Gentechnische Veränderung von Dictyostelium Discoideum Zellen basierend auf Auswahl und das Wachstum von Bakterien
25. Januar 2019
Dictyostelium Discoideum ist ein beliebter Modellorganismus, komplexe zelluläre Prozesse wie Zelle Migration, Endozytose und Entwicklung zu studieren. Das Dienstprogramm des Organismus ist abhängig von der Machbarkeit der Genmanipulation. Hier präsentieren wir Ihnen Methoden, um Dictyostelium Discoideum Zellen zu transfizieren, die bestehende Grenzen der Kultivierung Zellen in flüssigen Medien zu überwinden.
Der Wert dieses Protokolls ist, dass es es erlaubt, fast jeden Stamm von Dictyostelium-Discoideum durch Molekulargenetik zu manipulieren, unabhängig davon, ob dieser Stamm axenisch im flüssigen Medium wächst oder nicht. Der andere Vorteil dieser Technik ist, dass sie schnell und einfach ist. Transponieren Sie zu transfekten Zellen mit einem exochromosomalen Plasmid, bevor Sie beginnen, Dikyosteliume zu mischen.
Die Ergebnisse können bereits zwei Tage nach der Transfektion mittels Mikroskopie validiert werden. Es ist ungewöhnlich, mit Dictyostelium-Zellen und Bakterien Suspension zu arbeiten. Die Visualisierung wird den Experimentatoren eine Vorstellung davon vermitteln, wie die verschiedenen Schritte der Protokolle ausgeführt werden.
Demonstrieren das Verfahren mit mir wird Soudabeh Imanikia, ein Postdoc aus meinem Labor sein. Zunächst 1000 Milliliter Sorensen-Puffer-Arbeitslösung mit Magnesiumchlorid und Calciumchlorid nach dem Textprotokoll vorbereiten. Danach verwenden Sie eine einzige Kolonie von K Aerogenes, um einen Liter LB-Medium zu impfen.
Lassen Sie die Bakterien über Nacht bei 37 Grad Celsius mit Schütteln wachsen. Drehen Sie die Zellen in zwei 500 Milliliter Zentrifugenröhren nach unten, um die Zellen zu ernten. Dann waschen Sie die Bakterien einmal mit 500 Milliliter Puffer.
Das Pellet in 20 Milliliter Puffer wieder aufhängen. Verwenden Sie ein Photometer, um die optische Dichte der Probe zu überprüfen und die Probe mit Puffer zu verdünnen, bis die optische Dichte etwa 100 beträgt. Danach bereiten Sie den Elektroporationspuffer H40 entsprechend dem Textprotokoll vor.
Wachsen Sie K-Aerogene, um ein SM-Medium über Nacht bei Raumtemperatur zu konfluken. 400 Mikroliter bakterielle Suspension zu einer SM-Agarplatte geben und gleichmäßig verteilen. Nehmen Sie dann eine sterile Schleife und impfen Sie sie mit Dikyosteliumzellen und verbreiten die Zellen an einem Rand der Platte.
Inkubieren Sie die Platte zwei Tage lang bei 22 Grad Celsius, um sicherzustellen, dass die Wachstumszonen groß genug für die Transfektion sind. Fügen Sie 10 Milliliter K Aerogene Suspension zu einer 10 Zentimeter Gewebe kulturbehandelten Petrischale hinzu. Verwenden Sie dann eine 10-Mikroliter Einweg-Impfschleife, um Zellen aus den Wachstumszonen der Kulturplatte zu kratzen.
Übertragen Sie die Zellen in ein 1,5-Milliliter-Rohr, das einen eiskalten H40-Puffer enthält. Drehen Sie die Zellen für zwei Sekunden bei 10000-facher Schwerkraft. Entsorgen Sie dann den Überstand, und setzen Sie die Zellen im H40-Puffer wieder auf.
Als nächstes fügen Sie 100 Mikroliter der Zellen in eine Röhre mit ein bis zwei Mikrogramm DNA. Pipette nach oben und unten, um die Zell-DNA-Mischung zu mischen und in eine vorgekühlte Elektroporationsküvette zu übertragen. Fügen Sie nicht mehr als zwei Mikrogramm DNA hinzu.
Eine höhere DNA-Konzentration ist toxisch für die Zellen und reduziert die Effizienz. Nach der Elektroporation die Zellen sofort in eine vorbereitete 10-Zentimeter-Petrischale übertragen und die Zellen für fünf Stunden erholen lassen. Um ein Transfektat für einen Knock-out, ein Knock-in oder einen Akt fünf Einschlag auszuwählen, lösen Sie die Zellen von der Petrischale, indem Sie Flüssigkeit über die Oberfläche pfeifen.
