Name: Site-verwiesene Mutagenese für In Vitro und In Vivo Experimente veranschaulicht mit RNA-Interaktionen in Escherichia Coli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Lernen Sie die ortsspezifische Mutagenese mit 2- und 3-Schritt-PCR zur Untersuchung von RNA-Interaktionen in Escherichia coli. Diese kostengünstige Methode ermöglicht gezielte Mutationen für molekularbiologische Studien.

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Die Autoren möchten University of Southern Denmark open-Access-Politik Zuschüsse zu danken.

(1) Vektorauswahl
<ol><li>Wählen Sie einen Vektor mit nachgeschalteten Experimente durchführen. Jeder Vektor ist für diese 2 - und 3-stufige PCR Methode anwendbar.</li>
	<li>Je nach Auswahl des Vektors, wählen Sie geeignete Restriktionsenzyme zum Klonen.</li>
</ol>2. besser gekleideteres Design für Website gerichtet Mutagenese
<ol><li>Entscheiden Sie sich zwischen entweder 2 oder 3-Schritt PCR-Strategie (2-Schritt gilt nur für Mutationen < 200 bp von beiden Enden der DNA des Interesses). Gehen Sie für die 2-stufige PCR zu Schritt 2.2 und für die 3-Stufen-PCR gehen Sie zu Schritt 2.3.</li>
	<li>Primer für 2-stufige PCR zu entwerfen.<ol>
<li>Design Grundierung 1 und 3, die DNA des Interesses und mit einer 5' zu verstärken, dass Überhang enthält 4 Nukleotide (z. B. ATAT oder AGCT) gefolgt von der entsprechenden Einschränkung Anerkennung Website notwendig, in den gewählten Vektor zu klonen.</li>
		<li>Design Grundierung 2 Auge auf die gewünschte Webseite(n) einzuführen und flankieren die Mutation mit 10-15 komplementären Nukleotide auf beiden Seiten. Machen Sie den Primer umkehren, wenn die Mutation am 5'-Ende eingeführt wird oder weiterleiten Sie, wenn die Mutation am 3'-Ende eingeführt wird.</li>
	</ol>
</li>
	<li>3-Stufen-PCR Primer Design.<ol>
<li>Design Grundierung 1 und 4, die DNA des Interesses und mit einer 5' zu verstärken, dass Überhang enthält 4 Nukleotide (z. B. ATAT oder AGCT) gefolgt von der entsprechenden Einschränkung Anerkennung Website notwendig, in den gewählten Vektor zu klonen.</li>
		<li>Design Grundierung 2 und 3 zur Einführung Auge auf gewünschte Webseite(n) und flankieren die Mutation von 10-15 komplementären Nukleotide auf beiden Seiten. Primer 2 und 3 sind ergänzende umzukehren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(3) PCR Verstärkung der Wildtyp-DNA für Klonen
Hinweis: Einzelheiten zur PCR, siehe6.
<ol><li>Führen Sie PCR6 mit Primer 1 + 2 (2-stufige PCR) oder 1 + 4 (3-Stufen-PCR) und verwenden Sie Wildtyp-DNA als Vorlage, um PCR Produkt I. Verwendung der PCR-Programm in der Tabelle 1zu erhalten.</li>
	<li>Validieren Sie PCR durch Agarose-Gelelektrophorese.<ol>
<li>Machen Sie eine Agarose-gel-Lösung (2 %) durch Zugabe von 2 g Agarose pro 100 mL 1 X Tris-Acetat-Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) (TAE) Säurepuffer. Lösen Sie die Agarose durch Kochen in der Mikrowelle auf. Fügen Sie die DNA-Färbung Farbstoff Interkalation Bromid (um eine Endkonzentration von ~ 0,5 µg/mL) um die Agarose gel-Lösung zur Visualisierung.</li>
		<li>Gegossen Sie Agarosegel, legen Sie sie in eine Elektrophorese-Einheit und laden Sie PCR-Proben (gemischt mit DNA Loading Dye) und eine DNA-Leiter bekannter Größe zu. Laufen Sie Proben bei 75 W 45 min oder, bis Bands ausreichend getrennt sind und Bands an einem Tisch mit ultravioletten (UV) oder mit einem Gel imaging-System zu visualisieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Reinigen Sie das PCR-Produkt mit einem Gel Extraction Kit (Table of Materials) und Messen Sie die Konzentration des gereinigten DNA mit einem Spektrophotometer (Table of Materials).</li>
