Name: Quantitative Untersuchung der Antibiotikaempfindlichkeit von Neisseria Gonorrhoeae Aggregate verwenden ATP-Auslastung kommerziellen Assays und Live/Dead Färbung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-08T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Lernen Sie eine quantitative ATP-basierte Methode zur Messung der Antibiotikaempfindlichkeit von Neisseria gonorrhoeae in Aggregaten. Diese Technik ermöglicht präzise Überlebensanalysen für klinisch relevante Resistenztests.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch ein Stipendium des National Institute of Health, D.C.S. und w.s. AI123340. L.-c.w., j.w., A.C. und E.N wurden in Teil/Teilnahme an "The First Year Innovation & Forschung Experience"-Programm von der University of Maryland finanziert unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle bei der Studie Design, Datenerhebung und -Analyse, Entscheidung, zu veröffentlichen oder der Manuskripterstellung. Wir anerkennen die UMD CBMG Imaging Core für alle Mikroskopie-Experimente.

1. Allgemeine Wartung von GC-Stämme
<ol><li>N. Gonorrhoeae Stämme Streifen auf GCK-Agar mit 1 % Kellogg ergänzt18 (Tabelle 1, Tabelle 2) aus den Beständen der Gefrierschrank und inkubieren Sie 37 ° C mit 5 % CO2 für 16-18 h Nutzung MS11 Ausdruck Phase-Variable Opa (MS11Opa +), keine Opa (MS11ΔOpa), oder einen abgeschnittenen LOS (MS11ΔLgtE).</li>
	<li>Wählen Sie sorgfältig Pili negative (Kolonie ohne dunkle Kante) oder positiv (Kolonie mit dunklen Rand) Kolonien aus jedem Stamm basierend auf Kolonie Morphologie19 mit einem sezierenden Lichtmikroskop und Streifen auf einen neuen GCK-Teller.</li>
	<li>Inkubation bei 37 ° C mit 5 % CO2 für 16-18 Uhr vor dem Gebrauch.</li>
</ol>(2) Lebensfähigkeit Quantifizierung der GC Aggregationen
<ol><li>GC mit einem sterilen Applikator zu sammeln. Tupfer GC aus der Platte und wieder auszusetzen GC in vorgewärmten Brühe (GCP, Tabelle 3) ergänzt mit 4,2 % Nahco33 und 1 % Kellogg Lösungen18. Verwenden Sie Spektrophotometrie bei einer Wellenlänge von 650 nm (ein OD-650 1 = ~ 1 x 109 KBE/mL) zur Bestimmung der Konzentration von Bakterien ausgesetzt.</li>
	<li>Passen Sie die Konzentration der GC bis ~ 1 x 108 KBE/mL.</li>
	<li>Fügen Sie 99 µL bereinigte GC Suspension in Vertiefungen einer 96-Well-Platte.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Platte für 6 h bei 37 ° C mit 5 % CO2 , die Bakterien zu aggregieren.</li>
	<li>Fügen Sie 1 µL serielle verdünnten Ceftriaxon (1000, 100, 50, 25, 12,5, 6.2, 3.1, 1,5, 0,8, 0,4, 0,2 µg/mL) in jede Vertiefung. Lassen Sie einige Brunnen unbehandelt als Kontrollen dienen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Platte für 24 h bei 37 ° C mit 5 % CO2.</li>
	<li>Beschallen Sie die Suspension 3 Mal in jede Vertiefung für 5 s 144 W und 20 kHz.</li>
	<li>Fügen Sie 100 µL kommerziell verfügbare ATP Auslastung Glühen Reagenz in jede Vertiefung, pipette- und 3 Mal, und 15 min bei 37 ° C mit 5 % CO2inkubieren.</li>
	<li>Vorsichtig 150 µL Gemisch aus jedem Brunnen in einen neuen Brunnen in einer 96-Well schwarz Mikrotestplatte übertragen und Einführung von Luftblasen zu vermeiden.</li>
	<li>Messen Sie die Absorption von jedem Bohrloch bei 560 nm mit dem Teller-Reader.</li>
	<li>Berechnen Sie die Überlebensrate nach dem Verhältnis der Lesung Lesung aus unbehandelten Brunnen nach seriellen Ceftriaxon-Behandlung erhalten.</li>
</ol>(3) Fluoreszenz mikroskopische Analyse der Live/Dead GC Aggregate
<ol><li>GC mit einem sterilen Applikator zu sammeln. Tupfer GC aus der Platte und wieder auszusetzen GC im vorgewärmten GCP Medien plus 1 % ergänzt Kellogg.</li>
	<li>Bestimmen Sie die Anzahl der Bakterien durch Spektralphotometrie bei einer Wellenlänge von 650 nm und passen Sie die Konzentration der GC bis ~ 1 x 107 KBE/mL.</li>
