Anwendungen der räumlich-zeitliche Zuordnung und Partikel-Analyse-Techniken zu quantifizieren, intrazellulären Ca2 + Signalisierung In Situ
7. Januar 2019
Genetisch codierte Ca2 + Indikatoren (GECIs) haben sich radikal verändert wie in-situ Ca2 + Bildgebung durchgeführt wird. Um die Wiederherstellung von Daten aus solchen Aufnahmen zu maximieren, ist die entsprechende Analysen von Ca2 + Signale erforderlich. Die Protokolle in diesem Papier erleichtern die Quantifizierung von Ca2 + Signale an Ort und Stelle mit räumlich-zeitliche Zuordnung und partikelbasierten Analyse aufgezeichnet.
Die Fähigkeit, große Datenmengen aus Kalzium-Bildgebungsexperimenten zu erfassen, hat sich drastisch verbessert, insbesondere bei Gewebebildversuchen. Unsere Protokolle beschreiben geeignete Analysetechniken zur Quantifizierung und Beschreibung dieser Datensätze. Unsere Protokolle erzeugen eine Reihe von räumlichen, zeitlichen und Intensitätswerten, die der Kalziumsignalisierung in ganzen Geweben innewohnen, und dies kann in einer rudimentäreren Analyse verloren gehen.
Eine Stunde vor der Bildgebung transferiert ein Dünndarm von einer Maus mit interstitiellen Zellen von Cajal oder ICC geerntet, die speziell einen genetisch kodierten Kalzium-Indikator auf das Stadium eines Spinnscheibe konfokalen Mikroskops ausdrücken. Und durchdringen Sie kontinuierlich das Gewebe mit 37 Grad Celsius Krebs-Ringer Bicarbonat oder KRB-Lösung. Mit einer 60 bis 100 X Vergrößerung lokalisieren Sie den stellatförmigen myenterischen Plexus ICC oder ICC-MY zwischen den kreisförmigen und längsglatten Muskelschichten des Dünndarms.
Dann lokalisieren Sie den spindelförmigen tiefen Muskelplexus ICC oder ICC-DMP in einer einzigen Ebene zwischen der kreisförmigen glatten Muskelschicht und dem submucosalen Plexus und speichern Sie die Filme als Stapel von TIFF-Bildern. Um raumzeitliche Karten oder STMs der ICC-DMP-Calciumaktivität zu erstellen, öffnen Sie den Bildstapel in ImageJ, und klicken Sie auf Bild, Typ und 32-Bit, um die Bildqualität zu ändern. Um einen Zeilenscan zu erstellen, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Linienauswahlwerkzeug, und wählen Sie die segmentierte Linie aus.
Zeichnen Sie mit einzelnen Linken klickt eine Linie entlang des mittleren Zugriffs eines einzelnen ICC-DMP, indem Sie doppelklicken, wenn die gesamte Zelle umrissen wurde. Wählen Sie Bild, Stapel und Reslice. Es wird ein Popupfenster angezeigt.
Wählen Sie Um90 Grad drehen, um den Linienscan von links nach rechts auszurichten, damit er kalibriert und gegen die Zeit auf der x-Achse mit Leerzeichen auf der y-Achse gelesen werden kann, und klicken Sie auf OK. Die raumzeitliche Karte wird angezeigt. Um die Amplitude der Kalziumsignale aus der Karte genau zu messen, wählen Sie die rechteckige Auswahl aus und zeichnen Sie einen Bereich von Interesse um das Gebiet innerhalb des STM, der den gleichmäßigsten und am wenigsten intensiven Fluoreszenzbereich anzeigt. Klicken Sie auf Analysieren und Histogramm, um einen Mittelwert der Intensität innerhalb des ausgewählten Interessenbereichs zu erhalten, und klicken Sie auf Bearbeiten, Auswahl, Alle auswählen, um den gesamten STM auszuwählen.
Klicken Sie als Nächstes auf Prozess, Mathe und Divide, und geben Sie den Mittelwert der Intensität mit der ausgewählten STM-Region ein, die von Interesse ist, in das Pop-up-Feld. Der STM wird schwarz. Korrigieren Sie dies, indem Sie im Popup-Fenster auf Bild, Anpassen, Helligkeit/Kontrast und Auto klicken.
