Überwachung der neuronalen Überleben über längs-Fluoreszenz-Mikroskopie
19. Januar 2019
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zum Überleben auf eine einzelne Zelle Basis überwachen und Variablen, die deutlich Zelltod Vorhersagen zu identifizieren.
Dieses Protokoll ermöglicht es Forschern, das Überleben auf einzelzelliger Basis zu überwachen und Variablen zu identifizieren, die den Zelltod oder das Überleben signifikant vorhersagen. Herkömmliche Zytotoxizitätstests bewerten Populationen von Zellen und sind nicht in der Lage, einzelne Zellen zu diskriminieren. Die Längsmikroskopie ermöglicht die Zuordnung des Todeszeitpunkts für jede Zelle in einer Population.
Diese Technik eignet sich gut für die Bewertung neuer Therapien für neurodegenerative Erkrankungen und andere Erkrankungen. Diese Methode hat sich als von unschätzbarem Wert für die Erforschung von Krankheitsmechanismen bei neurodegenerativen Erkrankungen erwiesen und könnte mit gleicher Wirksamkeit auf andere Erkrankungen angewendet werden, bei denen der Zelltod von Interesse ist. Forscher können mit der Erreichung angemessener Transfezeffizienzohne übermäßige Toxizität kämpfen.
Das Üben mit der Mehrkanalpipetten und die Vertrautheit mit dem Protokoll sollte diese Schwierigkeiten im Laufe der Zeit verringern. Mikroskopie ist eine von Natur aus visuelle Methode. Daher kann die Technik leichter verstanden werden, indem man zusätzlich zum Lesen zuschaut.
Kombinieren Sie zunächst die entsprechende Menge an reduzierten Serummedien und Transfektionsreagenz in einem Rohr und reduzierte Serummedien und DNA in einem separaten Rohr. Inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Dann kombinieren Sie den Inhalt beider Rohre und inkubieren bei Raumtemperatur für 20 Minuten.
Verwenden Sie eine Mehrkanalpipetten und sterile Kunststofftröge, um die kortikalen Neuronen zweimal mit 100 Mikrolitern neuronalen Basalmedien pro Brunnen zu waschen. Und die konditionierten Medien und andere verbleibende Medien bei 37 Grad Celsius aufbewahren. Ersetzen Sie die NBM durch 100 Mikroliter zuvor vorbereitete NBKY-Lösung pro Brunnen.
Nach 20 Minuten fallen 50 Mikroliter des Transfektionsreagenzes und der DNA-Mischung in jeden Brunnen. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius für 20 Minuten. Spülen Sie die Zellen zweimal mit NBKY-Lösung.
Dann fügen Sie 100 Mikroliter konditionierte Medien und 100 Mikroliter NBC-Lösung in die Brunnen. Um mit der Bildgebung der Zellen zu beginnen, legen Sie die 96-Well-Platte auf ein Fluoreszenzmikroskop. Verwenden Sie eine für jede Platte eindeutige Treuhandmarke als Referenz für die zukünftige Ausrichtung, und speichern Sie ein Bild für zukünftige Referenzen.
Navigieren Sie dann zu Interessenbereichen und zeichnen ihre x- und y-Koordinaten relativ zur Markierung auf. Verwenden Sie eine für jede Platte eindeutige Treuhandmarke als Referenz für die zukünftige Ausrichtung, und speichern Sie ein Bild für zukünftige Referenzen. Konzentrieren Sie sich schließlich auf die transfizierten Zellen, die ein fluoreszierendes Etikett ausdrücken.
Nehmen Sie mehrere Bilder in regelmäßigen Abständen in den entsprechenden fluoreszierenden Kanälen auf. Um mit der Bildverarbeitung zu beginnen, doppelklicken Sie auf das Fidschi-Symbol. Klicken Sie dann auf das Bild unterund auf das Fidschi-Makro, um das Makro in Fidschi zu öffnen.
