Name: Eine einfache Migration/Invasion Workflow mit einer automatisierten Leben-Zelle-Imager (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Erfahren Sie eine integrierte Methode zur Untersuchung von Krebszellmigration und -invasion in Echtzeit mit automatisiertem Live-Zell-Imaging. Diese reproduzierbare Technik ermöglicht effiziente Studien zur Zellmobilität und Morphologie.

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Wir würden gerne unsere finanzielle Unterstützung durch die Bloomfield Group Foundation durch Hunter Medical Research Institute (Angestiegene 13-02) zu erkennen. X.Z stützt sich auf eine APA Stipendium der University of Newcastle und der HCRA Biomarker Flaggschiff Promotionsstipendium.

Hinweis: Zwei Zelllinien sollte gesondert behandelt werden. Die folgenden Verfahren sollten auf eine einzelne Zelle Zeile angewendet werden, wenn nicht angegeben.
1. Optimierung der Zelldichte vor Verwundung
<ol><li>Adhärente Zellen in T75 cm2 Gewebe Kulturflaschen auf ca. 80 % Kultur Zusammenfluss in Phenol-rot frei Dulbecco geändert Eagle Medium (DMEM) mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 200 mM L-Glutamin und 2 µg/mL Insulin bei 37 ° C mit 5 % CO2 (ergänzt "Standard Inkubationsbedingungen für die meisten Krebszelllinien, Kultur Formulierungen sind Zelle Zeile-abhängig).</li>
	<li>Entfernen der Nährmedien pipettieren Sie in einen Abfallbehälter. Pipettieren 2 mL vorgewärmten 0,1 % Trypsin-EDTA kurz Cell Monolayer und Pipettieren abzuspülen. Fügen Sie ein weiteres 2 mL 0,1 % Trypsin-EDTA und legen Sie die Flasche unter standard Inkubationsbedingungen bei 37 ° C für 5 min.</li>
	<li>Klopfen Sie leicht den Kolben um Loslösung der Zellen zu gewährleisten und dann 10 mL vorgewärmten Kulturmedien, die proteolytische Reaktion zu stoppen.</li>
	<li>Übertragen Sie die Zellsuspension in eine 15 mL Zentrifugenröhrchen und Spin-down bei 200 X g für 5 min bei Raumtemperatur (RT). Sorgfältig entfernen, des Überstands ohne Rühren die Zelle Pellet und erneut mit einem anderen 10 mL vorgewärmten Nährmedien.</li>
</ol>2. zählen Zelle mit einem automatisierten Zelle Zähler (oder zählen Methoden)
<ol><li>Verdünnte 200 µL resuspendierte Zellsuspension mit 800 µL 1 x Dulbeccos Phosphat gepuffert Kochsalzlösung (DPBS) in einer 1,5 mL Zentrifugenröhrchen.</li>
	<li>Der Zelle-Zähler beimessen Sie einen 60 µm Zelle Graf Sensor, halten Sie die ein/aus und Zusammenführen Sie die Spitze in der Zellsuspension. Lassen Sie langsam den Knebel bis die Zellsuspension erfolgreich in den Sensor gezogen wird. Zellkonzentration erscheint in Zellen/mL.</li>
	<li>Berechnen Sie die Anzahl von Zellen in der 10 mL Zellsuspension.</li>
</ol>(3) Cell Plating
<ol><li>Platte Zellen in einem Bereich von Zelldichten (40.000-90.000 Zellen/Na) in dreifacher Ausfertigung in einer 96-Well-Platte.</li>
	<li>
Legen Sie die Platte in den live-Cell-Imager, und planen Sie scannen alle 2 h für 24 h.
	<ol>
<li>Klicken Sie in der Software auf Zeitplan scannt der Aufgabenliste. Bestimmen Sie im Bereich Schublade Setup die Position der Platte, klicken Sie auf Add Schiff und wählen Sie den Teller. Im Bereich Scannen Setup wählen oder Scanmuster gemäss den experimentellen Platte-Einstellungen bearbeiten und Scan-Typ als Standardfestlegen.</li>
		<li>Rechtsklick auf der Zeitachse und wählen Sie Intervalle festgelegt. 2 h bei einem 24-h-Zeitplan Scannt jeden hinzufügen soll. Klicken Sie auf anwenden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. bestimmen Sie die optimale Zelle Aussaat Dichte für die Migration-Assay
<ol><li>StOp Scannen nach 24 h, Anwenden des Zusammenflusses Verarbeitung Analyse-Tool auf die HD-Phase Kontrast Bilder automatisch erfasste, und erzeugen eine Zelle Verbreitung Kurve gegen die Zeit.
	<ol>
<li>Bestimmen Sie 3-6 repräsentative Bilder und legen Sie sie in eine neue Bildersammlung.</li>
		<li>Eine richtige Maske als Verarbeitung Definitionzu bestimmen.</li>
		<li>Einen Analyse-Auftrag zu starten.</li>
		<li>Optimierte Zelldichte nach Zusammenfluss gegen die Zeit zu bestimmen (ca. 100 % Zusammenfluss innerhalb von 6-18 h je nachdem, wann die Migration-Assay beginnt). Hinweis: Zeit, die es braucht, um die Zellen zu Confluence wachsen variiert je nach der Aussaat Verdünnung.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(5) Tage 1 und 2: Vorbereitung auf die Migration und Invasion Assays
<ol><li>
An Tag1 Mantel der Platte für Invasion-Assay. Hinweis: ECM Gel sollte immer behandelt werden, auf Eis und mit Spitzen, die über Nacht in den Kühlschrank gelegt haben.<ol>