	<li>198 µL GC Suspension in in 8-Brunnen Deckglas-unten Kammern hinzufügen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Kammer für 6 h bei 37 ° C mit 5 % CO2 Aggregation Bildung zu ermöglichen.</li>
	<li>Fügen Sie 2 µL Ceftriaxon (100 µg/mL oder verschiedenen Verdünnungen) in jede Vertiefung innerhalb jedes Aggregation Zustand. Die gewünschte Zeit bei 37 ° C mit 5 % CO2inkubieren.</li>
	<li>Fügen Sie 0,6 µL lebenden/Toten Färbung Lösung Mischung in jede Vertiefung und inkubieren Sie für 20 min bei 37 ° C mit 5 % CO2.</li>
	<li>Z-Serie-Bilder mit einem konfokalen Mikroskop (ein Äquivalent Mikroskop einsetzbar) zu erwerben.</li>
	<li>Analysieren Sie die Bilder mit ImageJ-Software zur Messung der Größe des GC-Aggregate und die Fluoreszenz Intensitätsverhältnis (FIR) der lebenden Toten Färbung in jedes Aggregat.</li>
</ol>(4) Bildanalyse
<ol><li>Abschätzung der Größe der bakteriellen Aggregate.<ol>
<li>Öffnen Sie ImageJ und öffnen Sie ein Bild, indem Sie eine raw-Bild-Datei auf ImageJ-Menü-Leiste ziehen.</li>
		<li>Klicken Sie Freihandlinien in der Menüleiste ImageJ und Kreis Bereich jede Aggregation im Bild.</li>
		<li>Klicken Sie auf analysieren | Maßnahme in der Menüleiste ImageJ.</li>
		<li>Erhalten Sie die Zahl in einem neuen Fenster unter der Spalte Fläche .</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quantifizierung der lebenden Toten Verhältnis der Aggregationen<ol>
<li>Öffnen Sie ImageJ und öffnen Sie ein Bild, indem Sie eine raw-Bild-Datei auf ImageJ-Menü-Leiste ziehen.</li>
		<li>Klicken Sie auf analysieren | Legen Sie Messungen in der Menüleiste ImageJ.</li>
		<li>Überprüfen Sie die integrierte Dichte im Pop-up-Fenster und klicken Sie auf "OK".</li>
		<li>Klicken Sie auf Bild | Farbe | Werkzeug-Kanäle in der Menüleiste und wählen Sie Farbe.</li>
		<li>Aktivieren Sie Kanal 1 als die Fluoreszenz für lebende Bakterien Färbung.</li>
		<li>Klicken Sie Freihandlinien in der Menüleiste ImageJ und Kreis Bereich jede Aggregation.</li>
		<li>Klicken Sie auf analysieren | Maßnahme in der Menüleiste ImageJ.</li>
		<li>Ermittelt Anzahl unter IntDen Spalte.</li>
		<li>Kanal 2 als die Fluoreszenz für Tote bakterielle Verfärbungen zu überprüfen. Wiederholen Sie die Schritte 4.2.6-4.2.8.</li>
		<li>Erhalten Sie das Verhältnis der lebenden Toten durch die Aufteilung der Zahl von Schritt 4.2.8 durch Zahl von Schritt 4.2.9.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Statistische Analyse<ol>
<li>Öffnen Sie GraphPad Prism zu und geben Sie die Nummern auf die gewünschte Spalte von ImageJ erhalten.</li>
		<li>Klicken Sie auf analysieren , und wählen Sie t-Tests unter Spalte Analysen.</li>
		<li>Überprüfen Sie die gewünschte Spalte für einen Vergleich und klicken Sie auf "OK".</li>
		<li>Erhalten Sie den P-Wert unter Analyse -Fenster.</li>
		<li>Wählen Sie die Lineare Regression unter XY Analysen aus Schritt 4.3.3</li>
		<li>Erhalten Sie R-Quadrat und der P-Wert unter dem Analyse-Fenster.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>CDC STD Facts. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: 
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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Bakterien können Biofilme bilden, während der Infektion des menschlichen Körpers. Traditionelle kann MIC die Konzentration erforderlich, um die Beseitigung der Bakterien im Biofilm reflektieren nicht. Um Antibiotika Auswirkungen auf einen Biofilm zu testen, können Methoden auf Basis von Biofilm Biomasse sowie die Beschichtung KBE aufgrund der Auswirkungen der Biofilm Struktur fehlerhaft sein. Beispielsweise funktioniert die Beschichtung-Methode nur, wenn der Biofilm gestört werden kann. Daher kann die KBE erhalten niedri...