Passen Sie die Zeilen zwei bis sieben des Bildunterstrichs des Verarbeitungsmakros entsprechend dem Textprotokoll an. Klicken Sie dann auf die Nähte und dann auf raster-/sammlungsnähte. Passen Sie die Einstellungen in den Dropdownmenüs, den Typ und die Reihenfolge an, bis ein genau genähtes Bild erstellt wird.
Passen Sie Rastertyp- und Stichreihenfolgevariablen in den Zeilen acht und neun entsprechend dieser Auswahl an. Passen Sie dann Zeile 10 an, um die Anzahl der Bilder pro Bohrung anzugeben, und legen Sie die Option für die Hintergrundsubtraktion in Zeile 14 bei Bedarf auf true fest. Passen Sie Zeile 15 an, um den Rollenkugelradius entsprechend dem Textprotokoll festzulegen, und klicken Sie auf Ausführen.
Öffnen Sie schließlich die Ausgabebildstapel und identifizieren Sie die toten Neuronen manuell gemäß dem Textprotokoll. Zeichnen Sie die Daten in einer Tabellenkalkulationsdatei auf. Um eine statistische Analyse durchzuführen, doppelklicken Sie auf das Symbol für das Überleben.
R-Skript. Markieren Sie Zeile zwei, und klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen, um die Überlebensbibliothek zu laden. Ändern Sie dann den Pfad in Zeile 5, um die Eingabetabelle aufzurufen, und klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen.
Markieren Sie die Zeilen acht und neun, und klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen, um die Analyse der proportionalen Gefahren von Cox durchzuführen. Markieren Sie die Linien 12 bis 16 und 19 bis 24. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen, um das kumulative Sterberisiko und die Überlebensdaten als Kaplan-Meier-Kurve darzustellen.
In dieser Studie wurden kortikale Neuronen von Ratten vier Tage nach der Beschichtung mit einem Plasmid transfiziert, das für das fluoreszierende Protein M-Apfel kodiert. 24 Stunden nach der Transfektion wurden Neuronen alle 24 Stunden an 10 aufeinanderfolgenden Tagen durch Fluoreszenzmikroskopie abgebildet. Nach der Bildaufnahme wurden Die Bilder verarbeitet und sequenziell untersucht, um den Zelltod zu markieren.
Die Todeszeit für jede Zelle wurde durch Veränderungen der Fluoreszenz, Morphologie und Fragmentierung des Zellkörpers bestimmt. Die Analyse der Cox-Proportionalgefahren an den Überlebensdaten der mutierten Neuronen ergab ein Hazard Ratio von 2,2. Dieses Ergebnis deutete auf eine schnellere Sterblichkeitsrate in den mutierten Neuronen im Vergleich zur Wildtyppopulation hin.
Das Wichtigste, was Sie beim Versuch dieses Verfahrens beachten sollten, ist, sorgfältig zu pfeifen. Die Minimierung der Luftexposition und die Vermeidung von Blasen ist entscheidend für eine erfolgreiche Transfektion. Nach der Transfektion kann die Längsfluoreszenzmikroskopie verwendet werden, um verschiedene Faktoren zu verfolgen, die zum Zelltod beitragen können, einschließlich Proteinlokalisierung, Umsatz und Expressionsniveau, zusätzlich zum Zellüberleben.
Im Bereich der Neurodegeneration hat die Dynamik der Längsmikroskopie Aufschluss darüber geben, ob die Aggregation von krankheitsassoziierten Proteinen ein toxisches oder schützendes Ereignis darstellt. Keines dieser Reagenzien oder Instrumente ist gefährlich.
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Übersicht
Diese Studie stellt ein Protokoll zur Überwachung des Zellüberlebens auf Einzelzellevel vor, um Vorhersagefaktoren für Zelltod oder Überleben zu identifizieren. Mithilfe der longitudinalen Mikroskopie verfolgt die Methode einzelne kortikale Neuronen hinsichtlich Veränderungen ihrer Vitalität über die Zeit, insbesondere im Kontext neurodegenerativer Erkrankungen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Forschung zu neurodegenerativen Erkrankungen
Hintergrund
- Konventionelle zytotoxische Assays bewerten Zellpopulationen, können aber keine einzelnen Zellen unterscheiden.
