Ein Echtzeit-Potenz-Assay für chimerantigene Antigen-Rezeptor-T-Zellen, die auf feste und hämatologische Krebszellen abzielen

XCELLigence Echtzeit-Zellanalyse ermöglicht es Ihnen, die Tötung von Krebszellen durch Immunzellen unter etikettenfreien Bedingungen und im Laufe mehrerer Tage quantitativ zu überwachen. Dieses System bietet einen vollständigen Zeitverlauf der Zielkrebszelltötung, der das gleichzeitige Screening einer großen Anzahl von Konstrukten, Effektorzelltypen oder Kombinationstherapien bei niedrigen Effektor-Ziel-Verhältnissen ermöglicht. Beginnen Sie mit der Aussaat von 1,5 mal 10 zu den sieben HEK293FT-Zellen im DMEM-Kulturmedium in einer 150-Milliliter-Zellkulturschale für eine nächtliche Inkubation bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid mit Feuchtigkeit.

Mischen Sie am nächsten Morgen 2,5 Milliliter Transfektionsverdünnungslösung, ergänzt durch fünf Mikrogramm lentivirale Vektorplasmid-DNA und 22,5 Mikrogramm lentivirale Verpackungsmischung mit 82,5 Mikroliter Transfektionsreagenz in 2,5 Milliliter Transfektionsverdünnungslösung. Nach einer 15-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur den Reaktionstropfen weise in die Schale der HEK293FT-Zellen übertragen und die Zellen für eine zweite Nachtinkubation in den Inkubator zurückbringen. Ersetzen Sie am nächsten Morgen den Überstand durch 19 Milliliter frisches DMEM-Kulturmedium und bringen Sie die Zellen über Nacht in den Inkubator zurück.

Sammeln Sie den Überstand in einem einzigen 50 Milliliter konischen Rohr für vier Grad Celsius Lagerung für die nächsten zwei Tage, bevor Sie das Lentivirus durch Zentrifugation am zweiten Morgen sedimentieren, um alle Zellen oder Schmutz aus der Lösung zu entfernen. Übertragen Sie alle bis auf etwa einen Milliliter des überstanden Lentivirus auf ein ultraklares Zentrifugenrohr zur Ultrazentrifugation. Nach der Ultrazentrifugation das Restvirus, das Überstand enthält, vorsichtig ansaugen, 100 Mikroliter DMEM vorsichtig in das Pellet geben und die Röhre 15 Minuten lang auf Eis legen.

Am Ende der Inkubation die Lösung sanft mischen und die Lentivirus-Lösung in vorgekühlte sterile Schläuche für die Lagerung bei minus 80 Grad Celsius aliquotieren. Dann bestimmen Sie den Titer des Lentivirus durch quantitative RT-PCR nach den Anweisungen des Herstellers. Für die Erzeugung und Expansion von CAR-T-Zellen aktivieren Sie ein bis zwei Mal 10 bis zu den sechs peripheren mononukleären Blutzellen in einem Milliliter CAR-T-Zellmedium mit einer gleichen Anzahl von CD3/CD28-beschichteten Mikroperlen in einem Brunnen einer 24-Well-Platte im Zellkultur-Inkubator für 24 Stunden.

Mischen Sie an den folgenden beiden Vormittagen einen Mikroliter Transduktionsverstärker mit den Zellen, gefolgt von der Zugabe von Lentivirus bei einer Vielzahl von Infektionen von fünf zu eins. Überwachen Sie das Wachstum der T-Zellen alle zwei bis drei Tage und fügen Sie bei Bedarf frisches CAR-T-Zellmedium hinzu, um die Zellen ein bis zwei mal 10 bis zu den sechs Zellen pro Milliliter Konzentration zu halten. Um die T-Zell-CAR-Expression durch Durchflusszytometrie zu erkennen, übertragen Sie dreimal 10 in das fünfte CAR und nicht transduzierte T-Zellen in einzelne 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhren.

Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und setzen Sie die Pellets in 200 Mikroliter FACS-Puffer, ergänzt mit 1%humanem Serum, wieder auf. Teilen Sie jede Zellprobe in 100 Mikroliter-Aliquots in einzelnen fünf Milliliter-Polystyrol-FACS-Röhren auf Eis auf. Nach fünf Minuten einen Mikroliter biotinylierter FAB2-Fragmente von Ziegenanti-Maus-FAB2 zu einem Röhrchen jedes Zelltyps und zwei Mikroliter PE-beschrifteter Anti-Tag-Antikörper an die andere Tube jedes Zelltyps mit gründlicher Durchmischung hinzufügen.

