypic comparison of adaptive variants.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization across laboratories via defined larval rearing and immunostaining protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by enabling early de-risking of targets based on conserved phenotypic responses in disease-relevant models.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing empirical data on target modulation effects in a genetically tractable comparative system.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish husbandry and live food culture (rotifers) for successful larval rearing.
- Dependent on access to fluorescent microscopy and standardized immunostaining reagents for neuronal and pancreatic cell detection.
- Necessitates cross-team standardization of fixation, blocking, and antibody incubation procedures to ensure reproducible staining outcomes.
- Involves adaptation considerations when extending the protocol to other fish species or developmental stages beyond 12.5 days post fertilization.
- Includes practical limitations such as variable spawning success in certain cave populations (e.g., Molino, Tinaja), requiring adjusted breeding ratios or increased replicate numbers.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:38
Breeding
1:20
Hatching Fertilized Eggs
2:16
Transfer of Hatched Larvae to Nursery Containers
2:45
Preparation of Rotifer-based Fish Food and Feeding of Post-Larval Fish
3:19
Whole-Mount Immunohistochemistry of Post-Larval Fish
5:11
Results: Surface Fish Produce Greatest Number of Larvae per Spawn
5:56
Conclusion