Gonorrhoe ist eine gemeinsame sexuell übertragbare Infektionen (STI)1. Neisseria gonorrhoeae (GC), ein gramnegatives diplococcal Bakterium ist der Erreger dieser Krankheit. Symptome der genitalen Infektion führt zu Schmerzen beim Wasserlassen, generalisierte genitale Schmerzen und Harnröhre entladen. Infektion ist oft asymptomatisch2,3,4,5, und dies ermöglicht eine erweiterte Kolonisation. Diese unbehandelten Infektionen sind ein großes gesundheitliches Problem, da sie das Potenzial, die Übertragung des Organismus zu erleichtern und dies kann zu Komplikationen wie Adnexitis (PID) und verbreitet Gonokokken-Infektion (DGI)6. Antibiotika-resistenten Tripper ist eine Krise des öffentlichen Gesundheitswesens und eine zunehmende sozioökonomische Last7. Geringere Anfälligkeit für Cephalosporine führte Behandlung Therapie Wechsel von ein einziges Antibiotikum zur dualen Therapie verbindet Azithromycin oder Doxycyclin mit Ceftriaxon8. Das erhöhte Scheitern von Ceftriaxon und Azithromycin9,10, in Kombination mit asymptomatische Infektionen, unterstreicht die Notwendigkeit der Gonorrhoe Behandlungsversagen zu verstehen.
Der minimalen inhibitorischen Konzentration (MIC)-Test, einschließlich der Agar-Verdünnung und Disc-Diffusion-Tests, wurde als der standard medizinischer Test zur Identifizierung von Widerstand gegen ein Antibiotikum eingesetzt. Es ist jedoch unklar, ob der MIC Test bakterielle Resistenz gegen Antibiotika in-vivo widerspiegelt. Die Entstehung von bakteriellen Biofilmen trägt für das Überleben der Bakterien im Beisein von bakterizide Konzentrationen des Antibiotikums: die MIC-Tests sind nicht in der Lage, diesen Effekt11zu erkennen. Weil GC auf Schleimhaut-Oberflächen12Biofilme bilden kann, wir stellen die Hypothese auf, dass Antibiotikum Anfälligkeit innerhalb Aggregate wäre anders als in einzelnen GC gesehen. Darüber hinaus haben Studien gezeigt, dass drei--Variable Oberflächenmoleküle, Pili, Deckkraft-assoziierten Protein (Opa Phasen) und Lipooligosaccharides (LOS), die Inter Bakterie Interaktionen regulieren, zu verschiedenen großen Aggregate13, führen 14 , 15. der Beitrag dieser Komponenten zu Antibiotika-Resistenz wurde nicht durch den Mangel an geeigneten Methoden geprüft.
Derzeit gibt es mehrere Methoden, um die Beseitigung der Biofilm zu messen. Die am weitesten verbreitete quantitative Methode ist durch Messung der Biomasse mit Kristallviolett16Färbung. Die Methode erfordert jedoch erhebliche experimentelle Manipulation, die möglicherweise Fehler im Experiment wiederholt17erzeugen kann. Die lebenden/Toten Färbung Methode hier ermöglicht die Visualisierung von lebenden und toten Bakterien und deren Verteilung innerhalb der Biofilm. Die Biofilm-Struktur kann jedoch als eine physikalische Barriere darstellen, die Farbstoff eindringen reduziert. Daher beschränkt sich um lebenden/Toten Bakterien innerhalb einer Gruppe zu quantifizieren, die Färbung auf kleine Biofilmen oder seine Vorläufer-Mikrokolonien oder Aggregationen. Andere Methoden, einschließlich der Agar Verdünnung und Disc Verbreitung Tests sind nicht in der Lage, die Auswirkungen der Aggregation zu messen. GC-Anfälligkeit in Aggregation nach antibiotische Belichtung, eine ideale Methode untersuchen brauchen haben beide ein quantitativen Assay, der messen kann lebende Bakterien und deren Verteilung zu visualisieren.
Das hier beschriebene Verfahren kombiniert eine ATP-Nutzung-Messung und einer lebenden/Toten Färbung quantitativ zu bestimmen und visuell prüfen GC Anfälligkeit innerhalb Aggregate in Anwesenheit von Antibiotika.

