Name: Humanem Serum Anti-Aquaporin-4 Immunglobulin G Erkennung durch zellbasierte Assays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: Lernen Sie die zellbasierte Assay-Methode zur Detektion von Anti-Aquaporin-4 IgG in Patientenserum für die Diagnose von Neuromyelitis-optica-Spektrum-Erkrankungen. Diese Technik bietet höhere Sensitivität und Spezifität.

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Die Autoren sind dankbar für die Unterstützung von Zuschüssen vom National Science Foundation of China (Nr. 31600820), die Gesundheit und Familienplanung Kommission der Provinz Jilin (Nein 2016Q036), und der Wissenschaft und Technik Planung Projekt der Provinz Jilin (Nr. 20180520110JH).

Dieses Verfahren wurde von der Ethikkommission der ersten Krankenhaus der Jilin Universität zugelassen und wurde auf etwa 1.500 Probanden durchgeführt.
(1) Patienten und Blood Sample-Sammlung
<ol><li>Gelten Sie die Labor-Nachweis von Serum Anti-AQP4 IgG Klinik Patienten mit dem chief Beschwerden und Symptome unten aufgeführten. Durchführen Sie sowie körperliche Untersuchungen. Optikusneuritis: Patienten leiden mit visuellen Defiziten, wie Verlust des Gesichtsfeldes und Reduktion der Sehschärfe. Akuter Myelitis: Patienten mit Lähmungen, sensorische Defizite und autonome Dysfunktion präsentieren können. Area Postrema Syndrom: Patienten haben Symptome einer unerklärlichen Schluckauf, Übelkeit oder Erbrechen. Akute Hirnstamm-Syndrom: Hirnstamm Läsionen führen verschiedene Symptome und körperlichen Zeichen je nach Lage der Läsionen. Symptomatische Narkolepsie oder akute diencephalic klinisches Syndrom mit NMOSD-typische diencephalic MRT-Läsionen. Symptomatische zerebrale Syndrom mit NMOSD-typische Hirnläsionen. Hinweis: Nach den internationalen Konsens diagnostische Kriterien für NMOSD5, kann eine Diagnose der NMOSD gemacht werden, wenn der Patient Serum Anti-AQP4 ist IgG-positiven und hat mindestens eines der Kern klinische Merkmale wie oben beschrieben. Wir empfehlen jedoch nicht von Anti-AQP4-IgG bei Patienten mit Optikusneuritis nur testen.</li>
	<li>
Blut-Musterkollektion Hinweis: Patienten müssen nicht fasten.<ol>
<li>2-3 mL venöses Blut in ein Sammelrohr 4 mL Vakuum Blut zu zeichnen.</li>
		<li>Lassen Sie das Serum für 30 min bei Raumtemperatur (RT) gerinnen. Hinweis: Verlängerten Blutgerinnung kann Serumspiegel wegen des Durchsickerns von Thrombozyten erhöhen.</li>
		<li>Zentrifuge bei 2100 X g für 5 min. sorgfältig das Serum auf einen neuen Schlauch übertragen.</li>
		<li>Das Serum sofort oder Aliquote analysieren und Lagerung bei-20 oder-80 ° C. Hinweis: Lagerung bei-20 ° C ist für die Lagerung von Monaten, während-80 ° C für die Lagerung von Jahren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Anti-AQP4-Antikörpernachweis
Vorsicht: Patientenproben und gebrauchte Kit Reagenzien sind infektiöse Materialien anzusehen. Natrium-Azid-haltigen Reagenzien im Kit sind giftig. Ein Flussdiagramm des Protokolls ist in Abbildung 1zur Verfügung gestellt.
<ol><li>
Vorbereitung
	<ol>
<li>Bringen Sie das Kit auf RT vor Gebrauch. Hinweis: Bewahren Sie das Kit bei 2 bis 8 ° C.</li>
		<li>Bereiten Sie mindestens 200 mL PBS Waschpuffer mit 0,2 % Tween 20. Gießen Sie 100 mL Waschpuffer in einen 500-mL-Becherglas.</li>