Der Linienscan wird nun für die Amplitude mit der Intensität der Fluoreszenz kalibriert, ausgedrückt als Fluoreszenz geteilt durch die Nullfluoreszenz. Der STM zeigt die Anzahl der Frames im TIFF-Stack auf der x-Achse und die Anzahl der Pixel an, die die Länge der Zelle auf der y-Achse darstellen. Um die zeitlichen und räumlichen Daten aus den Calciumsignalen zu quantifizieren, klicken Sie auf Bild und Eigenschaften und geben Sie die entsprechenden Werte ein, um den STM vollständig auf Raum und Zeit im Pop-up-Fenster zu kalibrieren.
Um die einzelnen Calciumereignisse zu analysieren, klicken Sie auf Gerade Linie, und klicken und ziehen Sie auf den STM, um eine gerade horizontale Linie durch die Mitte eines Calciumereignisses parallel zur x-Achse zu zeichnen. Klicken Sie dann auf Analysieren und Plotprofil. Es wird ein Feld angezeigt, das das Diagrammprofil des Kalziumereignisses anzeigt.
Für die partikelbasierte Analyse der ICC-MY Calcium-Signaldaten öffnen Sie die Filmdatei in Volumetry und klicken Sie mit der rechten Maustaste, um STK-Filter, Differenzieren auszuwählen. Klicken Sie erneut mit der rechten Maustaste, um einen zu differenzierenden Wert einzugeben. Drücken Sie die Eingabetaste, und klicken Sie mit der linken Maustaste, um die Differenzierung zu initiieren.
Um Partikel zu erstellen, scrollen Sie mit der mittleren Maustaste durch den Film, um einen 20 bis 40 Frame-Abschnitt auszuwählen, der eine Ruhezeit enthält, gefolgt vom Auftreten eines kalziumtransienten Clusters und 20 bis 40 Frames, die direkt nach dem Cluster folgen. Wenn alle Frames mit der rechten Maustaste im Filmfenster ausgewählt wurden, um auf STK OPS Ramp DS-Partikelinformationen zuzugreifen, klicken Sie auf eine Partikelanalyseroutine, die den Schwellenwert schrittweise von der maximalen auf die minimale Intensität hochleitet. Um eine erfolgreiche Partikelanalyse sicherzustellen, stellen Sie sicher, dass Sie so viel präkalziumtransiente Cluster-Nichtaktivität und so viel post-Calcium transientCluster-Nichtaktivität wie möglich integrieren.
Dies wird dazu beitragen, das Signal-Rausch-Verhältnis zu erhöhen. Die Analyse wird im Plotfenster grafisch als Rauschendiagramm und im Ablaufverfolgungsfenster als drei Farbspuren dargestellt, wobei die grüne Spur die Anzahl der Partikel, die rote Spur, die die durchschnittliche Partikelgröße darstellt, und die blaue Spur, die den Schwellenwert für die absolute Intensität darstellt, darstellt. Um das Histogramm auszugleichen, drücken Sie die Darstellung des Partikelrauschens H auf der Tastatur.
Drücken Sie dann die rechte Klammertaste, um Farbschemata zu durchlaufen, bis der Hintergrund weiß ist und die Farbspuren oben sind. Drücken Sie einmal F auf der Tastatur, um ein Messwerkzeug aufzurufen. Drücken Sie dann ein zweites Mal F, um eine einzelne vertikale Linie in der Bildlaufleiste des Diagrammfensters auf dem Diagramm an der Kreuzung zu markieren, an der sich die farbigen Diagramme auf die rechte Seite verschieben.
Verwenden Sie im Ablaufverfolgungsfenster die mittlere Maustaste, um vom Wendepunkt der roten Spur zur markierten weißen vertikalen Linie zu scrollen. Nachdem Sie den angezeigten Y-Durchschnitt notiert haben, klicken Sie erneut auf die mittlere Maustaste im Ablaufverfolgungsfenster, um die Blaue Spur zu deaktivieren. Klicken Sie im Filmfenster auf C, um ein Farbrad aufzuführen, und D, um den Schwellenwert anzupassen.
Gültige Partikel werden nun rot angezeigt, und diejenigen, die gesättigt sind, werden weiß sein. Verwenden Sie die linke Maustaste, um zu scrollen, bis die weißen Bereiche entfernt sind, und verwenden Sie die mittlere Maustaste, um den gelben numerischen Wert im Farbrad an den Y-Durchschnittswert anzupassen, um alles in Rot als aktives transientes Kalziumpartikel am festgelegten Schwellenwert zuzuweisen. Um die Daten als koordinatenbasierte Partikeldatei zu speichern, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf STK 3D, speichern Sie Partikel Null, und klicken Sie mit der linken Maustaste, um die Datei zu speichern.