	<li>Speichern Sie die gereinigte DNA bei-20 ° C (im Tris-EDTA (TE) Puffer – langfristige Lagerung) oder 4 ° C (im dH2O – kurzfristige Lagerung) erst bei Schritt 5.</li>
</ol>(4) PCR, Site-verwiesene Mutationen in der DNA vorzustellen
<ol><li>PCR für 2-stufige PCR (siehe Punkt 4.2 für 3-Stufen-PCR)<ol>
<li>Führen Sie PCR6 mit Primer 1 + 2, wenn Mutationen in 5'-Ende sind oder 2 + 3 sind die Mutationen in den 3' Ende und Wildtyp-DNA als Vorlage verwenden, um PCR-Produkt II zu erhalten (siehe Tabelle 1 für PCR-Programm).</li>
		<li>Validieren Sie PCR durch Agarose-Gelelektrophorese, wie in Schritt 3.2.1 und 3.2.2.</li>
		<li>Reinigen Sie das PCR-Produkt mit einem Gel Extraction Kit (Table of Materials) und Messen Sie die Konzentration des gereinigten DNA mit einem Spektrophotometer (Table of Materials).</li>
		<li>Store gereinigte DNA bei-20 ° C (in TE-Puffer) oder 4 ° C (im dH2O) erst bei Schritt 5.</li>
		<li>PCR-6 mit PCR-Produkt II als Primer zusammen mit Primer 3 wenn Mutationen in der 5'-Ende oder Primer 1 sind wenn die Mutationen am 3'-Ende sind und Wildtyp-DNA als Vorlage zu PCR-Produkt III durchführen (siehe Tabelle 1 für PCR-Programm).</li>
		<li>Validieren Sie PCR durch Agarose-Gelelektrophorese, wie in Schritt 3.2.1 und 3.2.2.</li>
		<li>Reinigen Sie PCR-Produkt mit einem Gel Extraction Kit (Table of Materials) und Messen Sie die Konzentration von gereinigte DNA mit einem Spektrophotometer (Table of Materials).</li>
		<li>Store gereinigte DNA bei-20 ° C (in TE-Puffer) oder 4 ° C (im dH2O) bis Schritt 5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PCR für die 3-Stufen-PCR<ol>
<li>PCR-6 mit Primer 1 + 2 und 3 + 4 in separaten Reaktionen führen und Wildtyp-DNA als Vorlage verwenden, um PCR-Produkt erwerben II und III (siehe Tabelle 1 für PCR-Programm).</li>
		<li>PCRs durch Agarose-Gelelektrophorese, wie in Schritt 3.2.1 und 3.2.2 zu validieren.</li>
		<li>Reinigen Sie PCR-Produkte mit einem Gel Extraction Kit (Table of Materials) und Messen Sie die Konzentration des gereinigten DNA mit einem Spektrophotometer (Table of Materials).</li>
		<li>Store gereinigte DNA bei-20 ° C (in TE-Puffer) oder 4 ° C (im dH2O).</li>
		<li>Führen PCR6 mit Primer 1 + 4 und 2 bis 5 ng beider PCR Produkte II und III als Vorlagen (in der gleichen Reaktion) verwenden, um PCR-Produkt IV zu erhalten (siehe Tabelle 1 für PCR-Programm).</li>
		<li>Validieren Sie PCR durch Agarose-Gelelektrophorese, wie in Schritt 3.2.1 und 3.2.2. Hinweis: Es ist nicht ungewöhnlich, dass mehrere falsche Bands bekommen (kann manchmal verringert werden durch die Verwendung weniger Vorlage). Die falsche PCR-Produkte können jedoch ignoriert werden, wenn die richtig dimensionierte Band herausgeschnitten und Gel extrahiert wird.</li>
		<li>Wenn du es richtig, reinigen Sie PCR-Produkt mit einem Gel Extraction Kit (Table of Materials) und Messen Sie die Konzentration von gereinigte DNA mit einem Spektrophotometer (Table of Materials).</li>
		<li>Store gereinigte DNA bei-20 ° C (in TE-Puffer) oder 4 ° C (im dH2O) bis Schritt 5.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(5) Rekombination von Wildtyp und Mutanten Version(en) von DNA in den gewählten Vektor
Hinweis: Einzelheiten zu folgenden Schritten finden Sie7.