<table><tbody><tr><td>100x Kellogg's Supplement</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>United States Biological</td><td>A0930</td><td></td></tr><tr><td>BacTiter Assay&nbsp;</td><td>Promega</td><td>G8232</td><td></td></tr><tr><td>Ceftriaxon</td><td>TCI</td><td>C2226</td><td></td></tr><tr><td>Difco GC mittlere Base&nbsp;</td><td>BD</td><td>228950</td><td></td></tr><tr><td>Eisennitrat, Nichthydrat&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>254223-10G</td><td></td></tr><tr><td>Glukose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP350-1</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin Kristallines Pulver</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP379-100</td><td></td></tr><tr><td>BacLight Lebend-/Totfärbung</td><td>Invitrogen</td><td>L7012</td><td></td></tr><tr><td>MS11 Neisseria gonorrhoeae Stamm</td><td></td><td></td><td>freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. Herman Schneider, Walter Reed Army Institute for Forschung</td></tr><tr><td>Kaliumphosphat zweibasisch (K2HPO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P290-500</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumphosphat monobasisch (KH2PO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP329-1</td><td></td></tr><tr><td>Proteose Pepton</td><td>BD Biosciences</td><td>211693</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S671-10</td><td></td></tr><tr><td>Lösliche Stärke</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9765</td><td></td></tr><tr><td>Thiaminpyrophosphat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8754-5G</td><td></td></tr><tr><td>Ausrüstung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td>VWR</td><td>25384-302</td><td></td></tr><tr><td>8-well Deckglas-Bodenkammer&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific 155411</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Gewebekulturplatten&nbsp;</td><td>Corning, Falcon</td><td>3370</td><td></td></tr><tr><td>Biosicherheitswerkbank (NU-425-600 Klasse II, A2 Laminar Flow Biohazard Hood)</td><td>Nuaire</td><td>32776</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Inkubator</td><td>Fisher Scientific</td><td> Modell 3530</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalmikroskop mit Live-Imaging-Kammer</td><td>Leica</td><td>SP5X</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp; 96 Well Mikroplatte aus schwarzem Polystyrol&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3904</td><td></td></tr><tr><td>Glomax Beleuchtung&nbsp;</td><td>Promega</td><td>E6521</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenspitzen (0,1-10 & Mikro; L)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>02-717-133</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenspitzen (1000 &Mikro; L)</td><td>VWR</td><td>83007-382</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenspitzen (200 & Mikro; L)</td><td>VWR</td><td>53509-007</td><td></td></tr><tr><td>Spektralphotometer Ultrospec 2000 UV</td><td>Pharmacia Biotech</td><td>80-2106-00</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 15 ml konische Röhrchen</td><td>VWR</td><td>21008-216</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Mikrozentrifugenröhrchen (1,7 mL)</td><td>Sorenson BioScience</td><td>16070</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Applikatoren mit Polyesterspitze</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-122</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Kontes</td><td>Äquivelent zu 9110001</td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative untersuchung der antibiotikaempfindlichkeit von neisseria gonorrhoeae aggregate verwenden atp-auslastung kommerziellen assays und live/dead färbung

Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining

Die Entstehung von Antibiotika-resistenten Neisseria Gonorrhoeae (GC) ist ein weltweit Gesundheitsrisiko dar und unterstreicht die Notwendigkeit, Personen zu identifizieren, die Behandlung nicht. Dieses gramnegatives Bakterium verursacht Gonorrhoe ausschließlich beim Menschen. Während der Infektion ist es in der Lage, Form Aggregate und/oder Biofilme. Der minimalen inhibitorischen Konzentration (MIC) Test dient für Anfälligkeit gegen Antibiotika zu bestimmen und entsprechenden Behandlung zu definieren. Der Mechanismus der die Beseitigung der in-vivo und ihre Beziehung zur Laborergebnisse sind nicht bekannt. Eine Methode, die untersucht, wie GC Aggregation Antibiotikaempfindlichkeit beeinflusst und zeigt die Beziehung zwischen aggregierte Größe und Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika wurde entwickelt. Wenn GC Aggregat sie resistenter gegen Antibiotika töten sind, überleben mit Bakterien im Zentrum Ceftriaxon-Behandlung besser als in der Peripherie. Die Daten zeigen, dass N. Gonorrhoeae Aggregation seiner Anfälligkeit für Ceftriaxon, reduzieren kann, was nicht mit den standard Agar-Platte-basierte MIC Methoden widerspiegelt. In dieser Studie verwendete Methode ermöglicht es Forschern, bakterielle Anfälligkeit unter klinisch relevanten Bedingungen zu testen.

Zwei Methoden wurden eingesetzt: eine ATP-Nutzung-Assay und einen lebenden/Toten-Färbung-Assay. Die Ergebnisse können kombiniert oder einzeln verwendet für die Prüfung von bakteriellen überleben in Aggregate nach Behandlung mit Antibiotika. Der ATP-Nutzung-Test hat sich gezeigt, genau lebensfähige Bakterien in S. Aureus Biofilme20,21messen. Hier, wurde MS11Opa + Pil + Stamm verwendet, um die Rolle der GC Aggregation in An...

Eine einfache Messung der ATP Assay und lebenden/Toten Färbung Methode dienten zu quantifizieren und zu visualisieren, Neisseria Gonorrhoeae Überleben nach Behandlung mit Ceftriaxon. Dieses Protokoll kann verlängert werden, um die antimikrobielle Wirkung der jedes Antibiotikum zu untersuchen und kann verwendet werden, um die minimalen inhibitorischen Konzentration der Antibiotika bei bakteriellen Biofilmen definieren.

Quantitative Untersuchung der Antibiotikaempfindlichkeit von Neisseria Gonorrhoeae Aggregate verwenden ATP-Auslastung kommerziellen Assays und Live/Dead Färbung

The emergence of antibiotic resistant Neisseria gonorrhoeae (GC) is a worldwide health threat and highlights the need to identify individuals who fail ...