Nach 30 Minuten auf Eis die Zellen mit drei Millilitern frischem FACS-Puffer waschen und nach zentrifugieren der Überstand dekantieren. Setzen Sie die Pellets im verbleibenden Überstand wieder auf und fügen Sie zwei Mikroliter APC Anti-CD3 und zwei Mikroliter 7-AAD zu jedem Rohr hinzu. Fügen Sie einen Mikroliter Streptavidin mit PE-beschriftetem Streptavidin mit kurzer Mischung in das mit Anti-FAB2-Antikörper gebeizte Rohr hinzu und inkubieren Sie alle Rohre 30 Minuten lang auf Eis.

Analysieren Sie am Ende der Inkubation die Zellen durch Durchflusszytometrie gemäß Standardprotokollen, die die T-Zellen durch Vorwärtsstreuung und CD3-AAD-Expression gatingn. Für einen Echtzeit-Cytolyse-Potenztest fügen Sie 50 bis 100 Mikroliter Zielzellkulturmedium zu jedem Brunnen einer E-Platte hinzu und messen Sie die Hintergrundimpedanz in einem Zellanalysatorinstrument. Erkennen Sie die Zielkrebszellen von der Kulturplatte mit Trypsin.

Waschen Sie die Zellen in 15 Milliliter frisches Kulturmedium und Zentrifuge. Setzen Sie das Krebszellpellet in fünf Milliliter frischem Medium zum Zählen aus und passen Sie die Zelldichte an die entsprechende Zielzellkonzentration an. Fügen Sie die Zellen zu der entsprechenden Anzahl von Brunnen hinzu und lassen Sie die E-Platte für 30 Minuten bei Raumtemperatur, damit sich die Zellen gleichmäßig auf dem Boden der Brunnen absetzen können.

Legen Sie die Platte am Ende der Ausgleichsperiode in den Echtzeit-Zellanalysator und leiten Sie die Messung der Impedanz automatisch alle 15 Minuten über Nacht ein. Die Haftung und Proliferation der Zielzellen kann in Echtzeit nachverfolgt werden. Am nächsten Morgen den Effektor CAR verdünnen und T-Zellen auf die entsprechende Konzentration in einzelnen Rohren steuern und 50 bis 100 Mikroliter aus jedem Brunnen der E-Platte entfernen, so dass das Endvolumen in jedem Brunnen 100 Mikroliter beträgt.

Als nächstes säen Sie den Effektor und steuern T-Zellen in den entsprechenden Brunnen an den entsprechenden Effektor-Ziel-Verhältnissen in 100 Mikroliter Medium pro Bohrung. Anschließend die E-Platte 30 Minuten bei Raumtemperatur ausdemieren, bevor die Platte an das Zellanalysatorsystem zurückgegeben wird. Um die Wirksamkeit der T-Zelle zu messen, wurde die Tötung der Zielkrebszellen vermittelt, überwachen Sie die CAR-T-vermittelte Tötung 96 Stunden lang.

Etwa 50 % der CAR-T-Zellen, die positiv für anti-single-chain variable fragment antiantikörper,000, die die Expression von CAR in etwa 50% der T-Zellen angeben. In diesem repräsentativen Experiment wurde für alle Gruppen ein Verhältnis von 10 zu 1 Effektor zu Ziel verwendet. Nur Raji-Zellen und CD22-CAR T-Zellen behandelt Raji-Zellen zeigten signifikante Tötung im Vergleich zu der Kontrolle T Zelle nur und Mock CAR-T Zellgruppen.

In diesem Experiment waren nur die CD47-CAR-T-Zellen wirksam bei der Tötung der Bauchspeicheldrüsenkrebszellen. Darüber hinaus lag das Impedanzsignal der CD47-CAR-T-Zellen allein nur geringfügig über dem in den mittleren Brunnen gemessenen Zellindexsignal, was darauf hindeutet, dass das Impedanzsignal, das aus Suspensionszellen wie CAR-T-Zellen resultiert, minimal ist und nicht zum Gesamtimpedanzsignal beiträgt, wenn CAR-T-Zellen den Zielkrebszellen hinzugefügt werden. Insbesondere wurde beobachtet, dass die GITR-Kostimulierende Domäne bei der Verbesserung der Car-T-Zelltötung gegen epitheliale Wachstumsfaktor-Rezeptor-positive Zielzellen effektiver ist als ursprüngliche CAR-Konstrukte ohne die GITR-Domäne.

Das Medium aus E-Plattenbrunnen kann gesammelt werden, um das Zytokinprofil an Zeitpunkten entweder während oder nach dem Test entsprechend den Bedürfnissen des Experiments zu analysieren. Insgesamt hat xCELLigence die Wirksamkeit verschiedener Immuntherapien verbessert, die von bispezifischen T-Zell-Engagern und onkolytischen Viren bis hin zu Immun-Check-Point-Inhibitoren in Kombinationstherapien reichen.