<ol><li>Digest gereinigt PCR-Produkte I und III (von 2-stufige PCR) bzw. IV (von 3-Stufen-PCR) unter Verwendung der entsprechenden Restriktionsenzyme.<ol>
<li>In 20 µL 1 x Verdauung Puffer mit 1 µL jedes Restriktionsenzym verdauen 200 ng PCR-Produktes bei 37 ° C für 30-60 Minuten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verdaute PCR-Produkt durch Gel-Extraktion mit einem Gel Extraction Kit (Table of Materials) zu reinigen, die DNA-Konzentration von gereinigte DNA mit einem Spektrophotometer (Table of Materials) messen und speichern bei-20 ° C (in TE-Puffer) oder 4 ° C (in dH2 O) bis zum Schritt 5.6.</li>
	<li>Gereinigten Vektor mit relevanten Restriktionsenzymen zu verdauen und behandeln mit alkalischer Phosphatase, Vektor Re Ligatur Ereignisse zu verringern. Behandeln Sie nicht PCR-Produkte mit alkalischer Phosphatase.<ol>
<li>In 30 µL 1 x Verdauung Puffer mit 1 µL jedes Restriktionsenzym und 1 µL alkalische Phosphatase, Digest 1.000 ng des Vektors bei 37 ° C für 30-60 Minuten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Separate verdauten Vektor aus Abfall DNA (z. B. ungeschnitten Vektor und Cut-out DNA) mit Agarose-Gelelektrophorese, wie in Schritt 3.2.1 und 3.2.2.</li>
	<li>Reinigen verdauten Vektor durch Gel-Extraktion mit einem Gel Extraction Kit (Table of Materials), DNA-Konzentration von gereinigte DNA mit einem Spektrophotometer (Table of Materials) messen und speichern bei-20 ° C (in TE-Puffer) oder 4 ° C (im dH2O) bis für Schritt 5.6 verwendet.</li>
	<li>Verbinden Sie verdauten PCR-Produkte in verdauten Vektor mit den Reaktionen, die in Tabelle 2angegeben.</li>
	<li>Inkubation bei Raumtemperatur für 2 Stunden oder über Nacht bei 16 ° C.</li>
	<li>Verwandeln Sie Empfänger Belastung (z. B. E. Coli K12) mit Ligatur Reaktionen.<ol>
<li>Belastung bis OD600wachsen = 0,3-0,5 und 1 mL Transfer Kultur, soviele 1,5 mL-Röhrchen als Ligase Reaktionen.</li>
		<li>Drehen Sie bei 3.500 X g für 5 min und verwerfen Sie überstand.</li>
		<li>Aufschwemmen Sie Zellen in 200 μL der Transformation-Puffer (10 mL Lysogeny Brühe (LB) mit 0,1 g/mL Polyethylenglykol 3350, 5 % Dimethyl Sulfat und 20 mM MgCl2).</li>
		<li>Ligatur-Reaktion, und die Rohre für 30 min auf Eis.</li>
		<li>Hitze-Schock für 2 min bei 42 ° C.</li>
		<li>Die 1,5 mL Röhrchen 1 mL LB hinzu, und erlauben Sie Phänotyp der Antibiotikaresistenz für mindestens 45 Minuten bei 37 ° C.</li>
		<li>Drehen Sie die Zellen bei 3.500 X g für 5 min, 1 mL des Überstandes verwerfen und Aufschwemmen der Zellen im restlichen überstand.</li>
		<li>Platte die Zellen auf Platten mit geeigneten Antibiotika und über Nacht bei 37 ° c inkubieren</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transformanten beherbergen Vektoren mit erfolgreichen Integration der DNA einfügen (z. B. durch PCR mit Vektor - und Insert-spezifische Primer) zu identifizieren.</li>
	<li>Validieren der Sequenz der DNA von Sanger Sequenzierung. Achtung: Verwenden Sie nicht die gleichen Primer zur Sequenzierung für Schritt 5.9 verwendet.</li>
</ol>6. verwenden konstruierte Vektoren für in-vitro- und in-vivo-Experimente
<ol><li>In Vivo-experiment Hinweis: Dies ist ein Beispiel für die Verwendung eines Vektors Wildtyp/mutierte RNA zu charakterisieren posttranskriptionale Verordnung zum Ausdruck bringen. Für weitere Details über das westliche Beflecken siehe8.<ol>
<li>Wachsen Sie E. Coli K12-Stämme mit konstruierten Vektoren in geeigneter Form zu und induzieren Sie Ausdruck zu, wenn erforderlich. Ernten Sie Proben durch Zentrifugation.</li>
		<li>Sodium Dodecyl Sulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) durch Auflösen der Zelle Pellets im 1 x SDS-Probenpuffer Proben vorbereiten (62,5 mM Tris-HCl pH 6,8, 2,5 % SDS, 0,002 % Bromophenol Blue, 5 % β-Mercaptoethanol, 10 % Glycerin) und kochen bei 95 ° C für 5 min. Hinweis: Es ist möglich, eine Gel gegossen oder verwenden Sie eine handelsübliche Betonfertigteile Gel. Letzteres wurde in die Ergebnisse in Abbildung 3 (Table of Materials) verwendet.</li>
		<li>Wägezellen Sie 107 -jeder Probe in separaten Brunnen (mit einer Protein-Leiter) und betrieben Sie Gel bei 200 V, bis Proteine (ca. 45 min) getrennt sind.</li>
		<li>Beflecken der Proteine auf eine Zellulose-Membran durch semi-dry Transfer bei 80 mA 1 h.</li>
		<li>Blockieren Sie die Membran mit einer Mischung aus Proteinen (z. B. 5 % Milch-Pulver aufgelöst in 1 X Tween 20-Tris gepufferte Kochsalzlösung (TTB) Puffer).</li>
		<li>Fügen Sie Primärantikörper (aufgelöst in 1 X TTBS-Puffer), die das Protein des Interesses (z. B. GFP, Flagge- oder KIS-markierte Protein) und 1 h unter schonenden rühren inkubieren.</li>
		<li>Waschen Sie die Membran in 1 X TTBS für 10 min, ungebundenen Antikörper zu entfernen. Zweimal wiederholen Sie mehr.</li>
		<li>Fügen Sie Sekundärantikörper (aufgelöst in 1 X TTBS-Puffer), die den primären Antikörper richtet sich an und lassen für die Erkennung (z. B. Meerrettich Peroxidase (HRP)-konjugierten Sekundärantikörper. 1 h unter schonenden rühren inkubieren.</li>
		<li>Waschen Sie die Membran in 1 X TTBS für 10 min, ungebundenen Antikörper zu entfernen. Zweimal wiederholen Sie mehr.</li>
		<li>Visualisieren Sie die Membran mit einer Technik, die kompatibel mit den sekundären Antikörper (z. B. durch Bildgebung nach Inkubation mit ein Chemilumineszenz Luminol abgeleitet, wenn ein HRP-konjugierten Sekundärantikörper verwendet wurde).</li>