<li>ECM-Gel mit eiskalten Nährmedien bis 100 µg/mL zu verdünnen und 50 µL verdünnter ECM Gel/Medien in dafür vorgesehenen Vertiefungen hinzufügen.</li>
		<li>Ort der Platte am standard Inkubationsbedingungen Übernachtung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Am 2. Tag aspirieren Sie vorsichtig die überschüssige Medien. Zellen mit optimierter Zelldichten in 2 96-Well-Platten für die Migration-Assay (unlackiert) bezeichnet und die Invasion-Assay (beschichtet) in Triplicates nach Ziffern 1-3 am späten Nachmittag (in das aktuelle Protokoll, optimierte seeding dichten für Teller ZR75-1 und MDA-MB-231 waren 90.000/gut und 50.000/gut, beziehungsweise).</li>
	<li>Legen Sie über Nacht im standard Inkubationsbedingungen Platten.</li>
</ol>6. Tag 3: Wunde kratzen
<ol><li>Sprühen Sie und wischen Sie das Kratzen Werkzeug und 2 Boote mit 70 % Ethanol waschen, bevor diese in die Biosicherheit Schrank platziert. Füllen Sie das Waschen Boot 1 und 2 bzw. mit genau 45 mL steril (autoklaviert) destilliertes Wasser und 70 % Ethanol.</li>
	<li>Legen Sie für die Sterilisation kratzen Werkzeug Stimmstock (oben) auf Boot 1 und 2 für 5 min waschen.</li>
	<li>
Beginnen Sie mit der Migration-Assay-Platte.
	<ol>
<li>Bewegen Sie die Platte mit Zellen aus dem Inkubator und sicherstellen Sie, dass keine Brunnen trocken zur Beschädigung des Werkzeugs Kratzer zu vermeiden ist. Entfernen Sie die Abdeckung der Platte legen Sie in der Grundplatte Inhaber des Werkzeugs kratzen und legen Sie das Oberteil auf das Unterteil vorsichtig durch die Führung der Dübel. Drücken Sie und halten Sie den schwarzen Hebel, und inzwischen heben Sie vorsichtig den Stimmstock. Lücken in jede Vertiefung sind meist mit bloßem Auge und unter dem Mikroskop sichtbar.</li>
		<li>Schnell die Stifte im Wasser einweichen; Dies ist ausreichend zu reinigen das Kratzen Werkzeug vor die Invasion-Assay-Platte zu kratzen, wenn Platte Setup identisch ist. Andernfalls wiederholen Sie den Sterilisation mit sterilem destilliertem Wasser und dann mit 70 % igem Ethanol für 5 Minuten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Waschen Blätter der Platte 1 oder 2 Mal mit vorgewärmten Nährmedien, freistehende Zellen oder Zellen zu vermeiden Wiederanbringen zum Brunnen.</li>
	<li>Fügen Sie 100 µL der frischen warmen Medien in dafür vorgesehenen Vertiefungen mit oder ohne Behandlung.</li>
	<li>
Zusätzliche Schritte für Invasion Assay.
	<ol>
<li>Platzieren Sie die Invasion-Assay-Platte bei 4 ° C für 5 min zu equilibrate und aspirieren Sie sorgfältig die kalten Medien.</li>
		<li>ECM-Gel mit eiskalten Nährmedien bis 5 mg/mL zu verdünnen, 50 µL verdünnter ECM Gel in dafür vorgesehenen Vertiefungen hinzufügen und unter standard Inkubation für 30 min statt.</li>
		<li>Fügen Sie 100 µL der erwärmten Medien mit oder ohne Prüfung Verbindungen hinzu.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die Platte in live-Cell-Imager und lassen Sie es für 5 min. Wählen Sie Schiffstyp als Imagelock Platte equilibrate. Scan-Typ als Wunde kratzenfestlegen Sie, wählen Sie oder bearbeiten Sie Scan Pattern nach der experimentellen Platte-Setup (1 Bild/gut und breit-Modus) und planen Sie, 24-h wiederholen scannen alle 1-2 h 72 h bis die Wunden verheilt sind.</li>
	<li>Um das Kratzen Werkzeug zu reinigen, setzen die oberen Stimmstock in jedem der folgenden Lösungen (45 mL in Wasch-Boote) für 5 min.: 0,5 % Waschmittel 1 (siehe Tabelle der Materialien), 1 % Waschmittel 2 (siehe Tabelle der Materialien), sterilem destilliertem Wasser und 70 % Ethanol. Legen Sie das Kratzen Werkzeug wieder auf die Bodenplatte und Store in einer staubfreien Umgebung.</li>
</ol>7. die Datenanalyse
<ol><li>Scannen der dafür vorgesehenen Platte, nachdem die Wunden verheilt sind, indem die experimentelle Platte auf die Schublade Setup auswählen und auf Entfernen Schiffzu stoppen.</li>
	<li>Sammeln Sie 3 bis 6 repräsentative Bilder umfassen eine Reihe von soliden Prozentsätze, einschließlich Bilder rechts, nachdem die Wunde erfolgter Schließung gewickelt um 10 % und 50 %.</li>
	<li>Verwenden Sie Segmentierung, Bereinigung und Filter um festzustellen, eine ordnungsgemäße Verarbeitung Definition entsprechenden Scratch Wunde Maske und Confluence Maskeanwenden. Verwenden Sie Vorschau Strom/All , um die Genauigkeit der Masken anzuzeigen.</li>
	<li>Starten Sie die Analyse-Auftrag.</li>
	<li>Daten können für weitere Analysen exportiert oder innerhalb der Software analysiert werden. Drei Kennzahlen der Software können verwendet werden, um HD-Phasenbilder bewerten: Wunde Breite (µm), Wunde Zusammenfluss (%) und relative Wunde Dichte (%). Vergleiche werden im folgenden Abschnitt besprochen.</li>
</ol>