		<li>Das Serum Proben 10 X mit Waschpuffer verdünnt. Bereiten Sie die positiven und negativen Kontrollen gemäß den Anweisungen des Verteilers.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Inkubation der Probe
	<ol>
<li>Die Reaktion Felder des Fachs Reagenz (Abbildung 2) 30 µL der vorverdünnt Proben, Positivkontrolle oder negative Kontrolle hinzufügen. Hinweis: Vermeiden Sie Luftblasen.</li>
		<li>Entfernen Sie die Schutzkappe auf den Folien Biochip. Hinweis: Berühren Sie nicht die Biochips um das ablösen und Kontamination der fixen Zellen zu vermeiden. Halten Sie die Folie nebeneinander vor dem Entfernen der Abdeckung.</li>
		<li>Gelten Sie die Biochip-Folie für das Reagenz Fach (Abbildung 2). Starten einer 30 min Inkubation bei RT Hinweis: Jede Probe sollte ein einzelner Tropfen ohne Vermischung mit anderen Tropfen auf die entsprechenden Biochip verbunden sein.</li>
		<li>Spülen Sie sanft die Biochip-Folie einmal mit Waschpuffer. Tauchen Sie die Biochip-Folie in der 500 mL-Becherglas mit 100 mL Waschpuffer für mindestens 5 min. Platz das Becherglas auf einen Shaker wenn möglich gefüllt.</li>
		<li>Nehmen Sie die Biochip-Folie von der Waschpuffer. Vorsichtig die restliche Waschpuffer außerhalb der Reaktion-Felder mit einem Papiertuch abwischen. Aussetzen der Biochip-Folie unter freiem Himmel für 1-2 min die verbleibende Waschpuffer im Feld Reaktion verdunsten. Hinweis: Die Reaktion-Felder nicht austrocknen. Berühren Sie nicht die Biochips mit Küchenpapier trockentupfen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sekundärantikörper Inkubation
	<ol>
<li>Bereiten Sie die sekundäre Antikörper-Lösung gemäß den Anweisungen des Verteilers.</li>
		<li>Die Reaktion Felder eines sauberen Reagenz Tabletts 25 µL fluoreszierende Sekundärantikörper hinzufügen.</li>
		<li>Gelten Sie die Biochip-Folie für das Reagenz Tablett voller Sekundärantikörper. 30 min bei RT inkubieren</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Montage
	<ol>
<li>Gießen Sie die gebrauchten Waschpuffer und 100 mL frische Waschpuffer in das Becherglas. Wiederholen Sie das Waschen, wie in den Schritten 2.2.4 und 2.2.5 beschrieben.</li>
		<li>Die Reaktion-Felder auf ein Biochip-Folie (ein Tropfen pro Reaktion Feld) sorgfältig einbetten Medium hinzufügen. Die Biochip-Folie mit einem Deckglas zu versiegeln. Vermeiden Sie Luftblasen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fluoreszenz-Detektion
	<ol>
<li>Die Leuchtstofflampe des Mikroskops und vorheizen für 15 min. Wählen Sie einen 488 nm-Filter aktivieren.</li>
		<li>Open Foto Software. Fotografieren von transfizierten und untransfected aus allen Bereichen der Reaktion mit verschiedenen Vergrößerungen. Zunächst nehmen Sie ein Bild mit 4 X Vergrößerung für eine Übersicht, dann mehr Bilder mit 10 X und 20 X Vergrößerungen. Hinweis: Das ausführliche Protokoll wird in Tabelle 1dargestellt. Interpretation der Ergebnisse wird im Abschnitt repräsentative Ergebnisse diskutiert.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(3) die Diagnose des Patienten
<ol><li>Wenn der Patient Serum Anti-AQP4 ist IgG-positiven und zeigt mindestens ein Kern klinische Merkmal der NMOSD (siehe Diskussion), Patienten mit NMSOD5zu diagnostizieren. Jedoch wenn der Patient Anti-AQP4 kann IgG-negativ, eine Diagnose der NMOSD nicht ausgeschlossen werden.</li>
</ol>