	</ol>
</li>
	<li>In-vitro-experiment Hinweis: Dies ist ein Beispiel für die Verwendung des Vektors als Vorlage für in-vitro-Transkription von RNA RNS-Protein-Interaktionen zu charakterisieren. Für weitere Details zu EMSA siehe9.<ol>
<li>In-vitro-Transkripte mit einem T7 in Vitro Transkription Kit (Table of Materials) und Vektoren aus Schritt 5 als Vorlagen zu machen.</li>
		<li>Trennen Sie RNA-Transkripte von Seite auf einem 4,5 % 7 M Harnstoff Denaturierung Gel zu, und extrahieren Sie RNA direkt vom Gel von Electro Elution mit Dialyse Röhren (Table of Materials).</li>
		<li>Beschriften Sie RNA (z. B. mit γ -32P-ATP enzymatische mit T4-Polynukleotid-Kinase (Table of Materials) und reinigen wieder mit Spalten (Table of Materials). Achtung: Vor dem arbeiten mit radioaktivem Material, wenden Sie sich an den lokalen Strahlung Sicherheitsbeauftragten.</li>
		<li>Mischen Sie beschriftet-RNA mit steigenden Konzentrationen des Proteins in separaten Reaktionen in einem 1 x Bindung Puffer (20 mM Tris, pH 8, 100 mM KCl, MgCl2, 1 mM 1 mM Dithiothreitol (DTT)). Hinweis: In den vorgestellten Ergebnissen (Abbildung 4), 2 nM des radioaktiven CsgD mRNA wurde mit einer Steigung von 0 bis 2 µM Hfq Protein (Monomerkonzentration) gemischt.</li>
		<li>Lassen Sie Proteine und RNA zu hybridisieren vor dem Laden Hybridisierung Mischung auf einem nicht denaturierenden Polyacrylamid-Gel und das Gel für 1,5 h bei 200 V laufen.</li>
		<li>Visualisieren Sie das Gel mit einer Technik mit der Kennzeichnung von Schritt 6.1.3 kompatibel. (z. B. durch Phosphoimaging wenn enzymatische angewendet wurde).</li>
		<li>Quantifizieren Sie die relative Intensität der verschobenen Bands mit einer Bildgebung Verarbeitung Programm zu und passen Sie eine Kurve (sigmoidale), um die Daten mithilfe ein Graphen und Datenanalyse-Software (Table of Materials). Basierend auf die angepasste Kurve, können Dissoziation Konstante (Kd) Werte automatisch mit der Software ermittelt werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Bouvier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+RNA+binding+to+5%27+mRNA+coding+region+inhibits+translational+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Small RNA binding to 5' mRNA coding region inhibits translational initiation.</a> Molecular Cell. 32 (6), 827-837 (2008).</li>
<li>Jorgensen, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+regulatory+RNAs+control+the+multi-cellular+adhesive+lifestyle+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbioly%22%5BJournal%5D)">Small regulatory RNAs control the multi-cellular adhesive lifestyle of Escherichia coli.</a> Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).</li>
<li>Antal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+bacterial+RNA+regulates+a+putative+ABC+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A small bacterial RNA regulates a putative ABC transporter.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280 (9), 7901-7908 (2005).</li>
<li>Andreassen, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((sRNA-dependent+control+of+curli+biosynthesis+in+Escherichia+coli%3A+McaS+directs+endonucleolytic+cleavage+of+csgD+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">sRNA-dependent control of curli biosynthesis in Escherichia coli: McaS directs endonucleolytic cleavage of csgD mRNA.</a> Nucleic Acids Research. , (2018).</li>
<li>Thomason, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+RNA+that+regulates+motility+and+biofilm+formation+in+response+to+changes+in+nutrient+availability+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbioly%22%5BJournal%5D)">A small RNA that regulates motility and biofilm formation in response to changes in nutrient availability in Escherichia coli.</a> Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction%3A+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e3998(2012).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JoVE+Science+Education+Database.+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Molecular+Cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning.</a> Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JoVE+Science+Education+Database.+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+The+Western+Blot%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot.</a> Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JoVE+Science+Education+Database.+Biochemistry.+Electrophoretic+Mobility+Shift+Assay+%28EMSA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">JoVE Science Education Database. Biochemistry. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA).</a> Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).</li>
<li>Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+site-specific+mutagenesis+without+phenotypic+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (2), 488-492 (1985).</li>
<li>Laible, M., Boonrod, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homemade+site+directed+mutagenesis+of+whole+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).</li>
<li>Wells, J. A., Vasser, M., Powers, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cassette+mutagenesis%3A+an+efficient+method+for+generation+of+multiple+mutations+at+defined+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites.</a> Gene. 34 (2-3), 315-323 (1985).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.

