Zelle Fraktionierung von U937 Zellen in der Abwesenheit von High-Speed-Zentrifugation
18. Januar 2019
Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Plasmamembran, Zytoplasma und Mitochondrien von U937 Zellen ohne den Einsatz von High-Speed-Zentrifugation zu isolieren. Diese Technik lässt sich subzelluläre Fraktionen für die anschließende Untersuchung des Proteins Lokalisierung über Immunoblotting zu reinigen.
Dieses Protokoll ermöglicht es Forschern, unterschiedliche Fraktionen einer Zelle ohne den Einsatz von spezialischen Geräten, teuren Reagenzien oder komplexen Techniken zu erhalten. Der Hauptvorteil dieses Protokolls ist die Einfachheit der Techniken, die es veränderbar und einfach durchzuführen machen. Demonstrieren das Verfahren werden Matt Deragon, Rob Haluska und Alexa Hodges.Drei Absolventen aus meinem Labor. Um mit der Zentrifugieren der vorbereiteten Zellsuspension zu beginnen, um ein Pellet zu erzeugen. Entfernen Sie den Überstand und hängen Sie das Pellet bei Raumtemperatur PBS wieder auf. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 400 xg für zehn Minuten. Entfernen Sie dann den Überstand und hängen Sie das Zellpellet in eiskaltem Puffer wieder auf. Puffer Vorbereiten Eine Lösung gemäß dem Textprotokoll. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 400 xg für zehn Minuten und entfernen Sie den Überstand. Das Pellet in Puffer Eine Lösung auf eine Endkonzentration von 200 Millionen Zellen pro ml und Pipette sanft auflösen, um klumpenweise aufzubrechen. Nach dieser Inkubation wird die Zellsuspension an einem Ende über Endrotator bei 4
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Übersicht
Dieser Artikel stellt ein Protokoll zur Isolierung der Plasmamembran, des Cytoplasmas und der Mitochondrien von U937-Zellen ohne Hochgeschwindigkeitszentrifugation vor. Die Methode ermöglicht die Aufreinigung subzellulärer Fraktionen für Untersuchungen zur Proteinlokalisation mittels Immunoblotting.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Zellbiologie
- Biokemie
- Neurowissenschaften
Hintergrund
- U937-Zellen sind ein Modell zur Untersuchung der Funktion menschlicher Monozyten.
- Die Isolierung von subzellulären Bestandteilen ist entscheidend für das Verständnis zellulärer Prozesse.
- Herkömmliche Methoden beinhalten häufig die Hochgeschwindigkeitszentrifugation, die für Zellen schädlich sein kann.
- Dieses Protokoll zielt darauf ab, eine schonendere Alternative für die subzelluläre Fraktionierung bereitzustellen.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines Protokolls zur Isolierung von Zellkomponenten ohne Hochgeschwindigkeitszentrifugation.
- Möglichmachung der anschließenden Analyse der Proteinlokalisation.
- Verbesserung des Verständnisses zellulärer Mechanismen in U937-Zellen.
Verwendete Methoden
- Isolierung von Plasmamembran, Zytoplasma und Mitochondrien.
- Verwendung spezifischer Reagenzien zur Unterstützung der Zellfraktionierung.
- Immunoblotting zur Analyse der Proteinlokalisation.
- Vergleich der Ergebnisse mit herkömmlichen Methoden.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Isolierung von subzellulären Fraktionen ohne Hochgeschwindigkeitszentrifugation.
- Klare Visualisierung der Proteinlokalisation mittels Immunblotting.
- Nachgewiesene Effizienz und Schonendheit des neuen Protokolls.
- Potenzial für breitere Anwendungen in der zellbiologischen Forschung.
Schlussfolgerungen
- Das neue Protokoll ist wirksam zur Isolierung von U937-Zellbestandteilen.
- Es bietet eine geeignete Alternative zu herkömmlichen Methoden.
- Zukünftige Studien können diese Technik für verschiedene zelluläre Analysen nutzen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Dieses Protokoll ermöglicht eine kostengünstige subzelluläre Fraktionierung von U937-Zellen ohne Hochgeschwindigkeitszentrifugation und unterstützt die Zielvalidierung sowie die mechanistische Entschärfung von Risiken in der frühen Entdeckungsphase. Durch die Isolierung von zytoplasmatischen, mitochondrialen und Plasmamembran-Fraktionen unter Verwendung leicht zugänglicher Reagenzien und Geräte werden Proteinlokalisationsstudien gefördert, die für die Aufklärung von Signalwegen und die Entwicklung von Assays entscheidend sind. Der Ansatz verringert die Abhängigkeit von spezialisierten Infrastrukturen und verbessert die Skalierbarkeit und Reproduzierbarkeit in präklinischen Zielbewertungsworkflows.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch die Untersuchung der subzellulären Proteinlokalisation in einem humanen Monozytenmodell, das für Immunologie und Entzündung relevant ist.