<ol><li>Zekeridou, A., Lennon, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin-4+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology+Neuroimmunology+%26+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Aquaporin-4 autoimmunity.</a> Neurology Neuroimmunology & Neuroinflammation. 2 (4), 110(2015).</li>
<li>Ho, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+human+aquaporin+4+at+1.8+A+and+its+mechanism+of+conductance%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of human aquaporin 4 at 1.8 A and its mechanism of conductance.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (18), 7437-7442 (2009).</li>
<li>Takeshita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+neuromyelitis+optica-IgG+at+the+blood-brain+barrier+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22in+vitro.Neurology+Neuroimmunology+%26+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Effects of neuromyelitis optica-IgG at the blood-brain barrier in vitro.</a> in vitro.Neurology Neuroimmunology & Neuroinflammation. 4 (1), 311(2016).</li>
<li>Sato, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinction+between+MOG+antibody-positive+and+AQP4+antibody-positive+NMO+spectrum+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Distinction between MOG antibody-positive and AQP4 antibody-positive NMO spectrum disorders.</a> Neurology. 82 (6), 474-481 (2014).</li>
<li>Wingerchuk, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+consensus+diagnostic+criteria+for+neuromyelitis+optica+spectrum+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">International consensus diagnostic criteria for neuromyelitis optica spectrum disorders.</a> Neurology. 85 (2), 177-189 (2015).</li>
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<li>Fryer, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AQP4+autoantibody+assay+performance+in+clinical+laboratory+service%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology+Neuroimmunology+%26+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">AQP4 autoantibody assay performance in clinical laboratory service.</a> Neurology Neuroimmunology & Neuroinflammation. 1 (1), 11(2014).</li>
<li>Long, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin-4+antibody+in+neuromyelitis+optica%3A+re-testing+study+in+a+large+population+from+China%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Aquaporin-4 antibody in neuromyelitis optica: re-testing study in a large population from China.</a> The International Journal of Neuroscience. 127 (9), 790-799 (2017).</li>
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<li>Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRI+characteristics+of+neuromyelitis+optica+spectrum+disorder%3A+an+international+update%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">MRI characteristics of neuromyelitis optica spectrum disorder: an international update.</a> Neurology. 84 (11), 1165-1173 (2015).</li>
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<li>Kessler, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-aquaporin-4+titer+is+not+predictive+of+disease+course+in+neuromyelitis+optica+spectrum+disorder%3A+A+multicenter+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Multiple+Sclerosis+and+Related+Disorders%22%5BJournal%5D)">Anti-aquaporin-4 titer is not predictive of disease course in neuromyelitis optica spectrum disorder: A multicenter cohort study.</a> Multiple Sclerosis and Related Disorders. 17, 198-201 (2017).</li>
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<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+aquaporin-4+antibodies+in+Chinese+patients+with+neuromyelitis+optica%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The role of aquaporin-4 antibodies in Chinese patients with neuromyelitis optica.</a> Journal of Clinical Neuroscience. 20 (1), 94-98 (2013).</li>
<li>Kitley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+factors+and+disease+course+in+aquaporin-4+antibody-positive+patients+with+neuromyelitis+optica+spectrum+disorder+from+the+United+Kingdom+and+Japan%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Prognostic factors and disease course in aquaporin-4 antibody-positive patients with neuromyelitis optica spectrum disorder from the United Kingdom and Japan.</a> Brain. 135 (6), 1834-1849 (2012).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Wir haben ein breit zugänglich Verfahren zur Erkennung von Anti-AQP4-IgG in humanem Serum beschrieben. Anti-AQP4 IgG ist eng verwandt mit NMOSD und Schaffung einer zuverlässigen Anti-AQP4 IgG Erkennungsmethode ist entscheidend für die klinische Diagnose der NMOSD. Anti-AQP4 IgG ist spezifisch für NMOSD. Multiple Sklerose ist auch eine immun-vermittelte Erkrankung des zentralen Nervensystems und teilt viele Ähnlichkeiten mit NMOSD12. Anti-AQP4 IgG ist jedoch nur positive NMOSD13</...