<ol><li>Graham, C. H., Lala, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+placental+invasion+of+the+uterus+and+their+control%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of placental invasion of the uterus and their control.</a> Biochemistry and Cell Biology. 70, 867-874 (1992).</li>
<li>Affolter, M., Zeller, R., Caussinus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+remodelling+through+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tissue remodelling through branching morphogenesis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 831-842 (2009).</li>
<li>Brugues, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forces+driving+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Physics%22%5BJournal%5D)">Forces driving epithelial wound healing.</a> Nature Physics. 10, 683-690 (2014).</li>
<li>Weigelt, B., Peterse, J. L., van't Veer, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+metastasis%3A+markers+and+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Breast cancer metastasis: markers and models.</a> Nature Reviews Cancer. 5, 591-602 (2005).</li>
<li>Breast Cancer: Estimated Incidence, Mortality and Prevalence Worldwide in 2012. GLOBOCAN. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://globocan.iarc.fr/Pages/fact_sheets_cancer.aspx">http://globocan.iarc.fr/Pages/fact_sheets_cancer.aspx</a> (2012).</li>
<li>Kalluri, R., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basics+of+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The basics of epithelial-mesenchymal transition.</a> Journal of Clinical Investigation. 119, 1420-1428 (2009).</li>
<li>Scully, O. J., Bay, B. H., Yip, G., Yu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Genomics+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Breast cancer metastasis.</a> Cancer Genomics Proteomics. 9, 311-320 (2012).</li>
<li>Kramer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cell+migration+and+invasion+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FReviews+in+Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">In vitro cell migration and invasion assays.</a> Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 752, 10-24 (2013).</li>
<li>Holliday, D. L., Speirs, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choosing+the+right+cell+line+for+breast+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Choosing the right cell line for breast cancer research.</a> Breast Cancer Research. 13, 215(2011).</li>
<li>Clark, A. G., Vignjevic, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modes+of+cancer+cell+invasion+and+the+role+of+the+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Modes of cancer cell invasion and the role of the microenvironment.</a> Current Opinion in Cell Biology. 36, 13-22 (2015).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Migration und Invasion sind wichtige Parameter für die Mobilität von Krebszellen zu beurteilen. Mithilfe von 96-poligen Scratch Tool ist es möglich, Wundheilung Assays in 2D und 3D gleichzeitig durchzuführen. Automatisches Scannen zu erleichtern, bietet eine stabile Zelle Kultur Umgebung mit minimaler Unterbrechung der Scratch Test durchgeführt mit dem 96-poligen Scratch Tool bietet neben konsequenten kratzen Wunden, ermöglicht Experimente, die robuster sind und reproduzierbar sind. 96-Well-Plattenformat bietet zusätzlic...

