Longitudinal morphologischen und physiologischen Überwachung der dreidimensionalen Tumor Sphäroide mit optischen Kohärenztomographie

Dreidimensionale Tumorsphäride können gewebespezifische Eigenschaften von Tumoren in vivo imitieren und liefern mehr klinisch relevante Daten für die Entdeckung von Krebsmedikamenten als einfache 2D-Zellkultur. Unsere bildgebende Technik, die optische Kohärenztomographie, kann die 3D-Struktur eines einzelnen Tumornervs mit einer Größe von mehreren hundert Mikrometern leicht visualisieren und eine genauere Charakterisierung seiner Morphologie und des Jobbefestes ermöglichen, oft innerhalb weniger Sekunden. Mit 3D-Sphärischen Modell können wir potenziell verkürzen die Zeitleiste der Arzneimittelentdeckung, Kosten senken und neue Medikamente für Patienten effektiver bringen.

Die Bildung der sphärischen Form eines Tumorclusters ist ein entscheidender Schritt in unserem Experiment. Es ist wichtig, die richtige ultra-niedrige Befestigungsplatte mit dem runden Boden und die richtige Zentrifugationsgeschwindigkeit nach der Zellaussaat zu wählen. Starten Sie dieses Experiment, indem Sie Zellen von interessanten in einem Kulturkolben wachsen, wie im Manuskript beschrieben.

Pflegen Sie die Zellen in einem Inkubator unter Standardbedingungen, und überwachen Sie ihren Gesundheitsstatus jeden Tag. Aktualisieren Sie die Medien nach Bedarf. Um 3D-Zellkultur in Multi-Well-Platten durchzuführen, entfernen Sie zuerst das Medium aus dem Zellkulturkolben und waschen Sie die Zellen mit sterilisierten, 33 Grad Celsius vorgewärmten PBS.

Fügen Sie dann einen Milliliter Trypsin-EDTA hinzu, um die Zellen wieder auszusetzen und drei Minuten bei 37 Grad Celsius zu brüten. Fügen Sie drei Milliliter Kulturmedium, um das Trypsin zu verdünnen. Übertragen Sie diese Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Zentrifugenrohr und Zentrifuge bei 500G und Raumtemperatur für fünf Minuten.

Dann entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet mit vier Millilitern vorgewärmtem Kulturmedium wieder auf. Um die Zellkonzentration zu bestimmen, hypnotieren Sie einen Tropfen probe auf ein Hämozytometer, und zählen Sie die Zellen. Auf gewünschte Saatkonzentration verdünnen.

Samen 200 Mikroliter Zellsuspension in jeden Brunnen einer ultra-niedrigen Aufsatz, runde Boden Multi-Well-Platte, mit einer Konzentration von 3.000 Zellen pro Milliliter, um etwa 600 Zellen pro Brunnen zu erreichen. Unmittelbar nach der Aussaat die gesamte Platte mit der niedrigsten verfügbaren Geschwindigkeit bei Raumtemperatur sieben Minuten zentrieren. Legen Sie die Platte in den Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5%Co2, stellen Sie sicher, dass das Medium alle drei Tage zu erfrischen.

Erstellen Sie zunächst den Referenzarm und den Probenarm des OCT-Systems nach den Schaltplänen in diesem Manuskript. Dann konstruieren Sie das Spektrometer, einschließlich eines Kilometers, einer Benotung, eines F-Theta-Objektivs und einer Linienscankamera. Verwenden Sie einen Plattenadapter, um die Multi-Well-Platte in einer festen Position zu halten.

Korrigieren Sie vor der Bildgebung das Kippen und Drehen der Multi-Well-Platte mit einer 2D-Kippstufe und einer Aufderlaufstufe, die auf der Übergangsstufe montiert ist, um die Variation der Brennebene von verschiedenen Brunnen zu minimieren. Passen Sie dann die Drehung an, um sicherzustellen, dass die Kanten der Platte parallel zur Richtung der Bühnenbewegung sind, so dass die Bohrungen an den gleichen horizontalen Positionen in den OCT-Bildern bleiben. Passen Sie dann die Kippstufe an, um sicherzustellen, dass die Platte parallel zum optischen Tisch ist, so dass die Bohrungen an den gleichen vertikalen Positionen für die Bildgebung bleiben.

Entfernen Sie am Tag der Tumorsphäroide die Multi-Well-Platte aus dem Inkubator. Übertragen Sie es unter das OCT-Bildgebungssystem und legen Sie es auf den Plattenadapter. Um die Höhe der Platte anzupassen, bewegen Sie sie entlang der Z-Richtung der Übersetzungsstufe.

