Name: Eine verbesserte und hohen Durchsatz Respiratory Syncytial Virus (RSV) Micro-Neutralisation Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Erfahren Sie eine bildbasierte Mikroneutralisationsmethode zur Quantifizierung von RSV-neutralisierenden Antikörpern mit A549-Zellen. Dieses hochreproduzierbare Verfahren ermöglicht kostengünstige Hochdurchsatzanalysen für verschiedene Proben.

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Die Autoren danken allen Beteiligten. Wir anerkennen die Staatsregierung betriebliche Infrastruktur Support-Programm. PVL ist ein NHMRC Karriere Entwicklung-Stipendiat.

Hinweis: Alle Schritte müssen in einer BSL2 Haube durchgeführt werden, sofern nicht anders angegeben. Virale Titration ist erforderlich im Vorfeld einer PRN-Test zur Bestimmung der optimalen RSV-Konzentration in der PRN-Assay verwendet. Es empfiehlt sich, aliquoten die Virus-Bestände in einem kleinen Volumen, die einmal aufgetaut und für jede NAb-Assay verwendet werden. Mit der gleichen virale bestand für alle NAb-Assays für alle Proben aus einer Studie durchgeführt wird auch empfohlen. Stellen Sie sicher, Kultur, Medien und Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) ist bei 37 ° C erwärmt, bevor Sie Zellplatten hinzufügen.
1. RSV virale Titration
Hinweis: Je nach Virus-Bestände und die Anzahl der Duplikate kann die Assay-Platte gemäß Abbildung 1eingerichtet werden. Jeder Virus-Aktie sollte in dreifacher Ausfertigung der Assay-Platte, beginnend bei der höchsten virale Konzentration (d.h., 01:10) titriert. Serielle Titrationen können in der Regel werden 01:10. A549 Zellkultur sowie Wartung und RSV Kultur Verfahren erfolgt mit standard-Verfahren und sind in diesem Protokoll nicht enthalten.
<ol><li>Aussaat von Platten (Tag1)
	<ol>
<li>Aufschwemmen Sie A549 Zellen in Dulbeccos geändert Eagles Medium (DMEM) + 10 % fetalen Kälberserum (FCS) + 1000 IU Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) auf 4 x 105/mL. Saatgut-96-Well flach-Boden sterilen Platten mit 100 μl/Well, 4 x 104 A459 Zellen enthält.</li>
		<li>Platten über Nacht bei 37 ° C, 5 % CO2 inkubieren (Zellen werden in der Log-Phase Wachstum). Hinweis: Verwenden Sie neue A549 Zellen Fläschchen nach 23 Passagen. Es wird nicht gestartet die Experimente empfohlen, wenn eine neue Zelle Ampulle noch in den ersten drei Passagen.</li>
	</ol></li>
	<li>Virus-Infektion (Tag2)
	<ol>
<li>Vorbereitung des Virus serielle Verdünnung<ol>
<li>Tauen Sie schnell ein einzelnes gefrorenen Fläschchen RSV in einem 37 ° C Wasserbad bis fast vollständig aufgetaut und sofort auf Eis. Bereiten Sie 3 Wiederholungen für jede RSV Virus Lager geprüft werden, verwenden eine anfängliche Virus Lager Verdünnung von 01:10 mit 100 μL der verdünnten Virus/gut und reservieren Sie mindestens eine Spalte für die negativ-Kontrolle. Hinweis: Abbildung 1 zeigt negative Kontrolle in Triplicates.</li>
			<li>Fügen Sie 100 μL jeder verdünnte Virus am 01:10 in dreifacher Ausfertigung der Reihe A von einer 96-Well U-Boden steril Teller. Reihen B, H. 90 μL/Well DMEM + 1000 IU Pen/Strep ohne FCS hinzufügen</li>
			<li>Führen Sie serielle 01:10 Verdünnungen unten die Platte durch die Übertragung von 10 μL von Reihe A r. B. Mix Lösung durch Pipettieren Inhalt nach oben und unten 5 Mal und die zehnfache Verdünnungen bis Reihe H. verwerfen die letzten 10 μL fortsetzen, so dass das Endvolumen in jedem gut 90 μL. Hinweis: Es ist wichtig, neue Tipps für jede Verdünnung verwenden.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Virus Impfung A549 Zellen
		<ol>
<li>Abrufen von A549 Cell plate(s) am Vortag vorbereitet. Sicherstellen Sie, dass A549 Zellen Monoschichten in 96-Well-Platten ~ 80 % Zusammenfluss. Verwerfen Sie Medien durch die Platte vorsichtig umdrehen und leicht auf sterile saugfähigen Papiertuch abtupfen.</li>
			<li>Waschen Sie alle Vertiefungen mit 100 μl PBS zweimal, entsorgen Sie überschüssiges PBS durch Platte vorsichtig umdrehen und leicht beflecken auf sterile saugfähigen Papiertuch nach jedem Waschen. Lassen Sie Platten zum Trocknen nicht zu.</li>
			<li>Übertragen Sie die Virus-Verdünnungen von der viralen Titration Platte (Abbildung 1) in entsprechenden Vertiefungen auf A549 Zellplatte. Inkubieren Sie die Platte für 1 h bei 37 ° C, 5 % CO2. Dekantieren Sie nach 1 h Inkubation Überstände mit einer Pipette (zur Vermeidung von Kreuzkontamination). Nehmen Sie 90 μL/gut.</li>
			<li>Hinzufügen von 100 μl 1 X Medium 199 (M199, siehe Tabelle der Materialien) + 1,5 % Natriumsalz Carboxymethylcellulose (CMC) geringe Viskosität + 2 % FCS mit Pen/Strep in jede Vertiefung. Hinweis: 2 x M199 + 4 % FCS + 2 % Pen/Strep und 3 % CMC Lösungen müssen im Voraus vorbereitet und bei 4 ° C für eine spätere Verwendung gespeichert werden. Stellen Sie sicher, dass die Lösung bei 37 ° C erwärmt wird, bevor Sie zu Platten hinzufügen.<ol>
<li>Bereiten Sie 2 x M199 Lösung: 1 Beutel/500 mL destilliertes Wasser + 20 mL FCS + 10 mL Pen/Strep (zu 2 x MI99). Filtern Sie die Lösung mit einer 0,22 μm-Filter-Einheit.</li>
				<li>Für die Zubereitung von 3 % CMC, 15 g CMC langsam in 500 mL destilliertem Wasser hinzugeben. Auflösen der CMC im Wasser mithilfe von metallischen Rührer Heizung bei 50 ° C, ca. 1 h Vorbereitung führt. Mischung gut zu 3 % CMC und Autoklaven die Lösung. Hinweis: Die CMC solide muss zu dem Wasser hinzugefügt werden, um aufgelöst werden; Zugabe von Wasser zu den trockenen Volumenkörper erzeugt ein "Büschel" Festkörper, der sehr schwer zu lösen ist.</li>
				<li>Bereiten Sie 1 x M199 + 1,5 % CMC niedrige Viskosität + 2 % FCS Pen/Strep durch das Mischen von 1:1 mit 2 x M199 und 3 % CMC im Schritt 1.2.2.4.2 vorbereitet.</li>