Zelle Migration und Invasion sind wichtige biologische Prozesse, die normale Funktionen im menschlichen Körper, wie z. B. Wundverschluss, Invasion der Plazenta in der Gebärmutter und Brustdrüse Morphogenese1,2,3zu ermöglichen. Der menschliche Körper hat präzise und strenge Kontrolle dieser biologischen Ereignisse; Es gibt jedoch einige Ausnahmen. Bösartige Tumore können zum Beispiel dieses Sicherheitsmerkmal zu entgehen, weisen abnorme Proliferation und dringen in benachbarte Gewebe, die Metastasen genannt wird. Metastasierung ist die Hauptursache von Krebs-in Verbindung stehenden Sterblichkeit4.
Brustkrebs ist die am häufigsten diagnostizierte Krebserkrankung bei Frauen, und ist die zweithöchste Todesursache krebsbedingte Todesursache bei Frauen in Industrieländern weltweit5. Brustkrebs stammt aus Leitungen oder Läppchen, die aus einer oder mehreren Schichten von epithelialen Zellen bestehen. In der normalen Brust halten Epithelzellen untereinander und der Basalmembran durch Membranproteine wie z. B. E-Cadherin und Integrine6. Jedoch invasiven Brustkrebs-Zellen ihre Polarität und Zell-Zell-Adhäsion, verloren haben und klassisch epitheliale mesenchymale Transition (EMT) zu unterziehen und die Fähigkeit erlangen, bewegen. Nach Paravasation diese Zellen bewegen sich über die extrazelluläre Matrix (ECM) und das Blutgefäß oder das lymphatische System, dann folgten Intravasation und metastasiertem Wachstum7eingeben. Das Verständnis der Mechanismen, mit denen dies geschieht, ist von großer Bedeutung, da Metastasen die häufigste Ursache von Krebs-in Verbindung stehenden Todesfälle ist und eng mit Krebs verwandt ist Zelle Migration/Invasion. Um die Bewegung von Krebszellen zu visualisieren, sind Migration und Invasion Assays ideale Modelle für 2D und 3D Zellbewegung, bzw. studieren. Migration wird die Bewegung der Zellen direkt beurteilt, Invasion erfordert Interaktion mit der Mikroumgebung und die Fähigkeit, biologische Barrieren abbauen. Die zwei Prozesse sind nicht völlig unabhängig voneinander, wie Migration eine Anforderung der Invasion ist.
Verschiedene Methoden wurden entwickelt, um Migration und Invasion zu studieren. Wie von Kramer Et Al., Migration-Assays wie Wundheilung, überprüft Zaun und Mikro-Träger Assays generieren eine zellfreien Gegend um Zellen bezogen, Bewertung der Änderung des Bereichs zu ermöglichen; in der Erwägung, dass Transwell und Kapillare Assays auf die Anzahl der Zellen basieren, die auf einem Lockstoff8zu bewegen. Für Invasion Assays, eine ECM-Umgebung hat zum Beispiel mit ECM Gel oder Kollagen eingerichtet werden, und 3D Bewegung beurteilt werden kann, durch die Überwachung der Invasion Fläche, Distanz und Zelle zählt (z.B. Transwell Assay, Schnabeltiere Assay)8. Eine andere Art von Invasion Assay ist die Kombination der invasiven Zellen mit nicht-invasiven Zellen und beurteilen das Verhalten der invasiven Zellen (z. B. Sphäroid assays). Die oben genannten Methoden haben ihre vor und Nachteile und eine Weise, die leicht zugänglich, leicht zu wiederholen, und kombinieren Sie die Migration-Assay und Invasion-Assay in einem ähnlichen Workflow ist bevorzugt im experimentellen Design.
Dieses Protokoll beschreibt die Messung der Zelle Migration und Invasion mit einer live-Cell-Imager. Es ist eine Echtzeit-Zelle Überwachungssystem installiert in einem Inkubator Standardzelle Kultur. High-Definition-Bilder entsprechend den eingestellten Intervalle und Messungen durch die Anwendung geeigneter Masken der Zellen und fluoreszierende Vorgaben Scannen dauert. Das Modul der Migration/Invasion Assay umfasst mit einem 96-poligen Scratch Tool, welches zur Herstellung von homogenerer Kratzer Wunden auf eine Zelle monomolekularen Film in eine 96-Well-Platte eignet. Der Mechanismus basiert auf in-vitro-Wunde heilen Assays, Überwachung 2D Zellbewegung auf einem Kunststoff oder beschichtete Oberfläche. Invasion oder 3D Bewegung über eine zusätzliche ECM innerhalb der Kratzer, die Wunde kann auch beurteilt werden. Ein kurze Workflow ist in Abbildung 1dargestellt.

