Messung der Knochenumgestaltung und Nachbildung der Tumor-Knochen-Mikroumgebung mit Calvaria-Kokultur und Histomorphometrie
14. März 2020
Die Ex-vivo-Kultur von Knochenexplanten kann ein wertvolles Werkzeug für die Erforschung der Knochenphysiologie und die mögliche Bewertung von Medikamenten bei Knochenremodellierung und Knochenerkrankungen sein. Das vorgestellte Protokoll beschreibt die Vorbereitung und Kultur von Calvarias, die aus neugeborenen Mäuseschädeln isoliert sind, sowie deren Anwendungen.
Der Zweck dieses Verfahrens ist es, ein Ex-vivo-Modell zu haben, um Knochen-Remodeling zu bewerten und die Tumor-Knochen-Mikroumgebung mit Calvaria-Kultur oder Kokultur mit Krebszellen neu zu erstellen. Die meisten Calvaria-Techniken sind ein Organkultursystem, das Calvaria-Knochen von neonatalen Mäusen verwendet, um die Knochenumgestaltung zu bewerten. Sie können das therapeutische Potenzial verschiedener Moleküle testen oder sogar die Knochen-Tumor-Mikroumgebung nachbilden, wenn Sie Kokulturen mit Krebszellen verwenden.
All dies in einem einfachen und einfachen Test in kurzer Zeit und zu niedrigen Kosten. Das Ziel dieser Technik ist es, ein Werkzeug zu haben, um die Knochenregeneration in der Krebsknochen-Mikroumgebung zu bewerten, mit einem ex-vivo-Modell der Maus-Kalvari-Organkultur. Wählen Sie zuerst einen Mauswelpen aus und legen Sie ihn unter die Haube.
Wir verwenden Calvaria von fünf- bis sieben Tage alten Mauswelpen. Nehmen Sie den Kopf mit der Spritze, schneiden Sie die Haut, und löschen Sie die Kopfhaut genug, um die Calvaria zu sezieren. Identifizieren Sie die Nähte des Schädels, sagittal, koronal, und Lambdoiden.
Machen Sie einen geraden Schnitt entlang der Lambdoid Nähte, um etwa das Niveau des Auges. Schneiden Sie auf jeder Seite, von den Lambdoid Nähte in Richtung der koronaren Naht. Machen Sie in 45 Winkel einen weiteren Schnitt, um das Ende des Schnitts mit dem Schnitt des vorderen Fontanels zu verbinden.
Es ist äußerst wichtig, die Schädelnähte, sagittale, frontale, koronare, lambdoide zu definieren, um die richtige Gewebeaufnahme und Histologieanalyse zu gewährleisten. Mit feinen Spitzenzange, entfernen Sie die Calvaria, und legen Sie es auf eine Petri schale Abdeckung. Mit einem Skalpell, machen Sie einen geraden Schnitt aus dem hinteren Fontanel entlang der sagittalen Naht durch die koronare Naht.
Es werden zwei Hemicalvarien erhalten. Nehmen Sie jede Calvaria mit den Zangen auf und legen Sie sie in eine neue Petrischale mit PBS. Für Kultur, legen Sie die Hemavaria in eine 24-Well-Gewebekulturplatte, die einen Milliliter Medien enthält, und inkubieren für 24 Stunden bei 37 Grad.
Wir können auch primäre Kalvarialkulturen verwenden, um die Tumor-Knochen-Mikroumgebung für die Knochenresorption zu reproduzieren. Dazu kokulturieren wir Calvarien mit Krebszellen oder mit konditionierten Medien aus Krebszellen. Entfernen Sie 24 Stunden später das Medium und ersetzen Sie es durch Medien, die die Behandlung enthalten, die Sie testen möchten.
Wenn Sie Krebszellen und Knochenwechselwirkungen bewerten oder die Tumor-Knochen-Mikroumgebung nachbilden möchten, übergeben Sie die Calvaria an eine niedrige zelluläre Anbauplatte, um die Anhaftung der Krebszellen an die Platte zu vermeiden. Versuchen Sie die Krebszellen, zählen Sie sie, und legen Sie sie sorgfältig an der Spitze der Hämicalvaria. Sie können auch bedingte Medien aus Krebszellen verwenden und es verwenden, um die Hämicalvaria zu inkubieren.