			</ol>
</li>
			<li>3 Tage bei 37 ° C, 5 % CO2inkubieren Sie Platte.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Entwicklung von Assays Platte und Analyse (Tag 5)
	<ol>
<li>Fixierung und entwickelnden Assay-Platte<ol>
<li>M199 + CMC + 2 % FCS mit Pen/Strep durch vorsichtig umdrehen der Plattenrandes zu verwerfen. Fügen Sie langsam (zur Vermeidung von stören die Zellschicht) 200 μL der Fixierung Puffer (80 % Aceton, 20 % PBS, bei-20 ° C gelagert), Zellen zu beheben. Bei-20 ° C für 20 min inkubieren.</li>
			<li>Verwerfen des Fixierung-Puffers und Tupfen auf saugfähigem Papierhandtuch. Plattenfläche zu verlassen bis zu 10 min trocknen lassen. Hinweis: Von diesem Schritt ab kann Assay außerhalb der BSL2 Haube durchgeführt werden.</li>
			<li>Bereiten Sie 5 % Milch Verdünnungsmittel blockierende Lösung in gefilterten PBS mit 0,05 % Polysorbat 20 (PBS-Polysorbat, siehe Tabelle der Materialien). Für eine Platte, berechnen Sie das Volumen für Sperrung auf 200/gut und 110 Brunnen basiert benötigt: 200/Well X 110 Brunnen 22 mL = (1,1 mL konzentrierte Milch in 20,9 mL diluent gefiltert PBS-Polysorbat). In diesem Stadium auch ausreichend blockierende Lösung für primäre und sekundäre Antikörper bilden. Für eine Platte, berechnen Sie das Volumen für jeden Antikörperlösung auf Basis von 50/gut und 110 Brunnen benötigt: 50/gut X 110 Brunnen = 5,5 mL. Daher ist das Gesamtvolumen der Milch Verdünnungsmittel blockiert Lösung für eine einzelne Platte Assay erforderliche 33 mL.</li>
			<li>Fügen Sie 200 /well von blockierenden Lösung. Inkubieren Sie Platte bei Raumtemperatur (RT) 30 min. verwerfen die Lösung durch die Platte vorsichtig umdrehen und auf saugfähiges Küchenpapier Tupfen.</li>
			<li>Bereiten Sie 1: 500 X RSV Ziege Antikörper (mAb-Primärantikörper) verdünnt in blocking-Lösung vor. Fügen Sie 50 /well der mAb-Lösung und Inkubation bei 37 ° C für 1 h waschen Platte 3 Mal mit gefilterten PBS-Polysorbat.</li>
			<li>Bereiten Sie 1:5,000 Alexa Fluor Esel Anti-Ziege IgG (Sekundärantikörper) verdünnt in blocking-Lösung vor. Fügen Sie 50 /well der Sekundärantikörper Lösung und Inkubation bei 37 ° C für 1 h waschen Platte 5 Mal mit gefilterten PBS-Polysorbat.</li>
			<li>Lesen Sie Platte auf einem automatisierten Flecken Reader mit dem Fluorescein erfolgt (FITC) Channel zu und zählen Sie Einstellungen wie in Abbildung 2dargestellt. Platte in Folie wickeln und bei 4 ° c lagern Kalibrieren Sie das Gerät mit einer nicht verwendeten 96-Well-Kultur-Platte und Eingabe Anzahl Einstellungen vor dem Test. Hinweis: Innerhalb von wenigen Tagen zu scannen ist möglich, wenn erforderlich. Die Kalibrierung und Graf Einstellung können gespeichert und verwendet für die zukünftigen Scans, wenn der Test die gleiche Art von Platte, die für die Kalibrierung verwendet verwendet werden.</li>
			<li>Überprüfen Sie die Bilder der Brunnen für Artefakt Plaques oder gestörte Zelle Monoschichten (Abbildung 3). Brunnen mit gestörten Zelle Monolagen auszuschließen. Hinweis: Abhängig von der Größe der Artefakt Plaques manuelle Zählungen können für diese Brunnen durchgeführt werden müssen oder die Brunnen müssen aus der Datenanalyse verworfen werden. Kriterien für ein gültiges Ergebnis sind keine gestörten Zelle Monolage oder Artefakt Plaques in mehr als eine Wiederholung gut erkannt und keine PFU in negativen Brunnen (Brunnen ohne zusätzlichen Virus) nachgewiesen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Virale Konzentrationen zu bestimmen
		<ol>
<li>Wählen Sie die letzten beiden Verdünnungen, wo die Flecken deutlich gezählt werden kann. Berechnen Sie die durchschnittliche Anzahl der Spots von replizieren Wells in der gleichen Verdünnung. Berechnen Sie die virale Titer (PFU pro mL) der Lager Probe mit Hilfe der folgenden Formel: PFU/mL = durchschnittliche Anzahl von Plaketten / (Verdünnung Faktor × Volumen des verdünnten Virus hinzugefügt, um den Brunnen) Hinweis: Der Viruskonzentration bestimmt für jede Aktie RSV kann jetzt in der PRN-Assay (Schritt 2) verwendet werden.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. RSV Neutralisation Assay
<ol><li>
Aussaat von Platten (Tag1)
	<ol>
<li>Aufschwemmen Sie A549 Zellen in DMEM + 10 % FCS + 1000 IU Pen/Strep auf 4 x 105/mL. Saatgut-96-Well flach-Boden sterilen Platten mit 100 μl/Well mit 4 x 104 A459 Zellen und inkubieren Sie Platten über Nacht bei 37 ° C, 5 % CO2 (Zellen werden in der Log-Phase Wachstum). Hinweis: Verwenden Sie neue A549 Zellen Fläschchen nach 23 Passagen. Es wird nicht empfohlen, A549 Zellen vor Durchgangsnummer 3 zu verwenden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Virus und Serum-Vorbereitung (Tag2) Hinweis: Je nach Probentyp sind die erforderlichen Schritte für die Vorverarbeitung Proben vor der NAb-Assay. Es wird empfohlen, die RSV internationale standard Sera zu verwenden, die jetzt auf Anfrage vom nationalen Institut für biologischen Standards und Kontrollen (NIBSC) erhältlich sind.<ol>
<li>
Vorbereitung der Serum-Verdünnung
		<ol>
<li>Auftauen der menschlichen RSV Referenz Antiserum (Referenz Serum, REF) und Serum Proben bei RT Hitze inaktivieren Serumproben und Antiserum in einem Wasserbad bei 56 ° C für 30 min vor dem Gebrauch zu verweisen. Bereiten Sie Verdünnungen gemäß der Platte Vorlage (Abbildung 4).</li>
			<li>Vorbereitung 1: 100 Verdünnung von der Ref-Vorbereitung mindestens 110 μL der REF verdünnt in DMEM + Pen/Strep ohne FCS pro Assay Platte (z.B., 1,5 μL der REF in einem Gesamtvolumen von 150 μL). Fügen Sie 110 μL von 1: 100 verdünnt REF in gut A12 von einer 96-Well U-Boden steril Teller.</li>