<table><tbody><tr><td>0,5 % Trypsin-EDTA-Lösung (10x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>30028-02</td><td>Auf 2x verdünnen in DPBS</td></tr><tr><td>Countess II FL Automatisierter Zellzähler</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td>Automatisierter Zellzähler</td></tr><tr><td>Detergent 1 (Alconox)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>242985</td><td>0,5 % Arbeitskonzentration</td></tr><tr><td>Detergent 2 (Virkon S)</td><td>VetProduct DIRECT</td><td></td><td>1 % Arbeitstemperatur Konzentration</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modifiziertes Eagle Medium, kein Phenolrot</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21063-045</td><td>Ergänzt mit 10% FBS, 200 mM L-Glutamin, 2 &mu; g/ml Insulin</td></tr><tr><td>ECM Gel (Matrigel)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6909</td><td>Wachstumsfaktor-reduziert, phenolrotfrei</td></tr><tr><td>Essen ImageLock 96-Well-Platte, flacher Boden</td><td>Essen</td><td>4379</td><td></td></tr><tr><td>EVE Objektträger BioTools</td><td></td><td>EVS-50</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Bovogen Biologicals</td><td>SFBS-F-500ml</td><td></td></tr><tr><td>IncuCyte 96-Well-Scratch-Wundzellinvasion Zubehör</td><td>Essen</td><td>4444</td><td>Inklusive CoolBox, 2x CoolSink</td></tr><tr><td>IncuCyte Zellmigrationskit</td><td>Essen</td><td>4493</td><td>Inklusive dem 96-Well-Pin-Block, 2x Waschschiffchen und der Software</td></tr><tr><td>IncuCyte ZOOM</td><td>Essen</td><td></td><td>Lebendzellanalysesystem</td></tr><tr><td>Insulinlösung human</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>19278-5ML</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutaminlösung (100x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25030-091</td><td></td></tr><tr><td>Gewebekulturkolben, 75 cm2 Wachstumsbereich</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658175</td><td></td></tr></tbody></table>

eine einfache migration/invasion workflow mit einer automatisierten leben-zelle-imager

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

Krebs Zelle Mobilität ist entscheidend für die Einleitung von Metastasen. Daher ist der Zellbewegung und -invasive Untersuchung von großer Bedeutung. Migration-Assays bieten grundlegende Einsicht der Zellbewegung 2D Ebene, während Invasion Assays imitiert in-vivo Krebs Zelle Dislodgment von der ursprünglichen Website und Invasion durch die extrazelluläre Matrix mehr physiologisch relevant sind. Das aktuelle Protokoll sieht einen einheitlichen Workflow für Migration und Invasion Assays. Zusammen mit der integrierten automatischen mikroskopische Kamera für HD-Bilder in Echtzeit und integrierte Analyse-Modul gibt es Forscher eine zeitsparende, einfache und reproduzierbare experimentelle Option. Dieses Protokoll enthält auch Ersetzungen für Verbrauchsmaterialien und alternativen Analysemethoden für Benutzer zur Auswahl.

Diese Migration/Invasion Assay basiert auf die heilende Wunde-Assay, wertet die Rate der Zellen in einem zellfreien Bereich durch die Kratzer 96-Pin-Werkzeug erstellt. Der Unterschied zwischen Migration und Invasion Assays sind, dass Migration Maßnahme Zellen verschieben auf die Gewebekultur behandelt Kunststoff Oberfläche und Invasion Maßnahmen Zellen bewegen über ECM Gel Proben.
Die Scratch Tool dient zur konsequenten kratzen ...

Das aktuelle Protokoll beschreibt eine integrierte Methode untersucht Krebs Zelle Migration und Invasion auf einer einzigen Plattform in Echtzeit und bietet eine leicht reproduzierbare und zeitsparende Option Zelle Mobilität und Morphologie.