Legen Sie in der benutzerdefinierten Bildverarbeitungssoftware einen gewünschten OCT-Scanbereich fest, um den gesamten Tumorsphäroid je nach Entwicklungsstadien abzudecken, und klicken Sie auf Speicherparameter, um die Einstellung zu speichern. Dann zeigen Sie die optimierte XZ und YZ OCT Vorschau von Tumorsphäroiden. Erfassen Sie 3D-OCT-Bilder von Tumorsphäroiden nacheinander für alle Brunnen der Platte, die Sphäroide enthalten.

Um das Vorschaubild anzuzeigen, klicken Sie auf die Vorschauschaltfläche. Und um das OCT-Bild zu erfassen, klicken Sie auf die Schaltfläche "Acquire". Zeichnen Sie den gesamten Schrittverschiebungsprozess der OCT-Datenerfassung auf.

Um die optimale Bildqualität für alle Tumorsphäroide zu gewährleisten, muss der Plattenadapter genau abgestimmt werden und das Mittlere Volumen muss gleich sein. Verwenden Sie einen benutzerdefinierten C+-Verarbeitungscode, um 3D-OCT-Datensätze von Tumorsphäroiden zu verarbeiten, um OCT-Strukturbilder zu generieren. Verwenden Sie 2D-OCT-Bilder in drei Querschnitts-, XY-, XZ- und YZ-Ebenen über den Schwerpunkt des Sphäroids, um die Collage von Sphäroidbildern zu erzeugen.

Um 3D-Rendering des Sphäroids mit einer gewünschten Software zu erhalten, laden Sie zuerst die SD-OCT-Daten in die Software. Klicken Sie auf das Übersteigen-Bedienfeld, fügen Sie dann ein neues Volume hinzu, und wählen Sie den Mischmodus aus, der für das 3D-Rendering verwendet werden soll. Um den Betrachtungswinkel anzupassen, ziehen Sie mit dem Mauszeiger das Bild und fahren Sie mit der Quantifizierung fort, wie im Manuskript beschrieben.

Aus den verarbeiteten Daten wurde eine Collage aus unfazierten OCT-Bildern von HCT116-Zellliniensphäroiden erzeugt, deren Ergebnisse mit Bildern aus anderen 2D-Hochdurchsatz-Bildgebungssystemen vergleichbar sind. Darüber hinaus wurde die Collage aus 2D-Querschnittsphäroidbildern aus 96 Brunnen erzeugt, um Sphäroidhöhen zu überwachen und Sphäroid-Inhomogenität in vertikaler Richtung zu visualisieren. Eine Collage aus 3D-gerenderten Sphäroidbildern kann aus jedem vordefinierten Winkel erzeugt werden, um die gesamte 3D-Form zu visualisieren und die Rundheit des Sphäroids auszuwerten.

Nach der allgemeinen OCT-Nachbearbeitung wurden 3D-OCT-Strukturbilder eines Tumorsphäroids erhalten. Aus den OCT-Daten wurden ein 3D-Oberflächenpfosten und XZ-, YZ- und XY-Orthogonalscheiben generiert, um die Struktur des Tumorsphäroids in jede Richtung zu visualisieren. Die Längsüberwachung eines einzelnen Tumorsphäroids wurde durchgeführt, um seinen Durchmesser, seine Höhe und sein voxelbasiertes Volumen zu charakterisieren und die Wachstumskurven in Größe und Volumen während der 21-tägigen Entwicklung zu erzeugen.

Hier wurde das Sphäroid am 11. Tag gestört und brach am 21. Tag vollständig zusammen. Längsspuren zeigten die Zunahme der toten Zellbereiche im Tumorsphäroid. 3D-gerenderte Bilder des Tumorsphäroids zeigten das Aussehen und Wachstum von toten Zellregionen vom siebten bis zum 14. Tag, wie die Zunahme der rot hervorgehobenen nekrotischen Bereiche zeigt.

Als der Prozentsatz der nekrotischen Bereiche zunahm, konnte das Tumorsphäroid seine perfekte Form nicht beibehalten und brach daher zusammen. Mit dieser Bildgebungsplattform können wir weitere komplexe Tumorsphärenmodelle erforschen, wie 3D-Bildgebungsmodell, riesige Kreaturenmodelle und Co-Kultur-Modelle, um In-vivo-Tumoren besser zu simulieren. Unser OCT-Bildgebungssystem mit hohem Durchsatz kann einen alterativen Ansatz für das Arzneimittelscreening bei der Entdeckung von Krebsmedikamenten bieten.

Dies ist etwas, das auch charakterisiert ist, 3D-Biofabrikatierte Proben für verschiedene biomedizinische Anwendungen.