Site-verwiesene Mutagenese hat eine breite Palette von Anwendungsmöglichkeiten, und hier, repräsentative Ergebnisse aus in-vivo und in vitro-Experiment wurden als Beispiele für biologische Schlüsse mit Hilfe der Technik aufgenommen. Site-verwiesene Mutagenese ist seit lange der goldene Standard für RNA-Wechselwirkungsstudien. Die Stärke des Verfahrens liegt in der Kombination der relevanten Mutationen mit nachgeschalteten Tests und Experimenten (z. B. western-Blot oder EMSA) Rückschlüsse auf bestimmte DNA-Websites und ih...

DNA wird oft bezeichnet als die Blaupause einer lebenden Zelle da alle Strukturen der Zelle in der Reihenfolge ihrer DNA kodiert werden. Exakte Replikation und DNA-Reparaturmechanismen sicherstellen, dass nur eine sehr geringe Raten von Mutationen auftreten, das ist wichtig für die Erhaltung der richtigen Funktionen kodiert Gene. Veränderungen der DNA-Sequenz können aufeinander folgende Funktionen auf verschiedenen Ebenen, beginnend mit DNA (Anerkennung von Transkriptionsfaktoren und Restriktionsenzyme), dann RNA (Basenpaar Komplementarität und Sekundärstruktur Veränderungen) und/oder Protein (Aminosäuren beeinflussen. saure Substitutionen, Streichungen, Ergänzungen oder Frame-Schichten). Während viele Mutationen Genfunktion nicht erheblich beeinträchtigen, können einige Mutationen in der DNA enorme Auswirkungen haben. Site-verwiesene Mutagenese ist damit ein wertvolles Instrument für die Untersuchung der Bedeutung spezifischer DNA-Standorte auf allen Ebenen.
Dieses Protokoll beschreibt einen gezielte Mutagenese-Ansatz verwendet, um bestimmte Mutationen einzuführen. Das Protokoll stützt sich auf zwei verschiedenen PCR-Strategien: eine 2-stufige oder ein 3-Stufen-PCR. Die 2-stufige PCR ist anwendbar, wenn die gewünschte Mutation in der Nähe von 5'-Ende oder der 3'-Ende der DNA von Interesse ist (< 200 Basenpaaren (bp) vom Ende) und die 3-Stufen-PCR ist in allen Fällen anwendbar.
In der 2-Schritt-PCR-Ansatz 3 Grundierungen sind so konzipiert, in denen ein Set der Zündkapseln ist konzipiert, um die DNA des Interesses (Primer 1 und 3, weiterleiten und rückgängig zu machen, beziehungsweise) verstärken und eine einheitliche Grundierung wurde entwickelt, um die Mutation zu integrieren. Die Mutation, die Einführung der Grundierung (Primer 2) sollte eine umgekehrter Orientierung haben, wenn die Mutation in der Nähe von 5'-Ende und eine nach vorne Ausrichtung, ist wenn die Mutation in der Nähe der 3'-Ende ist. Im ersten Schritt PCR verstärkt Primer 1 + 2 oder 2 + 3 ein kleines Fragment in der Nähe der 5'-Ende oder 3' Ende, beziehungsweise. Das daraus resultierende PCR-Produkt dient dann als Grundierung in Schritt 2 mit Primer 1 oder 3, wodurch sich ein PCR-Produkt mit einer Mutation in der DNA des Interesses (Abbildung 1A).
In der 3-Stufen-PCR 4 Primer dienen, in denen ein Satz von Primern ausgelegt ist, verstärken die DNA des Interesses (Primer 1 und 4, weiterleiten und rückgängig zu machen, beziehungsweise) und einen Satz von Primern wurde entwickelt, um spezifische Mutationen mit überlappenden Komplementarität zu integrieren (Primer 2 und 3, rückwärts und vorwärts, bzw.). In Schritt eins und zwei, Primer 1 + 2 und 3 + 4 der 5' und 3'-Ende zu verstärken. In Schritt drei die daraus resultierende PCR-Produkte von Schritt eins und zwei sind als Vorlage verwendet und mit Primer 1 + 4 verstärkt. So ist die resultierende PCR-Produkt die DNA des Interesses mit der gewünschten Mutation (Abbildung 1 b).
Während die mutierte DNA für alle nachgelagerten Anwendungen verwendet werden kann, beschreibt dieses Protokoll die DNA in ein Klonen Vektor neu zu kombinieren. Die Nutzung des Klonens Vektoren hat mehrere Vorteile wie einfache Klonierung und spezifische experimentelle Anwendungen abhängig von den Funktionen des Vektors. Diese Funktion wird oft für RNA-Wechselwirkungsstudien verwendet. Eine andere Technik für RNA-Wechselwirkungsstudien ist strukturelle sondieren der RNA im Komplex mit einem anderen RNA1,2 oder Protein3,4. Jedoch strukturelle sondieren in-vitro-erfolgt erst während Site-verwiesene Mutagenese und anschließende Klonen für Studien zu Wechselwirkungen in vivo ermöglichen.