Diese Technik ermöglicht es uns, die Antibiotikaanfälligkeit unter klinisch relevanteren Bedingungen zu messen. Die Technik ermöglicht es uns auch, die wahre Antibiotikakonzentration zu bestimmen, die Bakterien in Aggregaten abtöten kann. Diese Technik kann angewendet werden, um die Konzentration zu bestimmen, die für die Beseitigung von GC-Aggregaten erforderlich ist.Die Methode kann auch angewendet werden, um die antimikrobielle Anfälligkeit von Bakterien zu messen, die in der Lage sind, Aggregate zu bilden. Achten Sie sorgfältig auf die Lyseschritte, um sicherzustellen, dass die Lyse abgeschlossen ist. Andernfalls wird der ATP-Messtest die Anzahl lebensfähiger Bakterien unterschätzen.Die Visualisierung dieser Methode wird es anderen Forschern ermöglichen, dieses Experiment mit Konsistenz zu verfolgen und zu replizieren. Beginnen Sie mit dem Streichen Von Neisseria gonorrhoeae, oder GC-Stämme, auf GCK Agar ergänzt mit 1%Kellogg für eine 16 bis 18-Stunden-Inkubation bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Am nächsten Morgen verwenden Sie ein Lichtmikroskop, um pili-negative Kolonien ohne dunkle Kanten oder pili-positive Kolonien mit dunklen Kanten von jeder Platte sorgfältig auszuwählen, und streifen Sie die ausgewählten Kolonien auf neue GCK-Platten für eine 16- bis 18-Stunden-Kultur bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid.Verwenden Sie am nächsten Morgen einen sterilen Applikator, um GC-Kolonien von jeder Platte zu sammeln und jeden Tupfer in warmer Brühe wieder aufzusetzen, ergänzt mit 4,2% Natriumbicarbonat und 1%Kellogg-Lösung. Messen Sie die optische Dichte bei 650 Nanometern oder OD650, um die Konzentration der suspendierten Bakterien zu bestimmen und die GC-Konzentration auf etwa ein mal 10 auf die acht koloniebildenden Einheiten pro Milliliter einzustellen. Als nächstes fügen Sie 99 Mikroliter der GC-Suspension in einzelne Brunnen einer 96-Well-Platte und lassen Sie die Bakterien bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für sechs Stunden zu aggregieren.Am Ende der Inkubation einen Mikroliter seriell verdünntes Ceftriaxon zu jedem Brunnen hinzufügen, so dass einige Brunnen unbehandelt bleiben, um als Steuerung zu dienen und die Platte für weitere 24 Stunden an den Inkubator zurückzugeben. Am nächsten Tag beschallen Sie die Suspension in jedem Brunnen dreimal mit 144 Watt und 20 Kilohertz für fünf Sekunden pro Beschallung und fügen Sie 100 Mikroliter handelsüblichen ATP-Nutzungsglühen-Reagenz zu jedem Brunnen hinzu. Übertragen Sie vorsichtig 150 Mikroliter Mischung aus jedem Brunnen in einzelne Brunnen einer neuen 96-Well-Schwarzen Mikroplatte und messen Sie die Absorption jedes Brunnens bei 560 Nanometern auf einem Plattenleser.Berechnen Sie dann die Überlebensrate nach dem Verhältnis des Nachdereiner der seriellen Antibiotikabehandlung erhaltenen Messwerts zum Ablesen aus den unbehandelten Brunnen. Für die Visualisierung der lebenden/toten GC-Aggregate verwenden Sie einen sterilen Applikator, um GC aus den über Nacht kultivierten Platten zu sammeln und das GC in vorgewärmtem GCP-Medium, ergänzt mit 1%Kellogg, wieder aufzusetzen. Messen Sie den OD650 mittels Spektrophotometrie und passen Sie die Konzentration auf etwa ein mal 10 auf die sieben koloniebildenden Einheiten pro Milliliter an.Als nächstes fügen Sie 198 Mikroliter GC Suspension in acht Well-Abdeckung-Boden-Kammern und inkubieren die Kammern bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für sechs Stunden. Behandeln Sie die Bakterien am Ende der Inkubation mit zwei Mikroliterceftriaxon pro Aggregationszustand und bringen Sie die Kammern für die entsprechende experimentelle Inkubationszeit an den Inkubator zurück. Am Ende der Inkubation 0,6 Mikroliter lebende/tote Färbelösung in jeden Brunnen geben und die Kammern für weitere 20 Minuten in den Inkubator zurückgeben.Verwenden Sie dann ein konfokales Mikroskop, um Bilder der Z-Serie zu erhalten. Um die Größe der GC-Aggregate zu messen, öffnen Sie das erste Bild in ImageJ, und wählen Sie Freihandlinien aus, um den Bereich jeder Aggregation im Bild zu umkreisen. Klicken Sie auf Analysieren und Messen.Die Größe der Aggregate wird unter der Flächenspalte angegeben. Zur Quantifizierung des Fluoreszenzintensitätsverhältnisses von Leben deiner lebenden zur abgestorbenen Färbung in jedem Aggregat klicken Sie auf Analysieren und Festlegen von Messungen und überprüfen Sie die integrierte Dichte im Popup-Fenster. Klicken Sie auf OK und klicken Sie auf Bild, Farbe und Kanäle Werkzeug.Wählen Sie Farbe und Kanal eins als Fluoreszenz für abgestorbene Bakterien Färbung. Wählen Sie Freihandlinien aus, um den Bereich jeder Aggregation zu umkreisen, und klicken Sie auf Analysieren und Messen, um das Fluoreszenzintensitätsverhältnis für jedes Aggregat in der integrierten Dichtespalte zu erhalten. Wählen Sie Kanal zwei für die Fluoreszenz für die lebende bakterielle Färbung und messen Sie die Fluoreszenzintensität in jedem Aggregat, wie soeben gezeigt.Dividieren Sie dann die Daten zur Live-Fluoreszenzintensität durch die toten Fluoreszenzintensitätsdaten, um das Verhältnis der Live-zu-Tot-Fluoreszenzintensität zu erhalten. In diesem repräsentativen Experiment wurden nicht aggregierte pili-positive, aggregierte pili-positive oder aggregierte und gestörte pili-positive Bakterien vor der Messung ihrer ATP-Spiegel mit seriellen Verdünnungen von Ceftriaxon behandelt. Voraggregierte GC zeigten ein signifikant höheres Überleben als nicht aggregierte oder aggregationsgestörte GC, wenn sie mit gleichen Konzentrationen von Ceftriaxon oder höher behandelt wurden.Pili-positive Stämme, die größere Aggregate bilden, wiesen die höchsten ATP-Werte nach ceftriaxon-Behandlung im Vergleich zu den mutierten Stämmen auf. Ungeachtet der getesteten Stämme ergaben lebende/tote Färbungen vor der Antibiotikabehandlung tote Bakterien, die sich größtenteils an den äußeren Schichten der Kultur befanden, während live GC hauptsächlich im Kern von Ceftriaxon-behandelten Aggregaten identifiziert wurden. Wie erwartet bildeten pili-positive Bakterien die größten Aggregate, während pili-negative Kulturen die kleinsten bildeten.Bemerkenswert ist, dass pili-positive Aggregate nach der Antibiotikabehandlung noch in ihren Kernschichten am Leben waren, während GC in den kleinen, lockeren mutierten Aggregaten tot waren. Basierend auf der Größe und dem Überleben des GC kann ein Korrelationsdiagramm dargestellt werden, um die Beziehung zwischen der Aggregationsgröße und dem Überleben der Bakterien zu untersuchen. Beschallung ist wichtig, um sicherzustellen, dass ATP von jedem einzelnen Bakterium innerhalb der eng gebundenen Aggregate freigesetzt wird.Andernfalls sind die Messungen nicht konsistent. Es ist wichtig, die Bakterien zu plattieren, nachdem sie sich aggregieren und mit Antibiotika behandelt werden, um sowohl die lebensfähigen als auch die replikationsfähigen Bakterien zu messen. Die Technik misst den Einfluss der Bakterienaggregation auf die Antibiotikaanfälligkeit, so dass Forscher bessere Medikamente zur Behandlung von Krankheiten entwickeln können.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Quelle: Cayron, J. und Lesterlin, C. Multiskalige Analyse des Bakterienwachstums unter Stressbehandlungen. J. Vis. Exp. (2019)Dieses Video zeigt das Verfahren zur Beurteilung der Filamentierung von E. coli und der DNA-Replikation unter zellteilungshemmender Antibiotikabehandlung unter Verwendung von Plattierung zur Messung der Lebensfähigkeit und Durchflusszytometrie zur Analyse der Zellgröße und des DNA-Gehalts.