Eine einfache Migration/Invasion Workflow mit einer automatisierten Leben-Zelle-Imager

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

Die Mobilität von Krebszellen ist entscheidend für die Einleitung von Metastasen. Daher ist die Untersuchung der Zellbewegung und der invasiven Kapazität von Tumorzellen von großem Interesse. Diese integrierte Methode zur Untersuchung der Migration und Invasion von Krebszellen auf einer einzigen Plattform in Echtzeit bietet eine leicht reproduzierbare und zeiteffiziente Option für das Studium der Zellmobilität und Pathologie.Diese Methode kann einen Einblick in die Invasion von Krebszellen durch die extrazelluläre Matrix geben und kann auf andere Zelltypen angewendet werden. Um eine optimale Kratzzeit zu erreichen, stellen Sie sicher, dass die Saatdichte optimiert wurde und verlängern Sie die Inkubationszeit nicht, sobald die Zellmonoschicht 100 Prozent Zusammenfluss erreicht hat. Um die optimale Anzahl der gesäten Zellen für einen Migrationstest zu bestimmen, legen Sie die Zellen in einer Reihe von Dichten in Dreifache in einer 96-Wandplatte.Platzieren Sie die Platte in den Live-Zellen-Imager, und wählen Sie Planscans aus der Aufgabenliste in der Imager-Software aus. Bestimmen Sie im Schubladen-Setup-Bereich die Positionen der Platte, und klicken Sie auf Behälter hinzufügen, um den Plattentyp auszuwählen. Wählen Oder bearbeiten Sie im Scan-Setup-Bereich das Scanmuster entsprechend dem experimentellen Plattenaufbau, und legen Sie den Scantyp als Standard fest.Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Zeitachse, und wählen Sie die festgelegten Intervalle aus. Legen Sie dann "Scans" für 24 Stunden alle'bis zwei Stunden fest, und klicken Sie auf Anwenden. Öffnen Sie nach 24 Stunden die Schublade, damit die Versuchsplatte ausgewählt werden kann, und klicken Sie auf Gefäß entfernen.Wählen Sie drei bis sechs repräsentative Bilder aus, und platzieren Sie sie in einer neuen Bildsammlung. Um eine ordnungsgemäße Verarbeitungsdefinition zu bestimmen, verwenden Sie Segmentierungsanpassung, Bereinigung und Filter, um eine geeignete Konfluenzmaske anzuwenden, und verwenden Sie vorschau aktuelles all', um die Genauigkeit der Masken anzuzeigen. Starten Sie den Analyseauftrag und bestimmen Sie eine optimierte Zelldichte gemäß einem ungefähren 100-prozentigen Zusammenfluss mit der Zeit innerhalb von sechs bis achtzehn Stunden, je nachdem, wann der Migrationstest beginnt.Wenden Sie dann das Analysetool für die Zusammenflussverarbeitung auf die hochauflösenden Phasenkontrastbilder an, die automatisch gesammelt werden, um eine Zellproliferationskurve gegen die Zeit zu generieren. Bevor Sie mit dem Test beginnen, beschichten Sie die Platte für den Invasionstest mit 50 Mikroliter extrazellulärem Matrixgel, verdünnt in eiskaltem Zellkulturmedium, auf eine Konzentration von 100 Mikrogramm pro Milliliter. Legen Sie dann die Platte über Nacht in einen Zellkultur-Inkubator.Am nächsten Nachmittag das überschüssige Medium sanft ansaugen und die Zellen in der optimierten Dichte in dreifacher Ausgliederung in die entsprechenden Brunnen der extrazellulären Matrix-beschichteten Platte und in eine zusätzliche unbeschichtete 96-Well-Platte plattieren. Dann legen Sie die Platten in den Zellkultur-Inkubator über Nacht. Legen Sie am nächsten Morgen die unbeschichtete Migrations-Assayplatte in den Grundplattenhalter des Kratzwerkzeugs und verwenden Sie die Führungsdübel, um die Oberseite des Halters vorsichtig auf die Basis zu legen.Halten Sie den schwarzen Hebel, während Sie den Stiftblock vorsichtig anheben, um die Kratzer zu machen. Die Kratzer in jedem Brunnen sollten mit bloßem Auge und unter dem Mikroskop sichtbar sein. Dann waschen Sie die Platte ein oder zwei Mal mit vorgewärmtem Kulturmedium, um abgetrennte Zellen oder Zellblätter zu entfernen.Für den Invasionstest kratzen Sie die beschichtete Platte, wie gerade gezeigt. Nachdem Sie abgetrennte Zellen und Blätter entfernt haben, verwenden Sie eine vorgekühlte Kühlbox, um die Platte fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius auszueinemn, bevor Sie das kalte Medium sorgfältig ansischen. Als nächstes 50 Mikroliter