Um Partikelaktivitäts-Heatmaps zu erstellen, öffnen Sie die gespeicherte Partikeldatei und klicken Sie mit der rechten Maustaste in das Filmfenster, um auf Partikel STKops, StatMap Flag zuzugreifen und Flagzuweisungen einzugeben, um sie zu analysieren. Klicken Sie hierauf, um die Analyse und eine Heatmap anzuwenden, in der die Gesamtpartikel für die gesamte Aufzeichnungslänge mit unterschiedlichen Farben angezeigt werden, die das prozentuale Vorkommen während der Aufzeichnung darstellen. Klicken Sie mit der rechten Maustaste, um die Heatmap als TIFF-Datei zu speichern.
Klicken Sie dann mit der rechten Maustaste in das Filmfenster, um auf partikelmess, Partikelwerte STK gleich zu greifen, und geben Sie eine Flagzuweisung für die Analyse ein. Im Ablaufverfolgungsfenster wird eine Reihe von Ablaufverfolgungen generiert. Die STM-Analyse bietet die Möglichkeit, die räumlichen Merkmale der Calciumsignalisierung zu überwachen und aufzuzeichnen, wie z. B. die räumliche Ausbreitung und Ausbreitungsgeschwindigkeit.
Diese Informationen können angesammelt werden, um eine ziemlich vollständige Ansicht des Kalziumsignalverhaltens innerhalb von Zellen in ihren nativen Umgebungen zu bieten. Mittels Partikelanalyse können quantitative Informationen über die Kalziumsignalisierung durch Messung der Partikelfläche und der Partikelzahl berechnet werden, die zusammen verwendet werden können, um die räumlichen Bereiche der Calciumsignalaktivierung innerhalb eines bestimmten Sichtfeldes zu bestimmen. Die Partikelanalyse ermöglicht auch die eingehende Quantifizierung der subzellulären Calciumsignalisierung durch Untersuchung der Standort- und Brennwahrscheinlichkeiten von Kalziumbrennstellen.
Durch die Zuordnung der Partikel in verschiedene Flaggen basierend auf ihren zeitlichen Eigenschaften können die anrichtenden Teilchen genau abgebildet werden. Und eine Fülle von harten Daten über die Anzahl der Initiationsstandorte, die Größe des Standorts in Pixeln und Mikrometern, die Wahrscheinlichkeit, dass jede Initiationsstelle während jedes Kalzium-Transientenclusters ein- oder mehrmals ausgelöst wird, und der Prozentsatz der Brennstellen, die während jedes Kalziumtransienten-Cluster-Zyklus feuern, kann ermittelt werden. Konsistenz ist der Schlüssel zum Erfolg in diesem Protokoll.
Alle Datensätze und alle Filme müssen exakt gleich behandelt werden, um zuverlässige, wiederholbare Ergebnisse zu gewährleisten. Dies gilt insbesondere für den Umgang mit Partikeldateien. Unsere Protokolle ermöglichen eine tiefe Charakterisierung der Kalziumsignalisierung vor Ort, und eine Reihe statistischer Methoden kann bei sachgemäßer Verwendung Unterschiede zwischen einem Bereich räumlicher und zeitlicher Parameter bewerten.
Diese Analysetechniken in unserem Protokoll haben es Forschern ermöglicht, zuvor unadressierbare Fragen im Zusammenhang mit der Darmpacemaking und Darminnervation sowie der neuronalen Kontrolle der unteren Harnwege zu stellen und zu beantworten.
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Überblick
Diese Studie konzentriert sich auf die Verbesserung der Analyse von Kalzium-Bildgebungsdaten in Gewebeexperimenten, insbesondere unter Verwendung genetisch kodierter Ca2+ Indikatoren (GECIs). Sie bietet detaillierte Protokolle, die die Quantifizierung von Kalziumsignalen durch fortgeschrittene Analysetechniken erleichtern.