			<li>Vertiefungen B12 H12 in Spalte 12 55 μL DMEM + Pen/Strep ohne FCS hinzufügen. Durchführen Sie serielle Verdünnungen von 1:2 nach unten die Platte durch Übertragung von 55 μL von Reihe A, Reihe B, mixing-Lösung durch Pipettieren Inhalt nach oben und unten 5 Mal und weiter bis Reihe H. verwerfen die endgültige 55 μL der Medien so, dass das Endvolumen in jedem gut 55 μL. Verwenden Sie neue Tipps für jede Verdünnung.</li>
			<li>1: 100 Verdünnung des Serums Testproben vorbereiten. Wie alle Serumproben in dreifacher Ausfertigung untersucht sind, bereiten Sie ein Mindestvolumen von 110 μl/Well x 3 = 330 μl pro Test Serumprobe.</li>
			<li>Fügen Sie 110 μL jeder verdünnte Serum Test Probe (1: 100; S1 = Serum 1, S2 = Serum 2, etc..) in entsprechenden Vertiefungen A1 bis A9 und auch E1 bis E9 der sterilen 96-Well Platte gemäß Abbildung 4.</li>
			<li>Fügen Sie 55 μL der DMEM + Pen/Strep ohne FCS in alle Vertiefungen gekennzeichnet X. Perform serielle Verdünnungen von 1:2 nach Schritt 2.2.1.3 bis Reihe D (für Proben 1, 2 und 3). Die letzten 55 μL der Medien zu verwerfen, so dass das Endvolumen in jede Vertiefung 55 μL. Ebenso führen der serielle Verdünnungen von 1:2 für Proben, 4, 5 und 6 Zeilen E bis H. Hinweis: Es ist wichtig, neue Tipps für jede Verdünnung verwenden.</li>
			<li>Brunnen in den Spalten 10 und 11 55 μL DMEM + Pen/Strep ohne FCS hinzufügen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Vorbereitung des virus
		<ol>
<li>Tauen Sie schnell ein einzelnes gefrorenen Fläschchen RSV in einem 37 ° C Wasserbad bis fast vollständig aufgetaut und sofort auf Eis.</li>
			<li>Verdünnen Sie Virus in DMEM + Pen/Strep ohne FCS anhand der Konzentration der RSV aliquoten bestimmt im Schritt 1.3.2. Anwenden einer Verdünnung, die etwa 200 PFU/Brunnen gibt. Bereiten Sie ein Gesamtvolumen von 5,5 mL (für 100 Brunnen).</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Vorbereitung der Virus-Serum-Mischung
		<ol>
<li>55 des verdünnten Virus hinzu kommen alle Brunnen der Spalten 1 bis 9 und Brunnen von Stützenreihen E-H 10 und 11 (Positivkontrolle) entsprechend der Platte Vorlage (Abbildung 4).</li>
			<li>Alle Brunnen der Zeilen A-D Spalten 10 und 11 (Negativkontrolle) 55 DMEM + Pen/Strep ohne FCS hinzufügen. Inkubieren Sie die Platte für 1 h bei 37 ° C, 5 % CO2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Virus Impfung A549 Zellen
		<ol>
<li>Rufen Sie vor der Fertigstellung der Inkubationszeit A549 Cell plate(s) in Schritt 2.1.1 vorbereitet ab. Sicherstellen Sie, dass A549 Zellen Monoschichten in 96-Well-Platten ~ 80 % Zusammenfluss.</li>
			<li>Verwerfen Sie Medien durch die Platte vorsichtig umdrehen und leicht auf sterile saugfähigen Papiertuch abtupfen. Waschen Sie alle Vertiefungen mit 100 μl PBS zweimal, entsorgen Sie überschüssiges PBS durch Platte vorsichtig umdrehen und leicht beflecken auf sterile saugfähigen Papiertuch nach jedem Waschen. Lassen Sie Platten zum Trocknen nicht zu.</li>
			<li>Übertragen Sie 100 /well die Virus-Serum-Mischung in die entsprechenden Vertiefungen auf A549 Zellplatte nach der Platte Vorlage Inkubation der Platte für 1 h bei 37 ° C, 5 % CO2.</li>
			<li>Nach 1 h, mit einer Pipette, 90/gut herausnehmen und fügen Sie vorgewärmt 100 1 x M199 + 1,5 % CMC + 2 % FCS + Pen/Strep. 3 Tage bei 37 ° C, 5 % CO2inkubieren Sie Platte. Hinweis: Stellen Sie sicher, dass die Lösung bei 37 ° C erwärmt wird, bevor Sie zu Platten hinzufügen.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Entwicklung von Assays Platte und Analyse (Tag 5)
	<ol>
<li>Fixierung und Assay Platte folgende Schritte 1.3.1.1 zu 1.3.1.8 zu entwickeln.</li>
		<li>Die 50 %-Neutralisation-Titer zu bestimmen<ol>
<li>Bestimmen Sie die 50 %-Neutralisation-Titer durch die Berechnung der proportionalen Abstand zwischen die gegenseitige Serum Verdünnungen oben und unter 50 % des Steuerelements "kein Serum" (positive Virus Control - Spalte 10, Zeilen E-H) Brunnen.</li>
			<li>Die Anzahl der PFU (d.h. Plaketten) aus einzelnen Virusinfektionen in Serum Brunnen und kein Serum-Kontroll-Vertiefungen. Berechnen Sie die durchschnittliche Anzahl von PFU die kein Serum-Kontroll-Vertiefungen und bestimmen Sie den Wert von 50 %.</li>
			<li>Serum-Verdünnungen mit zählt die unmittelbar oberhalb und unterhalb der 50 % des Wertes des die kein Serum-Kontroll-Vertiefungen sind zu identifizieren. Mit einem semi-log Graph oder Arbeitsblattvorlage, zeichnen Sie die Anzahl der PFU auf der x-Achse (lineare Skala) und die gegenseitige Serum Verdünnung auf der y-Achse (Log10 Skala). Zeichnen Sie eine Linie zwischen den beiden Punkten und lesen Sie 50 % Neutralisation Titer des Tests Serumproben aus dieser Linie zu. Hinweis: RSV PRN-Assay-Arbeitsblatt (Ergänzende Arbeitsblatt) wird verwendet, um die 50 %-Neutralisation-Titer zu bestimmen.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Shi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global%2C+regional%2C+and+national+disease+burden+estimates+of+acute+lower+respiratory+infections+due+to+respiratory+syncytial+virus+in+young+children+in+2015%3A+a+systematic+review+and+modelling+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study.</a> Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Wir haben entwickelt und optimiert, einen einfachen und effizienten RSV Mikro-Neutralisation-Assay, der leicht in den meisten Labors angepasst werden kann. Dieser Assay ist in der Lage, Virusinfektion Fähigkeit sowie die Messung der Hemmung der viralen Infektion durch NAb auf zellulärer Ebene mit computerisierten Bild scannen zu messen. Die Verwendung von einer Imaging-basierten Plattform und spezifische Antikörper-basierten Systeme ist die Spezifität und Sensitivität der Spoterkennung im Vergleich zu herkömmlichen Plaqu...

