Messung der Knochenumgestaltung und Nachbildung der Tumor-Knochen-Mikroumgebung mit Calvaria-Kokultur und Histomorphometrie
March 14th, 2020
Die Ex-vivo-Kultur von Knochenexplanten kann ein wertvolles Werkzeug für die Erforschung der Knochenphysiologie und die mögliche Bewertung von Medikamenten bei Knochenremodellierung und Knochenerkrankungen sein. Das vorgestellte Protokoll beschreibt die Vorbereitung und Kultur von Calvarias, die aus neugeborenen Mäuseschädeln isoliert sind, sowie deren Anwendungen.
Der Zweck dieses Verfahrens ist es, ein Ex-vivo-Modell zu haben, um Knochen-Remodeling zu bewerten und die Tumor-Knochen-Mikroumgebung mit Calvaria-Kultur oder Kokultur mit Krebszellen neu zu erstellen. Die meisten Calvaria-Techniken sind ein Organkultursystem, das Calvaria-Knochen von neonatalen Mäusen verwendet, um die Knochenumgestaltung zu bewerten. Sie können das therapeutische Potenzial verschiedener Moleküle testen oder sogar die Knochen-Tumor-Mikroumgebung nachbilden, wenn Sie Kokulturen mit Krebszellen verwenden.
All dies in einem einfachen und einfachen Test in kurzer Zeit und zu niedrigen Kosten. Das Ziel dieser Technik ist es, ein Werkzeug zu haben, um die Knochenregeneration in der Krebsknochen-Mikroumgebung zu bewerten, mit einem ex-vivo-Modell der Maus-Kalvari-Organkultur. Wählen Sie zuerst einen Mauswelpen aus und legen Sie ihn unter die Haube.
Wir verwenden Calvaria von fünf- bis sieben Tage alten Mauswelpen. Nehmen Sie den Kopf mit der Spritze, schneiden Sie die Haut, und löschen Sie die Kopfhaut genug, um die Calvaria zu sezieren. Identifizieren Sie die Nähte des Schädels, sagittal, koronal, und Lambdoiden.
Machen Sie einen geraden Schnitt entlang der Lambdoid Nähte, um etwa das Niveau des Auges. Schneiden Sie auf jeder Seite, von den Lambdoid Nähte in Richtung der koronaren Naht. Machen Sie in 45 Winkel einen weiteren Schnitt, um das Ende des Schnitts mit dem Schnitt des vorderen Fontanels zu verbinden.
Es ist äußerst wichtig, die Schädelnähte, sagittale, frontale, koronare, lambdoide zu definieren, um die richtige Gewebeaufnahme und Histologieanalyse zu gewährleisten. Mit feinen Spitzenzange, entfernen Sie die Calvaria, und legen Sie es auf eine Petri schale Abdeckung. Mit einem Skalpell, machen Sie einen geraden Schnitt aus dem hinteren Fontanel entlang der sagittalen Naht durch die koronare Naht.
Es werden zwei Hemicalvarien erhalten. Nehmen Sie jede Calvaria mit den Zangen auf und legen Sie sie in eine neue Petrischale mit PBS. Für Kultur, legen Sie die Hemavaria in eine 24-Well-Gewebekulturplatte, die einen Milliliter Medien enthält, und inkubieren für 24 Stunden bei 37 Grad.
Wir können auch primäre Kalvarialkulturen verwenden, um die Tumor-Knochen-Mikroumgebung für die Knochenresorption zu reproduzieren. Dazu kokulturieren wir Calvarien mit Krebszellen oder mit konditionierten Medien aus Krebszellen. Entfernen Sie 24 Stunden später das Medium und ersetzen Sie es durch Medien, die die Behandlung enthalten, die Sie testen möchten.
Wenn Sie Krebszellen und Knochenwechselwirkungen bewerten oder die Tumor-Knochen-Mikroumgebung nachbilden möchten, übergeben Sie die Calvaria an eine niedrige zelluläre Anbauplatte, um die Anhaftung der Krebszellen an die Platte zu vermeiden. Versuchen Sie die Krebszellen, zählen Sie sie, und legen Sie sie sorgfältig an der Spitze der Hämicalvaria. Sie können auch bedingte Medien aus Krebszellen verwenden und es verwenden, um die Hämicalvaria zu inkubieren.
Sechs bis sieben Tage bei 37 Grad bei fünf Prozent CO2 inkubieren. Wechseln Sie am dritten Tag die Medien und brüten Sie weiter. Die Anzahl der Zellen, die in der Kokultur verwendet werden, hängt von der Krebszelllinie ab.