Site-verwiesene Mutagenese ist beträchtlich für RNA-Wechselwirkungsstudien benutzt worden, wie hier dargestellt. Jedoch die Schlüsselmethode über 2 oder 3-Stufen-PCR gilt für jedes Stück der DNA und somit nicht nur auf RNA-Wechselwirkungsstudien beschränkt.
Um die Technik und ihre Einsatzmöglichkeiten veranschaulichen, dient der Charakterisierung der Regionen wichtig für posttranskriptionale Verordnung der mRNA, CsgD, von Escherichia coli (E. Coli). In E. Coli, CsgD zielt durch die kleine nicht-kodierende RNA, McaS, in Zusammenarbeit mit einem Protein, Hfq, Proteinexpression von CsgD2,4,5zu unterdrücken. Die Technik wird verwendet, um Mutationen der Basis-Paarung Region zwischen CsgD und McaS und der Hfq-Bindungsstelle des CsgDeinzuführen. Die erhaltenen DNA wird dann in einen Vektor geeignet für spätere Experimente geklont. Downstream-Anwendungen der Technik sind in vivo und in-vitro-Experimente. Zur Veranschaulichung Beispiel 1 zeichnet in-vivo mit einem western-Blot-Test und Beispiel 2 in-vitro-mit einem elektrophoretische Mobilität Verschiebung Assay (EMSA) gekennzeichnet ist. In beiden Fällen ist es illustrierte wie Site-verwiesene Mutagenese in Kombination mit anderen Techniken verwendet werden kann, zu biologischen Rückschlüsse auf ein Gen von Interesse.

<table><tbody><tr><td>Anti-GroEL-Antikörper, hergestellt in Kaninchen</td><td>Merck</td><td>G6532</td><td>Primärer Antikörper</td></tr><tr><td>Azure c200</td><td>Azure</td><td>NA</td><td>Gel Imaging Workstation</td></tr><tr><td>Kundenspezifisches DNA-Oligo</td><td>Merck</td><td>VC00021</td><td></td></tr><tr><td>DeNovix DS-11</td><td>DeNovix</td><td>NA</td><td>Spektralphotometer für Nukleinsäuremessungen</td></tr><tr><td>DNA-Gel-Ladefarbstoff (6X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>Ethidiumbromid-Lösung 1 %</td><td>Carl Roth</td><td>2218.1</td><td></td></tr><tr><td>GeneJET Gel Extraction Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0691</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler DNA Ladder Mix</td><td>Fermentas</td><td>SM0333</td><td></td></tr><tr><td>Gerard GeBAflex-Röhrchen Midi</td><td>Gerard Biotech</td><td>TO12</td><td>Dialyseröhrchen für die Elektroelution</td></tr><tr><td>MEGAscript T7 Transkriptionskit</td><td>Invitrogen</td><td>AM1334</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Sub-Zelle GT Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>1704406</td><td>Horizontales Elektrophoresesystem</td></tr><tr><td>Monoklonaler ANTI-FLAG M2-Antikörper, hergestellt in</td><td>Maus Merck</td><td>F3165</td><td>Primärer Antikörper</td></tr><tr><td>Maus Immunglobuline</td><td>Dako Cytomation</td><td>P0447</td><td>HRP konjugierter Sekundärantikörper</td></tr><tr><td>NucleoSpin miRNA</td><td>Macherey Nagel</td><td>740971 RNA-Aufreinigung</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gele</td><td>Thermo Scientific</td><td>NP0323BOX</td><td>Bis-Tris Gele für die Proteintrennung</td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix mit HF-Puffer</td><td>New England Biolabs</td><td>M0531S</td><td>DNA-Polymerase</td></tr><tr><td>PowerPac HC Hochstrom-Netzteil</td><td>Bio-Rad</td><td>1645052</td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen Immunglobuline</td><td>Dako Cytomation</td><td>P0448</td><td>HRP konjugiert Sekundärantikörper</td></tr><tr><td>SeaKem LE Agarose</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>SigmaPlot</td><td>Systat Software Inc</td><td>NA</td><td>Grafik- und Datenanalyse-Softwaretool</td></tr><tr><td>T100 Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad 1861096 PCR-Maschine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA-Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202</td><td>Ligase</td></tr><tr><td>T4 Polynukleotidkinase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>TAE-Puffer (Trisacetat-EDTA) (50X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>B49</td><td></td></tr></tbody></table>

site-verwiesene mutagenese für in vitro und in vivo experimente veranschaulicht mit rna-interaktionen in escherichia coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-verwiesene Mutagenese ist eine Technik verwendet, um bestimmte Mutationen in der DNA zu untersuchen, die Interaktion zwischen kleine nicht-kodierende Ribonukleinsäure (sRNA) Moleküle und Ziel-Messenger-RNAs (mRNAs) einzuführen. Darüber hinaus dient die Site-verwiesene Mutagenese spezifischen Proteins Bindestellen RNA zuordnen. Eine 2- und 3-Schritt PCR-basierte Einführung von Mutationen wird beschrieben. Der Ansatz ist für alle Protein-RNA und RNA-RNA Wechselwirkungsstudien relevanten. Kurz gesagt, setzt die Technik auf Primer mit der gewünschten Auge und durch 2 oder 3 Schritte der PCR Synthese ein PCR-Produkt mit der Mutation zu entwerfen. Das PCR-Produkt wird dann zum Klonen verwendet. Hier beschreiben wir, wie auszuführenden Site-verwiesene Mutagenese mit dem 2 - und 3-Schritt-Ansatz einzuführen Mutationen die sRNA, McaS und die mRNA, CsgD, RNA-RNA und RNA-Protein-Interaktionen zu untersuchen. Wir wenden diese Technik um RNA Interaktionen zu untersuchen; Allerdings ist die Technik für alle Mutagenese Studien (z. B. DNA-Protein Interaktionen, Aminosäure Substitution/löschen/hinzufügen). Es ist möglich, jede Art von Mutation mit Ausnahme von nicht natürlichen Basen einzuführen, aber die Technik ist nur anwendbar, wenn ein PCR-Produkt für nachgeschaltete Anwendung (z. B. Klonen und Vorlage für weitere PCR) verwendet werden kann.