Respiratory syncytial Virus (RSV) ist die führende Ursache von Infektionen der unteren Atemwege in der pädiatrischen Population weltweit1. Trotz seiner hohen Belastung gibt es noch keine Impfung oder Behandlung zur Verfügung. Seit 2013 hat die Weltgesundheitsorganisation (WHO) RSV Impfstoffentwicklung vorrangig Großforschungseinrichtungen, mit jährlichen WHO Beratung treffen2,3erklärt. Die WHO hat vereinbart mit RSV neutralisierenden Antikörpern (NAb) Messung Impfstoff Immunogenität, zu überwachen, wie dies als großen serologische Marker für Schutz4erkannt wird. Jonas wurden zum Schutz vor schweren RSV-Infektion in einer Reihe von Studien, sowie klinischen Studien mit Anti-RSV monoklonalen Antikörper Palivizumab, derzeit nur prophylaktische Strategie zur Verfügung4gezeigt.
Es gibt mehrere NAb Assay Formate von Laboratorien weltweit, einschließlich der Zelle und molekulare-basierte Assays, die Standardisierungsbemühungen5,6,7,8herausfordernde gemacht haben. Die Plaque-Reduzierung der konventionellen Neutralisation (PRN) Assay, der die Anzahl der reduzierten Plaque bilden Einheiten (PFU) durch die Anwesenheit von einer RSV-spezifischen Antikörper misst bleibt jedoch noch der Goldstandard-9. Hier berichten wir über ein verbessertes, vereinfachte und Hochdurchsatz-PRN-Protokoll, das auf zahlreichen Zelllinien für RSV-Sorten und mit erhöhten Assay Durchsatz verwendet werden kann. Dieses Protokoll wurde mit klinischen Proben aus verschiedenen Einstellungen sowie an Proben aus Tiermodell Experimenten getestet.