Sie müssen zunächst die Anzahl der Zellen optimieren, die benötigt werden, um eine Antwort in der ersten zu induzieren. Nach der Kultur durchlaufen die Calvarien einen Prozess der Fixierung, Entkalkung und Paraffin-eingebettet. Darüber hinaus werden die Gewebe in einem Mikrotom geschnitten, gebeizt, und histomorphometrische Analysen werden durchgeführt.
Die Einbeziehung der Calvaria kann schwierig sein. Um sicherzustellen, dass das Gewebe während der Aufnahme geschützt ist, können Sie das Gewebe zwischen Schwämme legen oder ein Tissuepapier oder anderes absorbierendes Papier verwenden, bevor Sie es in die Kassette legen. Für die Gewebeverarbeitung die Hämicalvaria in Tissuepapier wickeln.
Legen Sie es dann in eine Einbettkassette und fixieren Sie sie in einem neutralen Puffer in Formalin für 24 Stunden bei vier Grad. Um die Calvaria zu entkalken, legen Sie die Kassette 48 Stunden lang bei vier Grad in eine 10%EDTA. Verarbeiten Sie die Gewebekassetten mit der Hämicalvaria in einem automatischen Gewebeprozessor.
Folgen Sie einem regelmäßigen Tag Rotationszyklus, dann in Paraffin enthalten. Zum Schneiden vier mikrotische Abschnitte mit einem Mikrotom schneiden, die Abschnitte auf Glasmikroskop-Dias montieren und mit Hämatoxylin, Eosin, färben. Die Histologie-Analyse wurde verwendet, um die Knochenoberfläche und die Knochenumgestaltungsbereiche quantitativ zu analysieren.
Die Bilder der Calvaria an den sieben Tagen wurden mit der Bildgebungssoftware analysiert. Definieren Sie für die quantitative Bewertung zunächst den Bereich für die Analyse. Schauen Sie in den Abschnitten auf der Telopa, wo vier X, um die Ausrichtung und die Nähte zu identifizieren.
Definieren Sie die koronare Naht, und identifizieren Sie die lange Knochenoberfläche auf der einen Seite und dann die kurze Oberfläche auf der anderen Seite. Unter der 40X Vergrößerung, identifizieren Sie die koronare Naht und bewegen Sie zwei oder drei optische Felder weg von der Naht, entlang der langen Oberfläche. Erfassen Sie das Bild dieses Bereichs zur Analyse.
Sie können Bilder-Software verwenden, um die strukturelle Integrität des Knochens zu analysieren. Quantitative histomorphometrische Analysen für die Dicke und den Knochenbereich der Hämicalvaria können durchgeführt werden. Die richtige Calvaria-Analyse hängt von einer guten Einbettung und der richtigen Ausrichtung für konsistente histologische Ergebnisse ab.
Achten Sie darauf, mindestens drei Calvaria pro experimenteller Bedingung zu verwenden. Hier können wir die Struktur des Knochens sehen. In Orange wird der Knochen beobachtet.
Wir können auch das Vorhandensein des Periost, Ostozyten, Endosteums und anderer Teile des Knochens sehen. In unserem Fall verwenden wir Insulin, um die Knochenumgestaltung zu erhöhen. Im Vergleich zu einer Kontrolle können wir eine signifikante Zunahme des Knochenbereichs feststellen.
Hier können wir den Effekt der MDA-MB-231-Zelllinie auf Modell-Calvaria sehen. Wir können im Vergleich zur Kontrolle sehen, dass das Vorhandensein von Krebszellen osteolytische Faktoren induzieren, die die Knochenzerstörung stimulieren. Wir verwendeten Calvaria-Modell, um Knochenregeneration und Krebszell-Knochen-Wechselwirkungen durch Kokulturen mit Krebszellen und Histologie zu messen.
Wir validieren unsere Daten auch nach quantitativer Echtzeit-PCR. Dieses Ex-vivo-Modell hat viele Vorteile, wie die dreidimensionale Organisation und die zelluläre Vielfalt des Knochens erhalten bleiben, und die experimentellen Bedingungen können kontrolliert werden. Außerdem ist das Modell einfach, Sie können Ergebnisse in kurzer Zeit sehen, und es ist kostengünstig.
Und es kann mit anderen Techniken kombiniert werden, wie quantitative Echtzeit-PCR, Mikroskopie und Mikro-CT.