Serum IgG AQP4 ist ein Kern diagnostischer Biomarker für Neuromyelitis Optica Spektrum Störungen (NMOSD)1. Zellbasierte Assays (CBA) ist eine weit verbreitete Anti-AQP4 IgG Methode mit hoher Sensitivität und Spezifität. Hier ist ein detailliertes Protokoll für CBA vorgestellt.
AQP4, ein Wasser-Kanal-Protein hat sechs Membran überspannt Einheiten und zwei spiralförmige Domains rund um eine wässrige pore2. Anti-AQP4 IgG in der Pathogenese der NMOSD durch Bindung an ihr Ziel AQP4, engagiert sich vor allem auf die Endfeet von Astrozyten3liegt. Es hat sich gezeigt, dass Anti-AQP4-IgG positiv in etwa zwei Drittel der NMOSD Patienten4ist. In der jüngsten internationalen Diagnosekriterien für NMOSD Anti-AQP4 IgG gilt eine Core-diagnostischer Biomarker-5. In dieser Hinsicht ist es entscheidend, ein zuverlässiges Protokoll zur Humanserum erkennen zu etablieren Anti-AQP4-IgG und klinische Diagnose der NMOSD zu erleichtern.
Derzeit sind verschiedene Anti-AQP4-IgG-Nachweismethoden zur Verfügung, wie z. B. CBA, Gewebe-basierten Tests und Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay Flow Cytometry6,7. CBA beschäftigt EU90 Zellen, die mit menschlichen AQP4 Anti-AQP4 IgG erfassen transfiziert sind. Die erfassten Anti-AQP4-IgG ist von fluoreszierenden Sekundärantikörper erkannt und anschließend visualisiert durch Mikroskopie. Sammeln Beweise hat gezeigt, dass CBA empfindlicher und spezifischer als andere Anti-AQP4 IgG Erkennung Methoden6,7. Laut einer Meta-Analyse die Sensitivität und Spezifität der KNA erwiesen sich 76 % und 99 %, die höher als gewebebasierten waren und Enzym-linked Immunosorbentprobe assays6. Darüber hinaus wurde ein multizentrische Vergleich der diagnostischen Tests von Anti-AQP4 IgG durchgeführten7. Insgesamt 193 Studie waren Themen aus 15 europäischen Diagnosezentren eingeschrieben7. Vier verschiedene Methoden wurden verwendet, um Serum Anti-AQP4 IgG7erkennen. Es konnte gezeigt werden, dass CBA empfindlicher und spezifischer als die anderen Methoden7war. Wie AQP4 als zwei große Isoformen (AQP4-M1 und AQP4-M23) zum Ausdruck kommt, ist Anti-AQP4-IgG-Capture-Zelle mit AQP4-M1 oder AQP4-M23 transfiziert. Welche Art von Capture-Zelle ist jedoch besser bleibt umstritten. Eine Untersuchung hat AQP4-M1 Basis unterstützt CBA8, während andere schon angedeutet haben, dass AQP4-M23 CBA basierend ist besser7,9,10. AQP4-M23-basierte CBA kann jedoch falsch positive Ergebnisse durch unspezifische IgG Bindung8erzielen. Jarius Et Al. 11 berichtet, dass gab es keinen signifikanten Unterschied in Anti-AQP4-IgG-Erkennungsraten zwischen AQP4-M1 und AQP4-M23-basierte GAV.
In Zusammenfassung, Serum Anti-AQP4 IgG ist ein Kern-Biomarker für NMOSD. CBA hat höhere Spezifität und Sensitivität als andere Anti-AQP4-IgG-Nachweisverfahren. Es bleibt umstritten, ob AQP4-M1 - oder AQP4-M23-basierte CBA besser ist. In diesem Artikel wird ein detailliertes Protokoll für AQP4-M1-basierte CBA beschrieben, die für klinische Diagnose und Studien von NMOSD gelten kann.

<table><tbody><tr><td>Anti-Aquaporin-4 IIFT</td><td>Euroimmun</td><td>FA 1128-2005-50</td><td>Enthält Biochip-Objektträger, die mit AQP4-M1 transfizierten und nicht transfizierten EU-90-Zellen beschichtet sind, fluorescein-markiertes Anti-Human-IgG, Anti-AQP4-Antikörper als Positivkontrolle, Antikörper-negative Probe, Salz für PBS pH 7,2, Tween 20 und Einbettungsmedium.</td></tr><tr><td>CellSens Dimension</td><td>OLYMPUS</td><td>N/A</td><td>Fotosoftware</td></tr><tr><td>Gel- und Gerinnselaktivator-Tube</td><td>Verbessern Sie die medizinische</td><td>623040202</td><td>Von einem lokalen chinesischen Unternehmen</td></tr></tbody></table>

humanem serum anti-aquaporin-4 immunglobulin g erkennung durch zellbasierte assays

