Erweiterte Bildgebung der Lunge Homing menschlichen Lymphozyten in einem experimentellen In Vivo Modell der allergische Entzündung basierend auf Licht-Blatt Mikroskopie

Unsere Technik ermöglicht die präzise Abbildung von lungenakkumulierten menschlichen Immunzellen in in vivo entzündlichen Bedingungen und liefert spannende Einblicke in den Prozess der T-Zell-Lungenhoming. Dieses Protokoll unterstützt die translationale Forschung zur T-Zell-Lungenhoming und kann damit bei der Identifizierung neuer Ziele für eine optimierte Therapie von entzündlichen oder allergischen Lungenerkrankungen helfen. Insbesondere die Fähigkeit, den Einfluss von krankheitsspezifischen Immunzelleigenschaften, Lungengewebeorganisation und entzündlichem Milieu auf T-Zell-Lungenhoming zu berücksichtigen, macht diese Methode sehr vorteilhaft.

Insgesamt ist unsere Technik von hohem Wert für die immunologische Forschung auf dem Gebiet der chronisch entzündlichen Lungenerkrankungen, die oft durch eine überwältigende Gewebeansammlung aktivierter Immunzellen angetrieben werden. Nachdem Sie einen Mangel an Reaktion auf Zehenkniff in einer mindestens 16-Gramm- und sechs Wochen alten, betäubten C57-Schwarz-6J-Maus bestätigt haben, verwenden Sie ein Mikropipet, um langsam 10 Mikroliter frisch zubereitete Papainlösung einmal täglich für drei aufeinander folgende Tage in ein Nasenloch der Maus zu liefern. Am Tag nach der letzten Papain-Verabreichung Schicht 10 Milliliter Ficoll Medium unter menschlichem peripherem Blut von einem gesunden Freiwilligen vorverdünnt mit einem Eins bis zwei Verhältnis in PBS für Dichte Gradiententrennung durch Zentrifugation.

Übertragen Sie die periphere mononukleäre Blutzelle oder PBMC-Interphasenschicht in eine neue 50-Milliliter-Röhre und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation. Als nächstes führen Sie die magnetische Mikroperle-Isolierung von CD4-positiven Zellen gemäß dem Herstellerprotokoll durch. Wiederaussetzung der perlenisolierten CD4-positiven T-Zellen bei bis zu einem mal zehnmal bis siebten T-Zellen pro mindestens 500 Mikroliter PBS-Konzentration.

Beschriften Sie die Zellen mit einem geeigneten rotlichten erregbaren Zellproliferationsfarbstoff für 10 Minuten bei 37 Grad Celsius. Am Ende der Inkubation, halten Sie die Etikettierungsreaktion mit fünf Bänden RPMI Medium ergänzt mit 10%FBS für fünf Minuten auf Eis gefolgt von drei Wassin im Medium. Für die Adoptivübertragung der menschlichen CD4-positiven T-Zellen in papainexponierte Empfängermäuse die fluoreszierend beschrifteten T-Zellen auf ein mal 10 bis siebte Zelle pro Milliliter Konzentration in PBS wieder aufsetzen und 100 Mikroliter Zellen in eine Ein-Milliliter-Spritze laden, die mit einer 30-Spur-Nadel pro Empfängertier ausgestattet ist, und dann das gesamte Zellvolumen einer Spritze in die Schwanzvene eines mit Papain behandelten Tieres injizieren, das die Nadelspitze in der Vene für eine zusätzliche fünf Sekunden nach der Zellabgabe, um die Entladung der Zellsuspension zu verhindern.

Drei Stunden nach der Adoptivzellübertragung durchstechen Sie den rechten Ventrikel jeder eingeschläferten Maus mit einer 21-Spur-Kanüle, die mit einem Katheter verbunden ist, und machen Sie einen Schnitt in der linken Herzkammer. Durchdringen Sie die Lunge langsam mit 20 Millilitern eiskaltem PBS, ergänzt durch fünf Millimolar EDTA, gefolgt von zwei Millilitern eiskaltem 4%Paraformaldehyd. Wenn alle Fixierungsmittel durch das Gewebe gespült wurde, entfernen Sie die Speicheldrüsen und schneiden Sie den Sternhyoidmuskel, damit eine Zange unter die Luftröhre geschoben werden kann, um das Luftrohrgewebe freizulegen.

Führen Sie eine erste Punktion der freiliegenden Luftröhre mit einer 30-Spur-Nadel durch, bevor Sie die Nadel durch einen stumpfen 30-Spur-Katheter ersetzen, um weitere Schäden am Gewebe zu verhindern. Verwenden Sie einen Nadelhalter, um die Kreuzung zwischen dem eingelegten Katheter und der Luftröhre zu versiegeln, und füllen Sie die Atemwege vorsichtig mit ca. 37 Grad Celsius 0,75%Agarose bis zur vollständigen Entfaltung der Lunge. Eine enge Verbindung zwischen Katheter und Luftröhre ist entscheidend für die Erweiterung der Lunge auf ihre physiologische Größe und die Aufrechterhaltung der Gewebearchitektur für die Bildgebung.