<table><tbody><tr><td>Cell line</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td>zur Verfügung gestellt von Dr. Keith Chappell, University of Queensland</td></tr><tr><td>Viral strains</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RSV A2</td><td>ATCC</td><td>VR-1540</td><td>Chargennummer 60430286</td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Merck</td><td>1000142511</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-Fluor Esel Anti-Ziegen-IgG (gelagert bei 4 &deg; C)</td><td>Life Technologies</td><td>A11055</td><td></td></tr><tr><td>CMC Natriumsalzpulver</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5678-500G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (kein Serum, 3,7 g/L NaHC, P/S) (gelagert bei 4 &/de; C)</td><td>Wissenschaftliche Dienstleistungen &ndash; Gewebekultur</td><td></td><td>MCRI in der Hausversorgung</td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum (gelagert in 50 mL Aliquoten bei -20 &de; C)</td><td>Interpath</td><td>SFBS-F</td><td></td></tr><tr><td>Goat X RSV Antikörper</td><td>Merck</td><td>AB1128</td><td></td></tr><tr><td>humanes polyklonales Antiserum gegen das Respiratorische Synzytial-Virus (RSV) (gelagert in 45 & micro; L aliquotiert bei -20 &deg; C)</td> <td>BEI Resources</td><td>NR-4022</td><td>Kostenlose Bestellung über BEI Resources bei der Registrierung. Dieses Serum gehört zu einer Reihe von humanen Antiserum und Immunglobulin gegen RSV (NR-32832)</td></tr><tr><td>M199 Pulver</td><td>Life Technologies</td><td>31100035</td><td></td></tr><tr><td>Milchverdünnungsblockierungslösung (gelagert bei 4 & Grad; C)</td><td>Australian Biosearch</td><td>50-82-01</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin (gelagert in 6 ml-Aliquoten bei -20 &deg; C)</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>s.d.H2O aus Milli-Q Dispenser</td><td>Merck</td><td></td><td>Eigene Abgabe</td></tr><tr><td>Steril 1x PBS für Kultur (gelagert bei 4 > C)</td><td>Wissenschaftliche Dienstleistungen &ndash; Gewebekultur</td><td></td><td>MCRI in Hausversorgung</td></tr><tr><td>Tween 20 Polysorbat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td><stark>Allgemeine Verbrauchsmaterialien</stark></td>konische Falcon-Röhrchen <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(50 mL)</td><td>Invitro Technologies</td><td>FAL352070</td><td></td></tr><tr><td>Filtereinheit 0,22 &mu; m (500 mL)</td><td>Thermo Fisher</td><td>NAL5660020</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Eppendorf-Röhrchen (1,5 mL)</td><td>Australia PL</td><td>AM12400</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Platten mit flachem Boden (96 Well mit Deckel)</td><td>Interpath</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Platten mit U-Boden (96 Well mit Deckel)</td><td>Interpath</td><td>650180</td><td></td></tr><tr><td>Serologische 5-ml-Pipette</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS4487-200EA</td><td></td></tr><tr><td>10 mL serologische Pipette</td><td>Interpath</td><td>607180</td><td></td></tr><tr><td>25 mL serologische Pipette</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS4251-200EA</td><td></td></tr><tr><td>Spitze Pipette 1-200 &micro; L Clear Maxymum Recovery Racked Vorsterilisiert 10RACKS x 96TIPS PKG960</td><td>Fisher Biotec</td><td>TF-200-L-R-S</td><td></td></tr><tr><td>Spitze Pipette 5-20 &micro; L Clear Maxymum Recovery Racked Vorsterilisiert 10RACKS x 96TIPS PKG960</td><td>Fisher Biotec</td><td>TF-20-L-R-S</td><td></td></tr><tr><td>Spitze Pipette 100-1.000 &micro; LClear Maxymum Recovery Racked Vorsterilisiert 10RACKS x 100TIPS PKG1000</td><td>Fisher Biotec</td><td>TF-1000-L-R-S</td><td></td></tr><tr><td>Spitzenpipette 1-10 & micro; L Clear Maxymum Recovery Racked Vorsterilisiert 10RACKS x 100TIPS PKG1001</td><td>Fisher Biotec</td><td>TXLF-10-L-R-S</td><td></td></tr><tr><td>Ausrüstungen und SoftwaresELISpot</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Lesesystem</td><td>AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AID ELISpot Software Version 5.0</td><td>AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel 2007</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