Human Serum Anti-aquaporin-4 Immunoglobulin G Detection by Cell-based Assay

Anti-Aquaporin-4 (AQP4) Immunglobulin G (IgG) ist der Kern diagnostischer Biomarker für Neuromyelitis Optica-Spektrum-Störungen (NMOSD). Zellbasierte Assays (CBA) ist eine weit verbreitete Methode, Anti-AQP4-IgG in humanem Serum mit hoher Sensitivität und Spezifität zu erkennen. Kurz, Serum Anti-AQP4 IgG wird von AQP4-transfizierten Zellen, die feste auf dem Biochip ist dann durch einen Fluorescein-gekennzeichnete sekundäre Antikörper erkannt gefangen genommen. Fluoreszenzmikroskopie wird genutzt, um die Fluoreszenz sichtbar zu machen, und die Intensität der Fluoreszenz wird durch mindestens zwei erfahrene Kliniker ausgewertet. Eine endgültige Diagnose des NMOSD kann basierend auf der Kombination von Anti-AQP4 IgG Detektionsergebnisse, klinischen Manifestationen und neuroradiologische Befunde erfolgen. Früheren Studien zufolge CBA ist empfindlicher und spezifischer als andere Anti-AQP4-IgG-Nachweisverfahren und klinische Diagnose und Studien des NMOSD aufgebracht werden. Die Methode hat Einschränkungen; zum Beispiel fehlt noch eine internationale Skala Serum Anti-AQP4-IgG-Titer bewertet. Hier wird ein detailliertes Protokoll für menschliches Serum Anti-AQP4 IgG Nachweis mit CBA beschrieben.

Verwendung des beschriebenen Verfahrens hier, ist die spezifische Anti-AQP4-IgG im Serum nachweisbar. Während des Verfahrens waren vorverdünnt Proben, eine positiv-Kontrolle und eine negative Kontrolle der Reaktion Felder hinzugefügt, die transfizierte und untransfected Bereiche (Abbildung 2) enthalten. Fluoreszenz von der negativen Kontrolle in einem transfizierten Bereich angegeben vor allem die unspezifische Bindung des sekundären Antikörper zu den transfi...

Zellbasierte Assays ist eine weit verbreitete Methode zur Erkennung von Serum Anti-Aquaporin-4 Immunglobulin G. Diese Methode könnte auf klinische Diagnose und wissenschaftlichen Forschungen der Neuromyelitis-optisches Spektrum-Störungen angewendet werden.

Humanem Serum Anti-Aquaporin-4 Immunglobulin G Erkennung durch zellbasierte Assays

Anti-aquaporin-4 (AQP4) immunoglobulin G (IgG) is the core diagnostic biomarker for neuromyelitis optica spectrum disorders (NMOSD). The cell-based assay ...