Sechs bis sieben Tage bei 37 Grad bei fünf Prozent CO2 inkubieren. Wechseln Sie am dritten Tag die Medien und brüten Sie weiter. Die Anzahl der Zellen, die in der Kokultur verwendet werden, hängt von der Krebszelllinie ab.
Sie müssen zunächst die Anzahl der Zellen optimieren, die benötigt werden, um eine Antwort in der ersten zu induzieren. Nach der Kultur durchlaufen die Calvarien einen Prozess der Fixierung, Entkalkung und Paraffin-eingebettet. Darüber hinaus werden die Gewebe in einem Mikrotom geschnitten, gebeizt, und histomorphometrische Analysen werden durchgeführt.
Die Einbeziehung der Calvaria kann schwierig sein. Um sicherzustellen, dass das Gewebe während der Aufnahme geschützt ist, können Sie das Gewebe zwischen Schwämme legen oder ein Tissuepapier oder anderes absorbierendes Papier verwenden, bevor Sie es in die Kassette legen. Für die Gewebeverarbeitung die Hämicalvaria in Tissuepapier wickeln.
Legen Sie es dann in eine Einbettkassette und fixieren Sie sie in einem neutralen Puffer in Formalin für 24 Stunden bei vier Grad. Um die Calvaria zu entkalken, legen Sie die Kassette 48 Stunden lang bei vier Grad in eine 10%EDTA. Verarbeiten Sie die Gewebekassetten mit der Hämicalvaria in einem automatischen Gewebeprozessor.
Folgen Sie einem regelmäßigen Tag Rotationszyklus, dann in Paraffin enthalten. Zum Schneiden vier mikrotische Abschnitte mit einem Mikrotom schneiden, die Abschnitte auf Glasmikroskop-Dias montieren und mit Hämatoxylin, Eosin, färben. Die Histologie-Analyse wurde verwendet, um die Knochenoberfläche und die Knochenumgestaltungsbereiche quantitativ zu analysieren.
Die Bilder der Calvaria an den sieben Tagen wurden mit der Bildgebungssoftware analysiert. Definieren Sie für die quantitative Bewertung zunächst den Bereich für die Analyse. Schauen Sie in den Abschnitten auf der Telopa, wo vier X, um die Ausrichtung und die Nähte zu identifizieren.
Definieren Sie die koronare Naht, und identifizieren Sie die lange Knochenoberfläche auf der einen Seite und dann die kurze Oberfläche auf der anderen Seite. Unter der 40X Vergrößerung, identifizieren Sie die koronare Naht und bewegen Sie zwei oder drei optische Felder weg von der Naht, entlang der langen Oberfläche. Erfassen Sie das Bild dieses Bereichs zur Analyse.
Sie können Bilder-Software verwenden, um die strukturelle Integrität des Knochens zu analysieren. Quantitative histomorphometrische Analysen für die Dicke und den Knochenbereich der Hämicalvaria können durchgeführt werden. Die richtige Calvaria-Analyse hängt von einer guten Einbettung und der richtigen Ausrichtung für konsistente histologische Ergebnisse ab.
Achten Sie darauf, mindestens drei Calvaria pro experimenteller Bedingung zu verwenden. Hier können wir die Struktur des Knochens sehen. In Orange wird der Knochen beobachtet.
Wir können auch das Vorhandensein des Periost, Ostozyten, Endosteums und anderer Teile des Knochens sehen. In unserem Fall verwenden wir Insulin, um die Knochenumgestaltung zu erhöhen. Im Vergleich zu einer Kontrolle können wir eine signifikante Zunahme des Knochenbereichs feststellen.
Hier können wir den Effekt der MDA-MB-231-Zelllinie auf Modell-Calvaria sehen. Wir können im Vergleich zur Kontrolle sehen, dass das Vorhandensein von Krebszellen osteolytische Faktoren induzieren, die die Knochenzerstörung stimulieren. Wir verwendeten Calvaria-Modell, um Knochenregeneration und Krebszell-Knochen-Wechselwirkungen durch Kokulturen mit Krebszellen und Histologie zu messen.