- Die longitudinale Mikroskopie ermöglicht die Verfolgung des Überlebens und des Todes einzelner Zellen.
- Diese Methode ist besonders nützlich für die Untersuchung der Mechanismen der Neurodegeneration.
- Forscher stoßen bei Zellstudien häufig auf Herausforderungen hinsichtlich der Transfektionseffizienz.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines Protokolls zur Überwachung des Überlebens und des Tods neuronaler Zellen.
- Identifizierung von Variablen, die das Zellschicksal signifikant beeinflussen.
- Anwendung dieser Erkenntnisse auf potenzielle neue Therapien für neurodegenerative Erkrankungen.
Verwendete Methoden
- Verwendung von ZellkulturmMethoden mit kortikalen Neuronen.
- Transfektion der Neuronen mit einem fluoreszierenden Plasmid, um die Abbildung des Zelltods über einen Zeitraum von 10 Tagen zu ermöglichen.
- Erforderte sorgfältige Pipettier- und Inkubationsschritte, um eine erfolgreiche Transfektion sicherzustellen.
- Zu den analytischen Methoden gehörten die Cox-Regression nach dem proportionalen Hazard-Modell und die Erstellung von Kaplan-Meier-Überlebenskurven.
Hauptergebnisse
- Die Studie identifizierte ein Hazard-Ratio von 2,2, was auf eine höhere Sterberate bei mutierten Neuronen im Vergleich zum Wildtyp hinweist.
- Der Zelltod wurde anhand von zeitabhängigen Veränderungen in der Fluoreszenz und Morphologie bestimmt.
- Es wurden zudem Erkenntnisse über die Dynamik der Proteinaggregation und deren Auswirkungen auf neurodegenerative Erkrankungen gewonnen.
Schlussfolgerungen
- Dieses Protokoll ermöglicht eine detaillierte Analyse des Zelltods und liefert Erkenntnisse über neuronale Überlebensmechanismen.
- Die Ergebnisse haben bedeutende Auswirkungen für die Entwicklung von Therapien, die auf neurodegenerative Erkrankungen abzielen.
- Insgesamt verbessert die Methode das Verständnis zellulärer Reaktionen unter verschiedenen Bedingungen, bei denen der Zelltod eine entscheidende Rolle spielt.
Häufig gestellte Fragen
Aussagekräftige Relevanz für die Industrie
Die longitudinale Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht die Auflösung einzelner Zellen hinsichtlich des neuronalen Überlebens und behebt damit eine zentrale Einschränkung populationsbasierter Zytotoxizitätsassays in der Forschung zu neurodegenerativen Erkrankungen. Durch die Verfolgung einzelner Zellen über die Zeit unterstützt diese Methode die mechanistische Absicherung therapeutischer Hypothesen und erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung. Diese Fähigkeit verbessert die Portfolio-Priorisierung, indem sie pathogene Treiber von homöostatischen Reaktionen bei subzellulären Ereignissen wie Proteinaggregation oder Fehllokalisation unterscheidet.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen, indem subzelluläre Ereignisse mit zellulären Schicksalsentscheidungen verknüpft und kausale Rückschlüsse gezogen werden.
- Operationaler Wert: Bietet Einzelzell-Auflösung, um pathogene Treiber von zufälligen Phänomenen in neuronalen Populationen zu unterscheiden.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Schätzung des Hazard-Verhältnisses mittels Cox-Regression nach dem proportionalen Hazard-Modell, um Risikomodulatoren der Überlebenszeit zu quantifizieren.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt Ereigniszeitdaten für jede Zelle und ermöglicht dadurch eine quantitative Überlebensanalyse, die über Endpunkt-Vitalitätsmessungen hinausgeht.
- Operativer Wert: Standardisiert longitudinale Bildgebungsabläufe mittels Referenzmarkierung und automatischem Bildnähen für eine reproduzierbare Verfolgung in Mehrfach-Well-Platten.