Nach den jüngsten internationalen diagnostischen Kriterien für Neuromyelitis optica Spektrum Störungen, Anti-AQP4 IgG gilt als kerndiagnostische Biomarker. Die Anti-AQP4 IgG-Erkennung durch zellbasierten Assay kann die klinische Diagnose erleichtern. Daher ist der zellbasierte Assay empfindlicher und spezifischer als andere Nachweismethoden.Und es kann sowohl auf klinische Diagnose als auch auf die wissenschaftlichen Studien angewendet werden. Bringen Sie zunächst die Serumproben des Patienten, den Biochipschlitten, das PBS-Pulver und das TWEEN 20 aus dem auf Kühlzellen basierenden Assay-Kit auf die Raumtemperatur. Dann bereiten Sie mehr als 200 Milliliter PBS-Waschpuffer mit 0,2 Prozent TWEEN 20 für jeden Biochip-Dia vor.Verwenden Sie den Waschpuffer, um 10-fache serielle Verdünnungen jeder Serumprobe zu machen. Bereiten Sie positive und negative Kontrollen gemäß den Anweisungen des Herstellers vor. Fügen Sie 30 Mikroliter der 10-fachen seriellen Verdünnungen der Probe, der Positivkontrolle und der Negativkontrolle zu fünf einzelnen Reaktionsfeldern auf der Reagenzschale hinzu.Halten Sie den Biochip-Dia an seinen Dias und entfernen Sie seine Schutzhülle, ohne seine Reaktionsfelder zu berühren. Setzen Sie die Folie auf das Reagenzfach und inkubieren Sie das Setup bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Spülen Sie den Biochip-Schlitten vorsichtig mit dem Waschpuffer ab.Dann tauchen Sie es in einen 500 Milliliter Becher gefüllt mit 100 Milliliter des Waschpuffers, und lassen Sie es bei der Raumtemperatur für 10 Minuten. Nehmen Sie die Biochip-Rutsche aus dem Waschpuffer. Verwenden Sie ein Papiertuch, um den verbleibenden Puffer von außerhalb der Reaktionsfelder vorsichtig wegzuwischen.Lassen Sie das Dia ein bis zwei Minuten lufttrocknen. Fügen Sie im dunklen Raum 25 Mikroliter fluoreszierenden Sekundärantikörper in jedes Reaktionsfeld der Reagenzschale ein. Setzen Sie die Folie auf das Reagenzfach und inkubieren Sie das Setup bei Raumtemperatur für 30 Minuten.Spülen Sie den Biochip-Schlitten vorsichtig mit dem Waschpuffer ab. Dann tauchen Sie es in einen 500 Milliliter Becher gefüllt mit 100 Milliliter des frischen Waschpuffers, und lassen Sie es bei der Raumtemperatur für 10 Minuten. Nehmen Sie die Biochip-Rutsche aus dem Waschpuffer.Verwenden Sie ein Papiertuch, um den verbleibenden Puffer von außerhalb der Reaktionsfelder vorsichtig wegzuwischen. Lassen Sie das Dia ein bis zwei Minuten lufttrocknen. Fügen Sie vorsichtig einen Tropfen des Einbettungsmediums zu jedem Reaktionsfeld auf dem Biochip-Dia hinzu.Schließlich versiegeln Sie den Biochip-Schlitten mit einem Deckglas, während Luftblasen vermieden werden, und fahren Sie mit der Bildgebung fort. Die schwache Fluoreszenzintensität der im infizierten Bereich beobachteten Negativkontrolle deutet auf die unspezifische Bindung des sekundären Antikörpers hin. Der Vergleich zwischen den nachgewiesenen Fluoreszenzintensitäten der Positivkontrolle in den infizierten und nicht infizierten Gebieten zeigt die spezifische Bindung des Anti-AQP4 IgG an AQP4M1 in den infizierten Zellen.Das Anti-AQP4 IgG Negativserum zeigt Bindungsmuster ähnlich der Negativkontrolle in infizierten und nicht infizierten Bereichen. Das positive Serum zeigt Bindungsmuster, die der positiven Kontrolle sowohl in infizierten als auch in nicht infizierten Gebieten ähneln. Proben gelten als anti-AQP4 IgG positiv, wenn die Fluoreszenz im infizierten Bereich heterogen zunimmt.Die Intensität der Fluoreszenz korreliert mit Anti-AQP4 IgG Titer im Serum. Proben werden wahrscheinlich als positiv angesehen, wenn nur eine kleine Anzahl von Zellen im transfäfierten Bereich nachweisbare Fluoreszenzintensitäten aufweisen. Eine Probe sollte als Anti-AQP4 IgG negativ betrachtet werden, wenn ihre Intensität im infizierten Bereich nur homogen stärker ist als im nicht infizierten Bereich.Die Vermeidung von Luftblasen ist von entscheidender Bedeutung und schwierig. Um Luftblasen zu beseitigen, verwenden Sie zuerst eine Pipette, um Luftblasen in Tröpfchen zu vermeiden. Zweitens, während der Biochip-Rutsche auf das Reagenz-Fach auftragen, lassen Sie zuerst eine Seite des Dias die Tröpfchen berühren, und dann die Folie langsam nivellieren.Berühren Sie außerdem nicht die Reaktionsfelder während des gesamten Experiments.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

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