RNA-Interaktionen bezüglich posttranskriptionale Regulierung des CsgD, untersucht eine doppelte Vektor-Setup wurde gewählt: eine CsgD zum Ausdruck bringen mRNA und eine weitere kleine nicht-kodierende RNA, McaS zum Ausdruck bringen. CsgD wurde in pBAD33, die eine Arabinose induzierbaren Medium-Kopie Plasmid mit Chloramphenicol Widerstand ist geklont und McaS in Mini R1 pNDM220, die eine Isopropyl-β-D-1-Thiogalactopyranoside (IPTG) induzierbaren niedrigen Kopie P...

Site-verwiesene Mutagenese ist eine Technik verwendet, um bestimmte Mutationen in Desoxyribonukleinsäure (DNA) einzuführen. Dieses Protokoll beschreibt, wie Sie die Site-verwiesene Mutagenese mit einem 2-Schritt tun und 3-Stufen-Polymerase-Kettenreaktion (PCR) basierenden Ansatz, die auf DNA-Fragment von Interesse anwendbar ist.

Site-verwiesene Mutagenese für In Vitro und In Vivo Experimente veranschaulicht mit RNA-Interaktionen in Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Die standortgesteuerte Mutagenese ist nützlich, um molekulare Wechselwirkungen wie RNA-RNA und RNA-Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen. Dieses Protokoll beschreibt, wie standortgesteuerte Mutagenese mit einem zwei- oder dreistufigen PCR-Ansatz durchgeführt werden. Die Hauptvorteile der Methode sind die Vielfalt der verschiedenen Mutationen, die integriert werden können, sowie eine relative Leichtigkeit und Kosten dafür.Verwenden Sie zunächst die Wildtyp-DNA-Vorlage und die Primerpaare zwei, eins und zwei, drei, spezifisch für 2-Schritte- oder Primerpaare drei, eins und drei, vier, spezifisch für 3-Stufige PCR, um PCR-Produkt eins zu erhalten. Um PCR-Produkte durch Agarose-Gel-Elektrophorese zu validieren, machen Sie ein 2%Agarose-Gel, indem Sie zwei Gramm Agarose in 100 Milliliter 1x TAE-Puffer mit einem Mikrowellenherd auflösen. Fügen Sie Ethidiumbromid bei einer Endkonzentration von 0,5 Mikrogramm pro Milliliter hinzu.Dann das Agarose-Gel gießen. Wenn Sie erstarrt sind, legen Sie es in eine Elektrophoreseeinheit. Laden Sie eine DNA-Leiter von bekannter Größe, und die PCR-Proben gemischt mit DNA-Ladefarbstoff in Brunnen.Führen Sie Proben bei 75 Volt für 45 Minuten. Und visualisieren Sie Bänder auf einem UV-Transilluminator oder mit einem Gel-Bildgebungssystem. Als nächstes reinigen Sie das PCR-Produkt mit einem Gel-Extraktionskit nach dem Herstellerprotokoll und messen Sie die Konzentration der gereinigten DNA mit einem Spektralphotometer.Dann lagern Sie die gereinigte DNA bei minus 20 Grad Celsius im TE-Puffer. Um mit einer 2-stufigen PCR-Datei zu beginnen, verwenden Sie zunächst die Wildtyp-DNA-Vorlage, dann paart die Grundierung zwei, eins und zwei, zwei, für fünf Primermutationen oder Primerpaare zwei, zwei und zwei, drei für drei Primentmutationen, um PCR-Produkt zwei zu erhalten. Validieren Sie das PCR-Produkt durch Gelelektrophorese, reinigen Sie das PCR-Produkt und messen Sie seine Konzentration wie zuvor beschrieben.Verwenden Sie dann die Wild-Typ-DNA-Vorlage und das PCR-Produkt zwei als Primer, zusammen mit Primer zwei, drei für fünf Priment-Mutation, oder Primer zwei, eine für drei Priment-Mutation, um PCR-Produkt drei zu erhalten. Validieren Sie das PCR-Produkt durch Gelelektrophorese, reinigen Sie das PCR-Produkt und messen Sie seine Konzentration wie zuvor beschrieben. Dann speichern Sie die gereinigte DNA bei minus 20 Grad Celsius im TE-Puffer.Um die standortdirekte Mutagenese mit einer 3-stufigen PCR zu beginnen, verwenden Sie zunächst die Wildtyp-DNA-Vorlage und die Primerpaare drei, eins und drei, zwei, um PCR-Produkt zwei zu erhalten. Verwenden Sie die Wild-Typ-DNA-Vorlage und Primer-Paare drei, drei und drei, vier, um PCR-Produkt drei