eine verbesserte und hohen durchsatz respiratory syncytial virus (rsv) micro-neutralisation assay

An Improved and High Throughput Respiratory Syncytial Virus (RSV) Micro-neutralization Assay

Respiratory syncytial Virus-spezifischen neutralisierenden Antikörper (RSV NAbs) sind ein wichtiger Marker der Schutz gegen RSV. Eine Reihe von verschiedenen Assay-Formate sind derzeit weltweit im Einsatz so gibt es eine Notwendigkeit für eine präzise und Hochdurchsatz-Methode zur Messung der RSV NAbs. Wir beschreiben hier einen Imaging-basierte Mikro-Neutralisation-Assay, der auf RSV Untergruppe A getestet wurde und kann auch für RSV Untergruppe B und verschiedenen Probentypen angepasst werden. Diese Methode ist sehr reproduzierbar, mit Inter-Assay-Variationen für den Referenz-Antiserum wird weniger als 10 %. Wir glauben, dass dieser Test leicht in vielen Laboren weltweit relativ kostengünstig hergestellt werden kann. Entwicklung einer verbesserten, Hochdurchsatz-Assays, die RSV NAbs misst ist ein bedeutender Schritt nach vorn für die Standardisierung von dieser Methode international als entscheidend für die Bewertung der neuartigen RSV Impfstoffkandidaten in der Zukunft.