- Eignung für Assays: Erzeugt verarbeitete Bildstacks, die für eine manuelle oder automatisierte Todesbewertung basierend auf Fluoreszenz, Morphologie und Fragmentierung geeignet sind.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Relevanz: Verbindet molekulare Störungen (z. B. Expression mutierter Proteine) mit Überlebensergebnissen in primären neuronalen Kulturen, die für die Krankheit relevant sind.
- Mechanistische Ent风险bewertung: Klärt, ob Proteinaggregation toxisch oder schützend ist, indem die Bildung von Punktstrukturen mit dem Zeitpunkt des Zelltods korreliert wird.
- Präklinische Kontinuität: Ermöglicht die longitudinale Beurteilung von Kandidaten-Modifikatoren in Modellen neurodegenerativer Erkrankungen, bevor eine Validierung in vivo erfolgt.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in die Entdeckungskette von der Target-Hypothesenprüfung bis hin zur Lead-Optimierung ein, insbesondere für Programme, die auf Neurodegeneration ausgerichtet sind und dynamische phänotypische Messungen erfordern.
- Entdeckungsbiochemie: Ermöglicht die Hypothesenprüfung der Wirkung von Genen oder Proteinen auf das Überleben von Neuronen unter Verwendung fluoreszenzmarkierter primärer Kulturen.
- Screening: Liefert quantitative, zeitlich aufgelöste Ergebnisse, die für die Modellierung des Überlebens und die Analyse vergleichender Bedingungen geeignet sind.
- Analytik: Erzeugt Überlebenszeitdaten, die mit der Cox-Regression proportionaler Gefahren und der Kaplan-Meier-Schätzung zur Quantifizierung der Effektgröße kompatibel sind.
- Translationale Forschung: Verbindet in vitro beobachtete Überlebensphänotypen mit Krankheitsmechanismen in primären kortikalen Neuronen, einem translationalen Modell für humane Neurodegeneration.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Bildgebungs- und Analyse-Pipeline für longitudinale Zellschicksalsstudien über mehrere neuronale oder gliale Systeme hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung, indem Mehrdeutigkeiten in den mechanistischen Zusammenhängen zwischen molekularen Ereignissen und Zelltod verringert werden.
- Operationaler Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit durch standardisierte Transfektion, Bildgebung und Bildverarbeitungsschritte, einschließlich fiduzieller Ausrichtung und Hintergrundsubtraktion.
- Strategischer Wert: Verbessert Go/No-Go-Entscheidungen, indem Effektgrößen-Schätzungen (z. B. Hazard-Ratio) statt binärer Vitalitätsausgänge bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung von Targets basierend auf quantifizierter Überlebensmodulation in für den Menschen relevanten neuronalen Kontexten.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der primären Neuronenkultur, der Optimierung der Transfektion sowie in der Fluoreszenzmikroskopie, um Toxizität zu minimieren und die Signalermittlung zu maximieren.
- Setzt eine stabile Transfektionseffizienz und Expression von fluoreszierenden Proteinen voraus, um ein zuverlässiges langfristiges Tracking einzelner Zellen zu ermöglichen.
- Erfordert standardisierte Bildaufnahmeintervalle und Verarbeitungsparameter (z. B. Reihenfolge des Stitchings, Hintergrundsubtraktion), um die Datenkonsistenz zwischen Wells und Platten sicherzustellen.
- Beinhaltet die manuelle Validierung von Zelltodentscheidungen anhand morphologischer und fluoreszenzbasierter Kriterien, wozu zur Skalierbarkeit Überprüfungen der Übereinstimmung zwischen verschiedenen Auswerter*innen notwendig sind.
- Eingeschränkt durch das Risiko von Phototoxizität bei häufiger Bildaufnahme, was eine Optimierung von Laserleistung, Belichtungszeit und Wellenlängenauswahl erforderlich macht.
Biopharma-Häufige Fragen
Chapters in this video
0:04
Title
1:06
Transfection of Rat Cortical Neurons
2:22
Imaging
3:09
Image Processing and Scoring Cell Death
4:35
Performing Cox Proportional Hazards Analysis and Visualizing Results
5:19
Results: Assessing Neuronal Survival on a Single-cell Basis
6:16
Conclusion