zu erhalten. Verwenden Sie die Wild-Typ-DNA-Vorlage und Primer-Paare drei, drei und drei, vier, um PCR-Produkt drei zu erhalten.Validieren Sie das PCR-Produkt durch Gelelektrophorese, reinigen Sie das PCR-Produkt und messen Sie seine Konzentration wie zuvor beschrieben. Schließlich verwenden Sie zwei bis fünf Nanogramm pcR-Produkte zwei und drei als Vorlage zusammen mit Primer-Paare drei, eins und drei, vier, um PCR-Produkt vier zu erhalten. Validieren Sie das PCR-Produkt durch Gelelektrophorese, reinigen Sie das PCR-Produkt und messen Sie seine Konzentration wie zuvor beschrieben.Bewahren Sie die gereinigte DNA bei minus 20 Grad Celsius im TE-Puffer auf. In dieser Studie wurden 2-stufige und 3-stufige standortgesteuerte Mutagenese verwendet, um RNA-Wechselwirkungen in Bezug auf die posttranskriptionelle Regulation von CsgD zu untersuchen. Die Wild-Typ CsgD wurde PCR verstärkt, um PCR-Produkt IA zu erhalten, und der Wild-Typ mcaS wurde PCR verstärkt, um PCR-Produkt IB zu erhalten. Mit einer 3-stufigen PCR-Strategie wurden die PCR-Produkte IIA und IIIA in den ersten beiden Schritten und IVA im dritten Schritt zur Einführung von Mutationen in CsgD synthetisiert.In ähnlicher Weise wurden in mcaS kostenlose standortgesteuerte Mutationen eingeführt, um pcR-Produkte IIB, IIIB in den ersten beiden Schritten und IVB im dritten Schritt zu erhalten. Die Western-Blot-Analyse zeigte, dass die Expression von Wildtyp mcaS zwar die Übersetzung von Wildtyp CsgD verhindert, Mutationen in mcaS oder CsgD jedoch die beobachtete Unterdrückung lindern. Mutationen in CsgD und mcaS verhindern jedoch die Übersetzung von CsgD.Mit Einer zweistufigen PCR-Strategie wurden die PCR-Produkte IIC, IID, IIE, IIF und IIG im ersten Schritt synthetisiert, und die PCR-Produkte IIIC, IIID, IIIE, IIIF und IIIG wurden im zweiten Schritt zur Einführung von Mutationen in die gesamte CsgD-DNA synthetisiert. DIE EMSA-Ergebnisse der HFQ-Bindung an in vitro transkribierte CsgD-Wildtyp- und mutierte RNAs, die mit PCR-Produkten IIIC, IIID, IIIE, IIIF und IIIG synthetisiert wurden, zeigten die erhöhten KD-Werte der mutierten Allele. Dies bewies, dass HFQ weniger effizient an die Mutanten binden konnte.Darüber hinaus hat HFQ mehrere Bindungsstellen auf CsgD, was durch die drei für die Wildtyp-RNA beobachteten Schichten gezeigt wird. Für unterschiedliche mutierte RNAs werden jedoch nur zwei Bindungsstellen beobachtet. Somit identifiziert der standortgesteuerte Mutationsansatz primäre und oder sekundäre Strukturen der CsgD mRNA, die für die vollständige Bindung von HFQ wichtig sind.Die hier beschriebene Methode für die standortgesteuerte Mutagenese beruht auf PCR. Gute PCR-Praktiken sind daher entscheidend für die Methode und erfordern möglicherweise eine Optimierung, um erfolgreich zu sein. Die standortgesteuerte Mutagenese ist nur mit allen drei Methoden wie EMSA und Western Blotting leistungsfähig.Andere Methoden umfassen z. B. verschiedene strukturelle Assays und einige Aktivitätstests sowie Studien zur Änderung von Übersetzungen.

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Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

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In Vitro gerichtete Evolution einer Restriktionsendonuklease mit strengerer Spezifität

Lernen Sie die ortsspezifische Mutagenese mit 2- und 3-Schritt-PCR zur Untersuchung von RNA-Interaktionen in Escherichia coli. Diese kostengünstige Methode ermöglicht gezielte Mutationen für molekularbiologische Studien.

Site-verwiesene Mutagenese für In Vitro und In Vivo Experimente veranschaulicht mit RNA-Interaktionen in Escherichia Coli

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