Wir validieren unsere Daten auch nach quantitativer Echtzeit-PCR. Dieses Ex-vivo-Modell hat viele Vorteile, wie die dreidimensionale Organisation und die zelluläre Vielfalt des Knochens erhalten bleiben, und die experimentellen Bedingungen können kontrolliert werden. Außerdem ist das Modell einfach, Sie können Ergebnisse in kurzer Zeit sehen, und es ist kostengünstig.
Und es kann mit anderen Techniken kombiniert werden, wie quantitative Echtzeit-PCR, Mikroskopie und Mikro-CT.
Sehen Sie sich das vollständige Transkript an und erhalten Sie Zugang zu Tausenden wissenschaftlicher Videos
Übersicht
Dieser Artikel stellt ein Protokoll für die Ex-vivo-Kultur von Schädelkalotten von neugeborenen Mäusen vor, das darauf abzielt, die Knochenphysiologie zu untersuchen und die Wirkung von Arzneimitteln auf die Knochenremodellierung zu bewerten. Die Technik ermöglicht die Rekonstitution des Tumor-Knochen-Mikromilieus.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Knochenphysiologie
- Knochenumbau
- Krebisbiologie
Hintergrund
- Knochenexplants können kultiviert werden, um physiologische Prozesse zu untersuchen.
- Die Schädelkalotte von neugeborenen Mäusen dient als Modell für Knochenuntersuchungen.
- Kokultur mit Krebszellen kann das Tumor-Knochen-Mikromilieu nachahmen.
- Diese Methode ist kostengünstig und einfach durchzuführen.
Zweck der Studie
- Um die Knochenremodelierung in einem ex vivo-Modell zu bewerten.
- Um das therapeutische Potenzial verschiedener Moleküle zu beurteilen.
- Um die Knochen-Tumor-Mikroumgebung nachzubilden.
Verwendete Methoden
- Isolierung von Schädelkalotten aus neugeborenen Mäusen.
- Kultivierungstechniken für Knochenexplants ex vivo.
- Kokultursysteme mit Krebszellen.
- Beurteilung der Knochenregeneration und Wirkstoffeffekte.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Kultivierung von Schädelkalotten zur Untersuchung der Knochenremodellierung.
- Möglichkeit zur Testung therapeutischer Wirkstoffe in einem kontrollierten Umfeld.
- Rekapitulation des Tumor-Knochen-Mikromilieus nachgewiesen.
- Methode erwies sich als effizient und kostengünstig.
Schlussfolgerungen
- Die ex vivo-Kalottenkultur ist ein wertvolles Werkzeug für die Knochenforschung.
- Sie ermöglicht die Untersuchung der Wirkung von Arzneimitteln auf die Knochenphysiologie.
- Ko-Kultursysteme vertiefen das Verständnis der Wechselwirkungen von Krebs mit dem Knochen.
Häufig gestellte Fragen
Ausführliche Bedeutung für die Industrie
Dieses ex vivo-Kalvarienmodell bietet ein physiologisch relevantes System zur Untersuchung der Dynamik der Knochenremodellierung und der Wechselwirkungen zwischen Tumor und Knochen in einem kontrollierten, reproduzierbaren Format. Es ermöglicht eine frühzeitige, mechanistische Risikominderung bei der Entwicklung therapeutischer Wirkstoffkandidaten, die auf Knochenmetastasen oder Osteoporose abzielen, indem die native Gewebearchitektur und zelluläre Diversität erhalten bleiben. Der Assay erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Identifizierung führender Substanzen, indem anabole und katabole Knochenreaktionen unter definierten Bedingungen quantifiziert werden.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Untersucht therapeutische Hypothesen zu Knochenbildungs- und -resorptionswegen unter Verwendung von Insulin oder Krebszell-Kokulturen als Modulatoren.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die funktionelle Zielvalidierung durch Messung von Veränderungen der Knochenfläche als Reaktion auf osteolytische oder osteoaktive Wirkstoffe.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Portfolio-Priorisierung, indem Substanzen unterschieden werden, die die Knochenremodellierung in einem krankheitsrelevanten System stimulieren bzw. hemmen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Erzeugt standardisierte, quantitative histomorphometrische Ausgaben für die Knochenoberfläche und den Remodeling-Bereich nach Fixierung, Einbettung, Schnitt und Färbung.