Beurteilung der Antibiotika-induzierten Filamentierung in E. coli mittels Plating Assay und Durchflusszytometrie

Quelle: Maurakis, S. und Cornelissen, C. N. Metallbegrenztes Wachstum von Neisseria gonorrhoeae zur Charakterisierung von metallresponsiven Genen und Metallerwerb aus Wirtsliganden. J. Vis. Exp. (2020)Dieses Video zeigt das Verfahren zum Nachweis von Oberflächenmetalltransportern in Neisseria gonorrhoeaee , die unter metallbegrenzten Bedingungen gezüchtet wurden, unter Verwendung eines Dot-Blot-Assays, der Ligandenbindung, Antikörperdetektion und kolorimetrische Visualisierung umfasst.

Detektion der Oberflächenmetalltransporter in Neisseria gonorrhoeae mittels Dot Blot

Dieses Video demonstriert eine in vitro Technik, um die Auswirkungen einer antimikrobiellen Behandlung auf Pseudomonas aeruginosa (Pa) Aggregate zu untersuchen. Fluoreszenzmarkierte Pa-Zellen werden als Aggregate gezüchtet, die das Wachstumsmuster während der Infektion nachahmen. Nach der Provokation der Aggregate mit einer subletalen Konzentration des Antibiotikums Colistin erfolgt die Echtzeitbewertung der Bakterien-Antibiotika-Interaktion mittels Fluoreszenzmikroskopie.

Eine In-vitro-Technik zur Untersuchung antimikrobieller Behandlungen an bakteriellen Aggregaten

Dieses Video beschreibt den einfachen ATP-Messassay mit einem Luciferase-Glühreagenz. Dieser Assay wird verwendet, um das Überleben von Neisseria gonorrhoeae nach Behandlung mit Ceftriaxon zu quantifizieren.

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Quantitative Untersuchung der Antibiotikaempfindlichkeit von Neisseria Gonorrhoeae Aggregate verwenden ATP-Auslastung kommerziellen Assays und Live/Dead Färbung (Video) | JoVE Journal

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