Richten Sie dann drei Verdünnungen des selektiven Agenten gemäß dem Textprotokoll ein. Schließlich verteilen Sie 150 Mikroliter der vorbereiteten Verdünnungen in jeden Brunnen von 96-gut flachen Gewebekulturplatten. In diesem Protokoll wurde ein extrachromosomales Plasmidsystem mit zwei Reportern demonstriert.
32 Stunden nach der Transfektion exprimierte die Mehrheit der Zellen beide fluoreszierend gekennzeichneten Fusionsproteine. Ein Akt fünf M Kirsche Knock-in und ein NC4 wurde auch versucht. Zwei Bänder wurden erhalten, nachdem der Digest auf einem Agarose-Gel ausgeführt wurde.
Das 4127 Basispaarband enthält das gewünschte Konstrukt. Die gereinigte DNA wurde für die Transfektion von NC4-Zellen verwendet. Zwei Klone der NC4-Transfektion wurden über PCR analysiert und beide zeigten die vorhergesagten Bandmuster.
Southern Blot wurde dann verwendet, um die Ergebnisse der PCR zu validieren. Der NC4 wuchs auf bakteriellen Rasenflächen schneller als Ax2-Zellen. Nach vier Stunden konnten mehr NC4-Zellen unter die Agarose kriechen als Ax2-Zellen.
Die NC4-Zellen waren schneller und zeigten eine stärkere chemotaktische Reaktion auf Folat als die Ax2-Zellen. Verwenden Sie immer Zellen aus frisch eingerichteten SM-Platten. Verwenden Sie niemals Zellen, die älter als vier Tage sind, sonst sinkt die Effizienz.
Frisch isolierte, nonextenische, weiße HAP-Stämme werden häufig verwendet, um Fragen zu einem Ruching oder sozialen Verhalten von Dikyosteliumen zu beantworten. Unsere ermöglicht es, Molekulargenetik durch diese Isolate anzuwenden.
Übersicht
Dieser Artikel stellt ein Protokoll zur Transfektion von Dictyostelium discoideum-Zellen vor, das eine genetische Manipulation unabhängig von den Wachstumsbedingungen des Stammes ermöglicht. Die Methode ist effizient und einfach und erlaubt eine schnelle Validierung der Ergebnisse.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Zellbiologie
- Genetische Manipulation
- Modellorganismen
Hintergrund
- Dictyostelium discoideum ist ein weit verbreitetes Modellorganismus zur Untersuchung zellulärer Prozesse.
- Die genetische Manipulation ist entscheidend, um verschiedene biologische Fragestellungen zu erforschen.
- Bestehende Methoden weisen Einschränkungen auf, die auf den Wachstumsbedingungen verschiedener Stämme beruhen.
- Dieses Protokoll zielt darauf ab, diese Einschränkungen zu überwinden.
Zweck der Studie
- Eine zuverlässige Methode zur Transfektion verschiedener Stämme von Dictyostelium discoideum bereitstellen.
- Molekulargenetische Anwendungen in Stämmen erleichtern, die nicht axenisch wachsen.
- Die Effizienz des Transfektionsprozesses demonstrieren.
Verwendete Methoden
- Herstellung von bakteriellen und puffergestützten Lösungen für die Transfektion.
- Elektroporation von Dictyostelium discoideum-Zellen mit Plasmid-DNA.
- Überprüfung der Transfektionsergebnisse mittels Mikroskopie und PCR.
- Beurteilung des Zellverhaltens und des Wachstums als Reaktion auf die Transfektion.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Transfektion mehrerer Stämme von Dictyostelium discoideum.
- Expression fluoreszierender Proteine 32 Stunden nach der Transfektion beobachtet.
- NC4-Zellen zeigten ein schnelleres Wachstum und eine stärkere chemotaktische Reaktion im Vergleich zu Ax2-Zellen.
- Überprüfung genetischer Modifikationen mittels PCR- und Southern-Blot-Analyse.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll ermöglicht eine effektive genetische Manipulation von Dictyostelium discoideum-Stämmen.
- Es bietet einen Rahmen für zukünftige Untersuchungen zum zellulären Verhalten und zur Genetik.