verdünntes extrazelluläres Matrixgel in die entsprechenden Brunnen geben und die Platte für dreißig Minuten in den Zellkultur-Inkubator legen.Blasen sind häufig bei der Arbeit mit extrazellulärem Matrixgel, aber sie können durch Diepirating 70 Prozent Ethanol eliminiert werden. Dann fügen Sie 100 Mikroliter frisches, warmes Medium, mit oder ohne Testverbindung, zu den entsprechenden Brunnen der Migrations- oder Invasions-Assay-Platte hinzu und legen Sie die Platte in die Live-Zell-Bildgebungsplattform. Um das Kratzwerkzeug zu reinigen, legen Sie den oberen Stiftblock in einzelne 45-Milliliter-Waschboote, die 5 Prozent Waschmittel eins, ein Prozent Waschmittel zwei, steriles destilliertes Wasser oder 70 Prozent Ethanol für fünf Minuten pro Wäsche enthalten, bevor Sie das Kratzwerkzeug wieder auf die Grundplatte legen, um es in einer staubfreien Umgebung zu lagern.Für die Abbildung der Wundtests, nachdem die Platte für fünf Minuten ausgeglichen werden konnte, wählen Sie den Gefäßtyp'als Bildprotokollebene aus, und legen Sie den Scantyp als Kratzwunde fest. Wählen oder bearbeiten Sie das Scanmuster entsprechend dem experimentellen Plattenaufbau und planen Sie 24 Stunden wiederholungsschnelles Scannen alle ein bis zwei Stunden für 72 Stunden, oder bis die Wunden wie gezeigt geheilt sind. Wenn alle Wunden verheilt sind, stoppen Sie den Scan und wählen Sie drei bis sechs repräsentative Bilder aus, die eine Reihe von Tonprozentsätzen umfassen, einschließlich Der Bilder direkt nach der Wunde, und den Wundverschluss um 10 und 50 Prozent.Um eine richtige Verarbeitungsdefinition zu bestimmen, wenden Sie eine geeignete Kratzer-Wundmaske und eine Zusammenflussmaske wie gezeigt an, und verwenden Sie vorschau aktuelles all', um die Genauigkeit der Masken anzuzeigen. Starten Sie dann den Analyseauftrag. Bei einem Migrationstest ist die Wundbreite der durchschnittliche Abstand zwischen den Zellblättern neben der Wunde.Der Wundzusammenfluss ist der Zusammenfluss innerhalb des verwundeten Bereichs. Der ideale anfängliche Wundzusammenfluss sollte nahe null Prozent liegen. Die relative Wunddichte und der Zusammenfluss der Wunde deuten auf die Geschwindigkeit der Zellen hin, die den Kratzer-Wundbereich einnehmen.Diese Daten überschneiden sich fast in diesen beiden repräsentativen Zelllinien. Verschiedene Zelllinien zeigen sehr unterschiedliche Wundheilungsfähigkeiten, was auf unterschiedliche Migrationsfähigkeiten zwischen den Zelllinien hinweist. Zum Beispiel werden Lamellipodie n. B. in dieser Brustadenokarzinom-Zelllinie an der Migrationsfront zu Beginn der Migration beobachtet, während diese Mucin-1-produzierende Brustkrebszelllinie keine Anzeichen einer Zellmigration gleichzeitig aufwies.Weiterhin war die relative Wunddichte der Brustadenokarzinomlinie nach 50 Stunden gesättigt, während sich die relative Wunddichte der Mucin-1-produzierenden Brustkrebszelllinie im Laufe der Zeit nicht änderte, was den hochinvasiven Phänotyp der Adenokarzinomzellen und die Nicht-Invasivität der Mucin 1-produzierenden Brustkrebszellen unterstreicht. Die Adenokarzinomzellen verhielten sich auch anders, während sie durch das extrazelluläre Matrixgel eindrangen, was eine längliche Morphologie mit führenden Vorsprüngen demonstrierte, und bei Migrationstests wurde ein Blödmachen an der Migrationsfront visualisiert. Denken Sie beim Beschichten daran, dass, wenn zu wenige Zellen gesät werden, sich der Kratzer nicht richtig bildet und wenn zu viele Zellen gesät werden, es eine Überbelegung geben wird.Nach diesem Verfahren können Track-Behandlungen hinzugefügt werden, so dass diese Methode für das Hochdurchsatz-Track-Screening angepasst werden kann. Diese Methode ermöglicht es Forschern, diese Assays auf einer einzigen Plattform durchzuführen, die einen hohen Durchsatz hat, und ermöglicht es Forschern, ihre Zellen in Echtzeit zu überwachen, anstatt in experimentellen Endpunkten. Die Zum Sterilisieren des Kratzwerkzeugs verwendeten Desinfektionsmittel können gefährlich sein.Stellen Sie sicher, dass Sie die Lösungen gemäß den entsprechenden Sicherheitsdatens asondern und die regulären Triggerlinien Ihrer Einrichtung sammeln und entsorgen.