- Reproduzierbarkeit: Erfordert mindestens drei biologische Wiederholungen pro Bedingung, um eine konsistente histologische Analyse und Datenzuverlässigkeit sicherzustellen.
- Skalierbarkeit: Kompatibel mit nachgeschalteten Analysen wie qPCR, Mikroskopie und Mikro-CT zur multiparametrischen Validierung von Knochen-Tumor-Interaktionen.
Translationale und präklinische Forschung
- Klinische Relevanz: Modelliert die krebserzeugte Knochenresorption unter Verwendung von MDA-MB-231-Zellen oder konditioniertem Medium, um das osteolytische Mikromilieu nachzubilden.
- Translationale Kontinuität: Verbindet in-vitro-Ergebnisse mit in-vivo-Relevanz, indem die dreidimensionale Gewebestruktur und die zelluläre Diversität des neonatalen Schädeldaches erhalten bleibt.
- Mechanistische Ent风险bewertung: Klärt, ob Testsubstanzen die Knochenremodellierung durch direkte Wirkung auf Osteoblasten/Osteoklasten oder über krebsvermittelte Signalwege modulieren.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in die Entdeckungskette von der Target-Validierung bis zur Lead-Optimierung ein, insbesondere für knochenmodulierende Wirkstoffe und Antikrebsmittel mit skelettalen Wirkungen.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung bezüglich der Wnt-, RANKL- oder PTHrP-Signalwege durch Quantifizierung der Knochenbildung und -resorption als Reaktion auf Modulatoren dieser Signalwege.
- Screening: Liefert gebrauchsfertige, quantitative Ergebnisse zur Knochenfläche und strukturellen Integrität, die für die Weiterentwicklung von Hits zu Leitstrukturen geeignet sind.
- Analytik: Ermöglicht statistische Vergleiche der Knochendicke und -fläche unter verschiedenen Bedingungen mithilfe von Bildanalysesoftware und histomorphometrischen Verfahren.
- Translationale Forschung: Knüpft an präklinische Studien an, indem menschlich relevante Tumor-Knochen-Interaktionen in einem murinen ex-vivo-System modelliert werden.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Dient als wiederverwendbare Plattform zur Bewertung unterschiedlicher Substanzen, einschließlich niedermolekularer Verbindungen, Biopharmazeutika oder konditionierten Kulturmedien, in der Knochenpathophysiologie.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Liefert Einblicke in die Regulationsmechanismen der Knochenremodellierung und der Interaktion zwischen Krebs und Knochen mit hoher physiologischer Aussagekraft.
- Operativer Wert: Bietet ein kostengünstiges, einfaches und schnelles ex-vivo-System, bei dem Ergebnisse innerhalb einer Woche erzielt werden können.
- Strategischer Wert: Verbessert die Entscheidungsfindung hinsichtlich der Weiterentwicklung von Substanzen, indem falsch-positive Ergebnisse bei der Identifizierung knochenwirksamer Verbindungen durch krankheitsrelevante Modellierung reduziert werden.
- Portfolio-Implikation: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Kandidaten basierend auf validierten Effekten auf Knochenbildung oder -resorption in einem Kokultursystem.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der dissezierenden Bearbeitung muriner Gewebe, der histologischen Aufarbeitung und der histomorphometrischen Analyse.
- Benötigt einen Mikrotom, Einbettkassetten, Formalin, EDTA und Färbelösungen für die Gewebepräparation.
- Setzt standardisierte Protokolle für Orientierung und Schnittführung voraus, um konsistente histologische und quantitative Ergebnisse zu gewährleisten.
- Die Übertragung auf andere Modellsysteme kann eine Validierung der Gewebeerhaltung und Zellviabilität erfordern.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehören die Empfindlichkeit des Gewebes während der Aufarbeitung und die Notwendigkeit einer sorgfältigen Handhabung, um Artefakte bei der Quantifizierung von Knochenoberflächen zu vermeiden.