- Frisch isolierte Stämme liefern die besten Ergebnisse hinsichtlich der Transfektionseffizienz.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Dieses Protokoll ermöglicht die genetische Manipulation von Wildtyp-Stämmen von Dictyostelium, die auf Bakterien wachsen, und überwindet dabei die Einschränkungen axenisch adaptierter Stämme mit gestörter Ras-Signalübertragung. Es stellt eine skalierbare, schnelle Methode zur Zielvalidierung in einem krankheitsrelevanten Modellsystem bereit und unterstützt die mechanistische Risikominderung in der frühen Entdeckungsphase. Der Ansatz erweitert die molekulare Genetik auf umweltbedingt isolierte Stämme und verbessert so die translationale Kontinuität sowie das Vorhersagevertrauen in phänotypischen Screening-Workflows.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen in ungestörten Signal- und Motilitätswegen durch Verwendung nicht-axenischer Stämme mit intakter Ras-Signalübertragung.
- Operativer Wert: Verringert experimentelle Störfaktoren durch Makropinozytose-Störungen und Migrationsbeeinträchtigungen, wie sie bei axenischen Stämmen auftreten.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die funktionelle Validierung von Zielstrukturen und die biologische Risikominderung, indem Mutagenese unter physiologisch relevante Wachstumsbedingungen ermöglicht wird.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt rekombinante Zellen, die duale fluoreszierende Reporter innerhalb von 32 Stunden exprimieren, und ermöglicht dadurch schnelle Assay-Auswertungen für die Wirkstoff-Screening.
- Operativer Wert: Standardisiert den Transfektionsablauf unter Verwendung bakterieller Rasen und Elektroporation und verbessert so die Reproduzierbarkeit zwischen verschiedenen Laboren.
- Skalierbarkeit: Beschleunigt den Zeitraum von der Transfektion zu validierten Klonen auf Tage statt Wochen und unterstützt so das Hochdurchsatz-Engineering von Stämmen.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung der Chemotaxis und des sozialen Verhaltens in frisch isolierten Wildstämmen und verbessert dadurch die Relevanz von Krankheitsmodellen.
- Operativer Wert: Ermöglicht die direkte Anwendung molekulargenetischer Methoden auf Umweltisolaten, ohne dass eine vorherige axenische Anpassung erforderlich ist.
- Translationale Kontinuität: Verbindet die Zielvalidierung in der Entdeckungsphase mit präklinischen Phänotypen durch messbare Endpunkte wie Folsäure-induzierte Chemotaxis und Agarose-Penetrationstests.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode eignet sich für die frühe Entdeckungsphase bis hin zur Identifizierung von Leitstrukturen, da sie genetisch handhabbare Modelle für die Untersuchung von Signalwegen und phänotypische Screens bereitstellt.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung in Chemotaxis, Makropinozytose und Entwicklungssignalgebung unter Verwendung intakter Wildtyp-Stämme.
- Screening: Bietet quantitative Fluoreszenz- und Wachstumsauswertungen auf bakteriellen Rasen zur zuverlässigen Bewertung von Verbindungen.
- Analytik: Ermöglicht die Validierung genetischer Modifikationen mittels PCR, Southern Blot und Mikroskopie innerhalb von 32–48 Stunden nach der Transfektion.
- Translationale Forschung: Verbindet genetische Manipulationen mit funktionellen Assays wie Chemotaxis und Wachstum unter Agarose, um risikoadjustierte Weiterentwicklungen zu unterstützen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Generierung beliebiger Dictyostelium-Stämme, unabhängig von deren Isolationsquelle oder Wachstumsbedingungen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit, indem Artefakte durch axenische Anpassung eliminiert und native Signalwege wiederhergestellt werden.
- Operationaler Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit durch standardisierte Pufferherstellung, Elektroporationsparameter und Selektionsprotokolle.
- Strategischer Wert: Steigert die Kapitalnutzungseffizienz, indem die Zeiträume für Stammengineering verkürzt und schnelle Go/No-Go-Entscheidungen bei der Zielvalidierung ermöglicht werden.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung, indem mechanistisch entriskte Modelle mit validierten genetischen Modifikationen generiert werden.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in Mikrobiologie für die Vorbereitung von Bakterienkulturen und das Handling von Dictyostelium auf bakteriellen Rasen.
- Setzt Zugang zu Elektroporationsgeräten und steriler Zellkultur-Infrastruktur für Transfektion und Regenerationsphasen voraus.
- Erfordert die Standardisierung der Dichte des bakteriellen Inokulums (OD ~100) und der Zubereitung des H40-Puffers über verschiedene Anwender hinweg.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen, wenn das Protokoll auf verschiedene Wildtyp-Isolate oder Umweltstämme angewendet wird.
- Auf Stämme beschränkt, die auf bakteriellen Rasen wachsen können; die Effizienz nimmt ab, wenn die Zellen älter als vier Tage nach der Isolierung sind.