Die Titration einer Virus-Aktie wurde durchgeführt von 01:10, 01:108 Verdünnung der Viruskonzentration Lager vor der PRN-Assay (repräsentative Ergebnisse in Abbildung 5dargestellten) zu bestimmen. Aus Abbildung 5, PFU gezählt werden kann zuverlässig bei Verdünnungen von 01:104 und 01:105. Die durchschnittliche Anzahl der PFU aus dreifacher Brunnen bei der gleichen Verdünnung wurde berechnet. Da di...

Diese Studie beschreibt einen hohen Durchsatz, Imaging-basierte Mikro-Neutralisation Assay der Titer von neutralisierende Antikörper spezifisch für respiratory syncytial Virus (RSV) zu bestimmen. Dieser Assay-Format wurde auf verschiedenen Probenarten getestet.

Eine verbesserte und hohen Durchsatz Respiratory Syncytial Virus (RSV) Micro-Neutralisation Assay

Respiratory syncytial virus-specific neutralizing antibodies (RSV NAbs) are an important marker of protection against RSV. A number of different assay ...

Es ist eine genaue und hohe Durchsatzmethode zur Messung von RSV-Neutralisationsantikörpern erforderlich, als wichtiger Marker für den Schutz vor respiratorischen Synzytialviren. Diese Methode ist sehr reproduzierbar mit Inter-Assay-Variationen für das Referenzantiserum unter 10%Wir glauben, dass dieser Assay in vielen Laboratorien weltweit zu relativ niedrigen Kosten leicht etabliert werden kann. Wir beschreiben hier einen bildgebenden Mikroneutralisationstest, der auf RSV-Untergruppe A getestet wurde und auch für Die RSV-Untergruppe B und verschiedene Probentypen angepasst werden kann.Demonstriert wird das Verfahren von Reuben Tse, einem Mitglied des Forschungsteams von MCRI. Um Platten am ersten Tag auszusäen, setzen Sie zuerst A549-Zellen in DMEM-Medien mit 10%FCS und 1.000 Einheiten Penicillin-Streptomycin-Mischung in einer Konzentration von 400.000 Zellen pro Milliliter wieder aus. Dann säen Sie 96-gut flache sterile Platten mit 40 000 A459 Zellen mit einer Dichte von 100 Mikrolitern pro Brunnen.Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid-Umgebung über Nacht. Um die Serumverdünnung am zweiten Tag vorzubereiten, tauen zunächst die menschlichen RSV-Referenzserum- und Serumtestproben bei Raumtemperatur auf. Dann legen Sie sie in einem Wasserbad bei 56 Grad Celsius für 30 Minuten zu erhitzen und zu aktivieren.Als nächstes bereiten Sie mehr als 110 Mikroliter einer ein bis 100 Verdünnung des Referenzserums vor, indem Sie 1,5 Mikroliter des Referenzserums mit FCS-freien DMEM-Medien mit Penicillin-Streptomycin-Mischung auf ein Endvolumen von 150 Mikrolitern mischen. Pipette 110 Mikroliter dieser Verdünnung in gut A12 einer 96-Well U-Boden sterilen Platte. Um serielle ein bis zwei Verdünnungen auf der Platte zu machen, fügen Sie zunächst 55 Mikroliter FCS-freie DMEM-Medien mit Penicillin-Streptomycin-Mischung zu den Brunnen B12 bis H12 hinzu.Dann mit einer neuen Spitze transferieren 55 Mikroliter von gut A12 auf gut B12. Pipette nach oben und unten fünf Mal, um die Lösung zu mischen, und weiter, bis Sie gut H12 erreichen. Pipette aus den überschüssigen 55 Mikroliter der Lösung von gut H12.Als nächstes bereiten Sie eine einbis 100 Verdünnung der Serumproben vor und fügen Sie 110 Mikroliter jeder Verdünnung zu den entsprechenden Bohrungen A1 bis A9 und E1 bis E9 der 96-well sterilen Platte hinzu. Dann 55 Mikroliter FCS-freies DMEM-Medium mit Penicillin-Streptomycin-Mischung in die Bohrungen eins bis neun geben. Machen Sie seriell einbis zwei Verdünnungen von Zeile A in Zeile D und von Zeile E in Zeile H, wie zuvor beschrieben.Fügen Sie 55 Mikroliter FCS-freies DMEM-Medium mit Penicillin-Streptomycin-Mischung in die Brunnen in den Spalten 10 und 11 ein. Um den Virusbestand vorzubereiten, legen Sie zunächst eine gefrorene Durchstechflasche RSV in ein 37 Grad Celsius Wasserbad, um ihn schnell aufzutauen, und legen Sie dann die Durchstechflasche auf Eis. Als nächstes fügen Sie das Virus zu den DMEM-Medien, die Penicillin-Streptomycin-Mischung bei etwa 200 PFU pro Brunnen, um ein Gesamtvolumen von 55 Milliliter für 100 Brunnen zu machen.Um die Virusserummischung vorzubereiten, fügen Sie zunächst 55 Mikroliter des verdünnten Virus in alle Brunnen der Spalten eins bis neun und Brunnen der Zeilen E bis H der Spalten 10 und 11 hinzu. Dann 55 Mikroliter FCS-freie DMEM-Medien mit Penicillin-Streptomycin-Mischung in alle Brunnen der Reihen A bis D der Spalten 10 und 11 geben und die Platte bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid-Umgebung für eine Stunde bebrüten. Untersuchen Sie vor der Impfung von A549-Zellen mit RSV die Zellplatte unter einem Lichtmikroskop, um zu bestätigen, dass A549-Zellmonolayer zu 80 % konfluent sind.Dann invertieren Sie die Platte sanft, um die Medien zu entsorgen, und bersten Sie die Platte leicht auf einem sterilen saugfähigen Papiertuch. Danach mit gefiltertem sterilem PBS waschen. Als nächstes 100 Mikroliter pro Brunnen des Virusserumgemisches in die entsprechenden Brunnen auf der A549-Zellplatte nach der im Manuskript enthaltenen Plattenschablone geben und die Platte bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid für eine Stunde bebrüten.Verwenden Sie am Ende der Inkubation eine Pipette, um 90 Mikroliter pro Bohrgut zu entfernen, und fügen Sie 100 Mikroliter der Medien hinzu, die 1XM199, 1,5%CMC und 2%FCS in Penicillin-Streptomycin-Mischung enthalten. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid für drei Tage. Um eine Assayplatte zu fixieren und zu entwickeln, kehren Sie zunächst die RSV-infizierte A549-Zellplatte vorsichtig um, um die Medien mit M199, CMC, 2%FCS und Penicillin-Streptomycin-Mischung zu entsorgen.Dann fügen Sie langsam 200 Mikroliter Fixationspuffer zu jedem Brunnen hinzu. Inkubieren Sie die Platte bei minus 20 Grad Celsius für 20 Minuten. Dann entsorgen Sie den Fixierungspuffer und blots sanft auf einem saugfähigen Papiertuch.Lassen Sie die Platte 10 Minuten lang mit dem Gesicht nach unten trocknen. Dann mit gefilterten PBS-Puffer enthält 05 Polysorbat 20, machen 5%Milch-Blockierungslösung. Fügen Sie 200 Mikroliter der Blockierlösung zu jedem Brunnen hinzu und inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für 30 Minuten.Am Ende der Inkubation die Platte sanft umkehren, um die Lösung zu entsorgen und auf einem saugfähigen Papiertuch zu bleben. Um den primären Antikörper herzustellen, verdünnen Sie einen bis 500 Ziegen XRSV Antikörper in der Blockierlösung. Fügen Sie 50 Mikroliter zu jedem Brunnen hinzu und bebrüten die Platte bei 37 Grad Celsius für eine Stunde.Waschen Sie die Platte dreimal mit gefiltertem PBS-Polysorbat. Als nächstes machen Sie den sekundären Antikörper, indem Sie ein bis 5.000 Alexa Fluor Esel Anti-Ziegen-Immunglobulin G in der Blockierlösung verdünnen. Fügen Sie 50 Mikroliter zu jedem Brunnen hinzu und brüten bei 37 Grad Celsius für eine Stunde.Waschen Sie die Platte fünfmal mit gefiltertem PBS-Polysorbat. Um Plaques mit einem automatisierten Spot-Reader zu zählen, verwenden Sie zunächst eine ungenutzte 96-Well-Kulturplatte, um das Instrument zusammenzuarbeiten, indem Sie die Zähleinstellungen im FITC-Kanal eingeben. Lesen Sie dann die Zellplatte, wickeln Sie sie in Folie und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius.Überprüfen Sie als Nächstes die Bilder von Brunnen auf Artefakt-Plaques oder gestörte Zellmonolayer und schließen Sie Brunnen mit gestörten Zellmonolayern aus. Die durchschnittliche Anzahl der Plaques der No-Serum-Kontrollbrunnen wurde berechnet und verwendet, um die 50%-Neutralisationsabschaltung zu bestimmen, die zu einer 50%igen Hemmung der Virusaktivität führen würde. Die reziproke Serumverdünnung wurde auf der x-Achse und die Anzahl der Plaques auf der y-Achse eines Halbprotokolldiagramms aus einer Linie zwischen den beiden Punkten gezeichnet.Die 50%neutralisationstitres der Testserumproben waren rot und Serumverdünnungen mit Anzahlen unmittelbar über oder unter dem 50%-Wert der No-Serum-Kontrollbrunnen wurden identifiziert. RSVAPRN-Assays in zwei verschiedenen erwachsenen Kohorten aus Gambia und gesunden Freiwilligen in Melbourne führten dazu, dass die gambischen Erwachsenen im Vergleich zu den Erwachsenen in Melbourne einen niedrigeren mittleren NAB-Titer hatten. Das gezeigte humane RSV-Referenzserum weist eine sehr geringe Variabilität mit dem Variationskoeffizienten von 6,82% dieser verbesserte RSV-Plaquereduktions-Neutralisationstest mit hohem Durchsatz kann leicht in vielen Laboratorien implementiert werden und wird die internationalen Harmonisierungsbemühungen der WHO für RSV-neutralisierende Antikörper-Assays unterstützen.Dies wird für die Bewertung neuer RSV-Impfstoffkandidaten in Zukunft von entscheidender Bedeutung sein.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Dieses Protokoll beschreibt ein allgemeines Verfahren für die Untersuchung rekombinanten Rezeptor-bindende Domäne (RBD)-basierte Subunit-Impfstoffe gegen SARS. Es umfasst Methoden für die Transfektion und Expression von RBD-Protein in 293T-Zellen, Immunisierung von Mäusen mit RBD und den Nachweis von Neutralisation Aktivität Mausseren anhand eines etablierten SARS pseudovirus Neutralisationstest.