a-simple-migrationinvasion-workflow-using-an-automated-live-cell

Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

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Zellulären Prozessen wie Zellmigration haben sich traditionell auf zweidimensionale, steifen Kunststoff-Oberflächen untersucht. Dieser Bericht beschreibt eine Technik zur direkten Visualisierung von Protein-Lokalisierung und Analyse von Protein-Dynamik in Zellen wandern in eine physiologisch relevante, dreidimensionale Matrix.

Live-Cell-Imaging von wandernden Zellen mit dem Ausdruck Fluoreszenz-markierten Proteinen in einer dreidimensionalen Matrix

Wir beschreiben eine Live-Cell-Imaging-Verfahren, das einen Einblick in die Dynamik Protein während der T-Zell-Aktivierung. Wir zeigen die kombinierte Nutzung des T-Zell-Ausbreitung Assay, konfokale Mikroskopie und Bildanalyse zu liefern quantitative Ergebnisse zu folgen Signalisierung Komplexbildung während T-Zell-Aktivierung.

Echtzeit-Live-Imaging von T-Zell-Signaling Complex Formation

Ein Verfahren zur Montage von Klebstoff und löslichen Gradienten in einer Mikroskopie Kammer für lebende Zellmigration Studien beschrieben. Die gebaute Umwelt verbindet Antifouling Oberflächen und Kleber Tracks mit Lösung Steigungen und ermöglicht somit ein, um die relative Bedeutung von Leitlinien Hinweise zu bestimmen.

Erstellen Adhesive und löslichen Farbverläufe for Imaging Cell Migration mit Fluoreszenz-Mikroskopie

Ein robustes Protokoll zum neuronalen Populationen von Time-Lapse Video-Mikroskopie, gefolgt von Post-Processing Software-basierte Überwachung wird beschrieben. Diese Methode stellt ein leistungsfähiges Werkzeug zur biologischen Ereignisse in einer ausgewählten Population während live-imaging-Experimente zu identifizieren.

Leben Sie Imaging, gefolgt von einzelligen Tracking Monitor Zellbiologie und die Linie Fortschreiten der mehrere neuronalen Populationen

Hier beschreiben wir eine Prozedur, um die Zelle Migration in Vitro mit einer automatisierten optischen Kamera Mikroskop zu testen. Der Scratch-Test hat verbreitet wo die Schließung von Grund auf für einen bestimmten Zeitraum gefolgt ist. Das optische Mikroskop ermöglicht eine zuverlässige und preiswerte Erfassung von Zellmigration.

Scratch-Test für die In-vitro- Prüfung der Zellwanderung mit einer automatisierten optischen Kamera optimiert

Randzone B Zellen (MZBs) reagieren auf die Kraft des Schubflusses Neuausrichtung ihrer Migrationspfad bis die Strömung. Dieses Protokoll zeigt, wie Sie erfassen und analysieren der Migration mit einem Fluidik-Einheit, Pumpe, Mikroskop-imaging-System und freie Software.

Analyse der Scherung strömungsinduzierte Migration der Murine Marginal Zone B-Zellen In Vitro

In dieser Studie wird ein Protokoll der Lebend-3D-Zell-Immunzytochemie vorgestellt, das auf eine pädiatrische diffuse Mittellinien-Gliomzelllinie angewendet wird, um die Expression von Proteinen auf der Plasmamembran während dynamischer Prozesse wie 3D-Zellinvasion und -migration in Echtzeit zu untersuchen.

Lebend-3D-Zell-Immunzytochemie-Assays des pädiatrischen diffusen Mittellinienglioms

Dieses Protokoll bietet eine Methode zur primären Isolierung von murinen T-Zellen und eine Zeitraffermikroskopie der T-Zellmigration unter spezifischen Umweltbedingungen mit quantitativer Analyse.

Echtzeit-In-vitro-Migrationsassay für primäre murine CD8+ T-Zellen

Erfahren Sie eine integrierte Methode zur Untersuchung von Krebszellmigration und -invasion in Echtzeit mit automatisiertem Live-Zell-Imaging. Diese reproduzierbare Technik ermöglicht effiziente Studien zur Zellmobilität und Morphologie.

Eine einfache Migration/Invasion Workflow mit einer automatisierten Leben-Zelle-Imager

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