- Operationaler Wert: Bietet eine schonendere Alternative zur Ultrazentrifugation und erhält die Proteintegrität sowie die Bildung von Komplexen für die funktionelle Zielstrukturbeurteilung.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die mechanistische Risikominimierung, indem er die Beteiligung von Signalwegen und die kompartiment-spezifische Signalübertragung in krankheitsrelevanten Zellen aufklärt.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Eignung: Erzeugt gereinigte subzelluläre Fraktionen, die für immunblotbasierte Assays zur Bewertung der Zielinteraktion oder -modulation geeignet sind.
- Reproduzierbarkeit: Verwendet standardisierte Pufferbedingungen und differentielle Zentrifugationsschritte, um eine konsistente Fraktionierung über verschiedene Experimente hinweg sicherzustellen.
- Skalierbarkeit: Das Protokoll kann an unterschiedliche Zellzahlen angepasst werden und unterstützt so die Vorbereitung von mittelhochskaligen Screening-Ansätzen.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: U937-Zellen modellieren die Funktion menschlicher Monozyten und ermöglichen die translationale Erforschung von Biomarkern in entzündlichen und infektiösen Krankheitskontexten.
- Präklinische Kontinuität: Isolierte Fraktionen unterstützen die nachgeschaltete Validierung der Ziellokalisation und des Wirkmechanismus vor In-vivo-Studien.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Ermöglicht eine frühzeitige Risikominderung bei Zielstrukturen, indem die subzelluläre Zugänglichkeit und Interaktionsfähigkeit bestätigt wird.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den frühen Entdeckungsprozess ein und unterstützt die Target-Validierung durch biochemische Fraktionierung, bevor es zur Assay-Entwicklung und präklinischen Bewertung übergeht.
- Entdeckungsbiochemie: Ermöglicht die Hypothesenprüfung mittels subzellulärer Fraktionierung, um die Ziellokalisation und Beteiligung an Signalwegen in U937-Zellen zu klären.
- Screening: Erzeugt standardisierte zytoplasmatische, mitochondriale und membranäre Fraktionen für zuverlässige immunblotbasierte Validierungsassays des Targets.
- Analytik: Erstellt quantitative Daten zur Proteinlokalisation durch Immunblotting, wodurch der Vergleich der Targetverteilung unter verschiedenen Bedingungen ermöglicht wird.
- Translationale Forschung: Unterstützt die Biomarkerzuordnung, indem die Anwesenheit des Targets in krankheitsrelevanten subzellulären Kompartimenten eines humanen Monozytenmodells bestätigt wird.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare, kostengünstige Fraktionierungsmethode, die auf mehrere Ziele und Projekte in der Immunologie- und Entzündungsforschung anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Steigert das Vorhersagevertrauen bei der Target-Validierung, indem mechanistische Unklarheiten durch direkte Nachweise der subzellulären Lokalisation verringert werden.
- Operativer Wert: Macht Ultrazentrifugation überflüssig, senkt die Gerätewirtschaftskosten und erhöht die Zugänglichkeit an verschiedenen Forschungsstandorten.
- Strategischer Wert: Verbessert die Effizienz von Go/No-Go-Entscheidungen, indem frühzeitige, zuverlässige Daten zur Target-Zugänglichkeit und Kompartimentalisierung bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Targets basierend auf validierter subzellulärer Lokalisation in einem physiologisch relevanten humanen Zellmodell.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in Zellkultur, subzellulärer Fraktionierung und Immunblotting-Techniken.
- Hängt von dem Zugang zu gekühlten Zentrifugen, Rotatoren und Standardlaborreagenzien wie Digitonin und hypotonen Puffern ab.
- Erfordert die Standardisierung der Zelldichte, Inkubationszeiten und Lysingbedingungen, um eine reproduzierbare Fraktionierung zwischen verschiedenen Anwendern sicherzustellen.
- Die Anpassung an andere Zelltypen kann eine Optimierung der Zusammensetzung des Lysepuffers und der Zentrifugationsparameter erfordern.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehören eine möglicherweise unvollständige Trennung der Organellen sowie Variabilität der Ausbeute, abhängig von der Zellgesundheit und der Passagezahl.