Protokoll für die rekombinante RBD-basierte Impfstoffe SARS: Protein Preparation, Animal Impfung und Neutralisation Erkennung

Dieses Video zeigt einen Assay zur Messung von neutralisierenden Antikörpern gegen das Respiratorische Synzytial-Virus (RSV). Die Vorinkubation mit Serum, das RSV-neutralisierende Antikörper enthält, neutralisiert die Viruspartikel und reduziert so die Zellinfektion und die Plaquebildung. Virusinfizierte Zellen werden dann einer Fixierung, Blockierung und Fluorophor-konjugierten Antikörpermarkierung zur Visualisierung von Plaques unterzogen. Dieser Prozess ermöglicht die Identifizierung der...

Ein Assay zur Messung des neutralisierenden Antikörpertiters, der spezifisch für das Respiratorische Synzytialvirus ist

Das humane Respiratorische Synzytial-Virus (HRSV) kann bei jungen Säuglingen schwere Bronchiolitis verursachen. Ein Teil der Pathogenese der schweren HRSV-Erkrankung wird durch die Immunantwort des Wirts verursacht. Die Stimulation primärer humaner Immunzellen mit HRSV bietet ein schnelles und reproduzierbares Modellsystem zur Untersuchung der Aktivierung von Entzündungswegen und Infektionen.

Ein In-vitro-Modell zur Untersuchung der Immunantworten von mononukleären Zellen des humanen peripheren Blutes auf eine Infektion mit humanen respiratorischen Synzytialviren

Diese Studie beschreibt ein   Imaging-basierte Mikroneutralisationstest auf die antigenen Beziehungen zwischen Viren zu analysieren. Das Protokoll verwendet einen Flachbettscanner und hat vier Schritte, einschließlich der Titration Titration Quantifizierung, Neutralisierung und Neutralisierung Quantifizierung. Der Test funktioniert gut mit aktuellen zirkulierenden Influenza A (H1N1) pdm09, A (H3N2) und B-Viren.

Optimierung eines Assay Quantitative Mikroneutralisations

Wir beschreiben eine Methode zur Erzeugung und Verstärkung genetisch modifiziert respiratory syncytial Viren (RSV) und eine optimierte Plaque-Assay für RSV. Wir veranschaulichen dieses Protokolls durch die Schaffung von zwei rekombinanter Viren, die Quantifizierung der RSV-Replikation ermöglichen bzw. live-Analyse des RSV Einschlusskörperchen und Einschlusskörperchen-assoziierten Granulat Dynamik.

Erzeugung, Verstärkung und Titration von rekombinanten Respiratory Syncytial Viren

Für eine eingehende mechanistische Analyse der RNA-Synthese des respiratorischen Synzytialvirus (RSV) berichten wir über ein Protokoll zur Verwendung des Chaperonphosphoproteins (P) zur Koexpression des RNA-freien Nukleoproteins (N0)für die anschließende in vitro-Assemblierung der virusspezifischen Nukleokapside (NCs).

Generierung und Aufbau virusspezifischer Nukleokapsiden des respiratorischen Synzytialvirus

Das hier beschriebene Protokoll skizziert eine schnelle und effektive Methode zur Messung neutralisierender Antikörper gegen das SARS-CoV-2-Spike-Protein, indem die Fähigkeit rekonvaleszenter Serumproben bewertet wird, die Infektion durch ein verbessertes grün fluoreszierendes proteinmarkiertes vesikuläres Stomatitisvirus zu hemmen, das mit Spike-Glykoprotein pseudotypisiert ist.

Nachweis von SARS-CoV-2 neutralisierenden Antikörpern mittels Hochdurchsatz-Fluoreszenzbildgebung von Pseudovirus-Infektionen

Ein Flow-Analysesystem für perlenbasierte Multiplex-Assays, das eine Zwei-Reporter-Ablesung ermöglicht, wurde für die Entwicklung von multiplex-serologischen und Antikörper-Neutralisationsassays verwendet, die gleichzeitig neutralisierende IgG- und IgM-Antikörper für SARS-CoV-2 messen können.

Ein schneller Multiplex-Dual-Reporter-IgG- und IgM-SARS-CoV-2-Neutralisationsassay für ein multiplexed Bead-basiertes Durchflussanalysesystem

Ein umfassendes Laborprotokoll und ein Analyse-Workflow werden für einen schnellen, kostengünstigen und unkomplizierten kolorimetrischen zellbasierten Assay zur Erkennung neutralisierender Elemente gegen AAV6 beschrieben.

Eine Schritt-für-Schritt-Methode zum Nachweis neutralisierender Antikörper gegen AAV mit einem kolorimetrischen zellbasierten Assay

Pseudotypisierte Viren (PVs) sind replikationsdefekte Virionen, die verwendet werden, um Wirt-Virus-Interaktionen unter sichereren Bedingungen zu untersuchen als mit authentischen Viren. Hier wird ein detailliertes Protokoll vorgestellt, das zeigt, wie SARS-CoV-2-PVs verwendet werden können, um die neutralisierende Fähigkeit des Serums von Patienten nach einer COVID-19-Impfung zu testen.

Pseudotypisierte Viren als molekulares Werkzeug zur Überwachung humoraler Immunantworten gegen SARS-CoV-2 mittels Neutralisationsassay

Erfahren Sie eine bildbasierte Mikroneutralisationsmethode zur Quantifizierung von RSV-neutralisierenden Antikörpern mit A549-Zellen. Dieses hochreproduzierbare Verfahren ermöglicht kostengünstige Hochdurchsatzanalysen für verschiedene Proben.

Eine verbesserte und hohen Durchsatz Respiratory Syncytial Virus (RSV) Micro-Neutralisation Assay

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