Wichtige Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Kalzium-Bildgebung
- Signalquantifizierung
- Gewebeanalyse
Hintergrund
- Verbesserte Datenerfassung aus Kalzium-Bildgebungsexperimenten
- Bedeutung genauer Analysetechniken bei der Erfassung der Kalziumsignalisierung
- Verwendung genetisch kodierter Indikatoren für In-situ-Bildgebung
Verwendete Methoden
- Raum-Zeit-Mapping
- Partikelbasierte Analyse
- Mikroskopietechniken (Konfokalmikroskop)
Hauptergebnisse
- Protokolle liefern räumliche, zeitliche und Intensitätsdaten, die für das Verständnis der Kalziumsignalisierung entscheidend sind
- Verbesserte Genauigkeit bei der Messung von Kalziumereignissen und ihren Eigenschaften
- Etabliertes Framework für die Analyse von Kalzium-Transient-Clustern in Gewebeproben
Schlussfolgerungen
- Die Studie demonstriert fortgeschrittene Methoden zur Quantifizierung von Kalziumsignalen in Geweben
- Unterstreicht die Bedeutung verfeinerter analytischer Ansätze für verbesserte biologische Einsichten in die Kalziumsignalisierung
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of intracellular Ca2+ signaling in native tissue environments is critical for de-risking target validation in gastrointestinal and neuromuscular drug discovery. Spatio-temporal mapping and particle-based analysis enable extraction of spatial, temporal, and intensity parameters from high-resolution Ca2+ imaging data, reducing reliance on simplistic ROI measurements that overlook signaling complexity. This approach supports mechanistic insight into pacemaker activity and neuronal control pathways, informing predictive confidence in early discovery stages.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying Ca2+ signaling patterns such as frequency, duration, propagation velocity, and amplitude in intact tissues.
- Operational Value: Supports biological de-risking through detailed characterization of interstitial cells of Cajal (ICC) activity, a key regulator of gastrointestinal motility.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by linking Ca2+ signaling dynamics to intestinal pacemaking and neuronal control of the lower urinary tract.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by generating quantitative outputs from Ca2+ transient clusters in situ.
- Operational Value: Enhances assay standardization and reproducibility through calibrated spatiotemporal maps (STMs) and particle-based analysis with defined thresholding and flag assignment protocols.
- Scalability: Enables screening readiness via coordinate-based particle files and heat maps that allow high-volume data processing and cross-experiment comparison.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase Ca2+ signaling analysis in intestinal ICC to preclinical validation of motility disorders and urinary tract dysfunction.
- Mechanistic De-risking: Allows in-depth quantification of subcellular Ca2+ signaling through examination of initiation site location, firing probability, and cluster dynamics.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by providing hard data on the number of initiation sites, site size in pixels/micrometers, and percentage of firing sites active per transient cluster cycle.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from Early Discovery through Lead Identification to Preclinical work by providing quantitative Ca2+ signaling data that informs target validation and assay readiness.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by capturing spatial spread and propagation velocity of Ca2+ signals via STM analysis.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible quantification of particle area and count, enabling spatial range determination of Ca2+ signal activation in a defined field of view.
- Analytics: Generates statistical outputs on temporal characteristics of particles, allowing allocation into flags to map initiating particles and assess firing probabilities.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling analysis of Ca2+ signaling patterns linked to intestinal pacemaking and neuronal control pathways.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for analyzing Ca2+ signaling across model systems through standardized protocols for STM calibration, particle analysis, and heat map generation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through reduction of mechanistic ambiguity in Ca2+ signaling dynamics.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability achieved via calibrated STMs, particle-based analysis with threshold adjustment, and coordinate-based data output.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk by enabling early detection of inconsistent or non-reproducible signaling patterns.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions supported by quantitative data on initiation site density, size, and firing reliability.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in confocal microscopy, ImageJ, and Volumetry for STM generation and particle analysis.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs include spinning disk confocal microscope, TIFF image stack handling, and software for line scan reslice, histogram balancing, and threshold adjustment.
- Cross-team standardization requirements involve consistent treatment of all data sets and movies to ensure reliable, repeatable results, particularly for particle file generation and flag-based analysis.
- Adaptation considerations across model systems include adjusting line scan orientation, frame selection for quiescent and active periods, and threshold calibration based on fluorescence intensity profiles.
- Practical limitations include the need for careful selection of 20–40 frame sections encompassing quiescent periods, Ca2+ transient clusters, and post-cluster activity to ensure successful particle analysis and optimal signal-to-noise ratio.