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Überblick
Dieser Artikel stellt ein Protokoll für die Ex-vivo-Kultur von Calvarien von neugeborenen Mäusen vor, das darauf abzielt, die Knochenphysiologie zu untersuchen und die Auswirkungen von Medikamenten auf die Knochenumbildung zu bewerten. Die Technik ermöglicht die Rekreation der Tumor-Knochen-Mikroumgebung.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Knochenphysiologie
- Knochenremodellierung
- Krebsbiologie
Hintergrund
- Knochenexplantate können kultiviert werden, um physiologische Prozesse zu untersuchen.
- Calvarien von neugeborenen Mäusen dienen als Modell für Knochenstudien.
- Die Ko-Kultur mit Krebszellen kann die Tumor-Knochen-Mikroumgebung nachahmen.
- Diese Methode ist kostengünstig und unkompliziert.
Zweck der Studie
- Um die Knochenumbildung in einem Ex-vivo-Modell zu bewerten.
- Um das therapeutische Potenzial verschiedener Moleküle zu bewerten.
- Um die Knochen-Tumor-Mikroumgebung nachzubilden.
Verwendete Methoden
- Isolierung von Calvarien von neugeborenen Mäusen.
- Ex-vivo-Kulturtechniken für Knochenexplantate.
- Ko-Kultursysteme mit Krebszellen.
- Bewertung der Knochenregeneration und der Wirkung von Medikamenten.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Kultur von Calvarien zur Untersuchung der Knochenumbildung.
- Fähigkeit, therapeutische Wirkstoffe in einer kontrollierten Umgebung zu testen.
- Nachbildung der Tumor-Knochen-Mikroumgebung demonstriert.
- Methode als effizient und kostengünstig erwiesen.
Schlussfolgerungen
- Die Ex-vivo-Calvarienkultur ist ein wertvolles Werkzeug für die Knochenforschung.
- Sie erleichtert die Untersuchung der Auswirkungen von Medikamenten auf die Knochenphysiologie.
- Ko-Kultursysteme verbessern das Verständnis der Krebsinteraktionen mit dem Knochen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
This ex vivo calvaria model provides a physiologically relevant system for evaluating bone remodeling dynamics and tumor-bone interactions in a controlled, reproducible format. It enables early-stage mechanistic de-risking of therapeutic candidates targeting bone metastasis or osteoporosis by preserving native tissue architecture and cellular diversity. The assay supports predictive confidence in lead identification by quantifying anabolic and catabolic bone responses under defined conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses on bone formation and resorption pathways using insulin or cancer cell co-culture as modulators.
- Operational Value: Enables functional target validation by measuring bone area changes in response to osteolytic or osteoactive agents.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by distinguishing compounds that stimulate versus inhibit bone remodeling in a disease-relevant system.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantitative histomorphometric outputs for bone surface and remodeling area after fixation, sectioning, and staining.
- Reproducibility: Requires a minimum of three biological replicates per condition to ensure consistent histological analysis and data reliability.
- Scalability: Compatible with downstream analytics such as qPCR, microscopy, and micro-CT for multi-parametric validation of bone-tumor interactions.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models cancer-induced bone resorption using MDA-MB-231 cells or conditioned medium to recapitulate osteolytic microenvironment.
- Translational Continuity: Bridges in vitro findings to in vivo relevance by maintaining 3D tissue organization and cellular diversity of neonatal calvaria.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether test compounds modulate bone remodeling via direct effects on osteoblasts/osteoclasts or through cancer-mediated signaling.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, particularly for bone-modulating agents and anticancer agents with skeletal effects.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on Wnt, RANKL, or PTHrP pathways by quantifying bone formation/resorption in response to pathway modulators.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs on bone area and structural integrity suitable for hit-to-lead progression.
- Analytics: Enables statistical comparison of bone thickness and area across conditions using imaging software and histomorphometry.
- Translational Research: Connects to preclinical work by modeling human-relevant tumor-bone interactions in a murine ex vivo system.
- Enterprise Reuse: Serves as a reusable platform for evaluating diverse compounds, including small molecules, biologics, or conditioned media, in bone pathophysiology.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into bone remodeling regulation and cancer-bone crosstalk with high physiological fidelity.
- Operational Value: Offers a low-cost, simple, and rapid ex vivo system with results achievable within one week.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing false positives in bone-active compound screening through disease-relevant modeling.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on validated effects on bone formation or resorption in a co-culture context.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine tissue dissection, histology processing, and histomorphometric analysis.
- Dependent on microtome, embedding cassettes, formalin, EDTA, and staining reagents for tissue preparation.
- Necessitates standardized orientation and sectioning protocols to ensure consistent histological and quantitative results.
- Adaptation to other model systems may require validation of tissue preservation and cellular viability.
- Practical limitations include tissue fragility during processing and the need for careful handling to avoid artifacts in bone surface quantification.