Wenn die Agarose vollständig verfestigt ist, entfernen Sie den Katheter und übertragen Sie die Lunge vorsichtig in ein abgedunkeltes, zwei-Milliliter-Rohr, das mit 4%paraformaldehdye gefüllt ist. Als nächstes dehydrieren Sie das Gewebe mit sequenziellen Ethanol-Inkubationen unter kontinuierlicher Rotation bei 31 Rotationen pro Minute und vier Grad Celsius, wie für vier Stunden pro Inkubation angegeben. Nach vollständiger Austrocknung die Probe in Ethyl-Cinnamat für eine nächtliche Inkubation bei Raumtemperatur übertragen, bis das Gewebe lichtdurchlässig erscheint.

Für eine Lichtbogen-Fluoreszenzmikroskopie verwenden Sie einen kleinen Tropfen organischen lösungsmittelstabilen Klebers, um die Lunge an den Probenhalter des Mikroskops zu kleben und den Lungenlappen in aufrechter Position auf den Halter zu setzen. Legen Sie den Probenhalter in seine Kammer und wählen Sie die entsprechenden Laser für das Experiment in der Instrumentensoftware aus. Verwenden Sie als Nächstes die Schieberegler unter Optik, um eine Bogenbreite festzulegen, die eine numerische Blende aufweist, die das gesamte Organ oder einen bestimmten Interessenabschnitt gleichmäßig offenbaren.

Verwenden Sie den Schieberegler, um die Laserintensität unter Laserübertragungssteuerung für jeden ausgewählten Laser einzustellen, und klicken Sie auf Anwenden. Verwenden Sie erweiterte Messeinstellungen, um die linken und rechten Lichtblätter zusammenzuführen, um ein homogen beleuchtetes Bild zu erstellen. Definieren Sie die Start- und Endpositionen des Zu messungswerten Z-Stacks unter Scanbereich, und legen Sie die Schrittgröße auf fünf Mikrometer fest, und wählen Sie dann AutoSave aus, um die Dateien automatisch zu speichern, und beginnen Sie mit der Messung, um die Bilder zu erfassen.

Wenn alle Bilder erfasst wurden, aktivieren Sie die Surpass-Taste in der 3D-Software für die Post-Imaging-Analyse und laden Sie das erste Bild aus einem Z-Stack, um die Öffnung und automatische 3D-Rekonstruktion aller anderen Bilder des ausgewählten Z-Stacks zu initiieren, und passen Sie dann unter Anzeigeeinstellung die Intensität, den schwarzen Pegel und den Kontrast für jeden Kanal an. Um die Ansammlung menschlicher Zellen innerhalb des Lungengewebes über verschiedene Proben hinweg zu vergleichen, wählen Sie Bearbeiten und Zuschneiden von 3D aus, um einen Lungenwürfel mit einem bestimmten Volumen zu definieren. Um die beschrifteten Zellen innerhalb des definierten Lungenwürfels zu quantifizieren, öffnen Sie Neue Flecken in der Symbolleiste hinzufügen, klicken Sie auf Automatische Erstellung überspringen, manuell bearbeiten und den 640-Nanometer-Kanal auswählen.

Legen Sie die Radiusskala auf 10,00 Mikrometer fest, klicken Sie auf Auswählen, und klicken Sie unter Bearbeiten, Umschalttaste mit der linken Maustaste, um jede Fluoreszenzzelle einzeln mit einem Punkt zu markieren. Die Gesamtzahl der gezählten Zellen wird in der Statistik angezeigt. Um ein Bild zu erfassen, verwenden Sie das Snapshot-Tool und verwenden Sie das Animationstool, um ein Video aufzunehmen.

Mikroperlenbasierte Zellanreicherung und anschließende Fluoreszenzkennzeichnung, wie gezeigt, führen typischerweise zu einer CD4-positiven Reinheit von mindestens 95 % und einer erfolgreichen Kennzeichnung dieser Zellen, wie sie durch Durchflusszytometrie bestimmt wird. Die Gewebeclearingung auf Ethyl-Cinnamat-Basis erreicht eine hohe Organtransparenz, was auf einen erfolgreichen Brechungsindex-Abgleich hindeutet. Das autofluoreszierende Signal des Lungengewebes bietet ein hilfreiches Werkzeug, um die anatomische Struktur der Lunge durch Lichtbogenmikroskopie abzubilden, die als mittlere Intensitätsprojektion oder im Oberflächenmodus angezeigt werden kann.

Im Vergleich zur konventionellen Mikroskopie bietet die Lichtbogenmikroskopie den Vorteil einer gesamten Organbildgebung und nachfolgenden 3D-Rekonstruktion, die die Identifizierung und Visualisierung von proliferationsgefärbten, übertragenen menschlichen T-Zellen im Kontext des gesamten Organs ermöglicht, darüber hinaus wird die Präferenz übertragener menschlicher T-Zellen für die selektive Akkumulation im entzündeten Lungengewebe von papainexponierten Tieren durch die Tatsache unterstützt, dass menschliche CD4-positive T-Zellen nicht aus der Darmschleimhaut des Tieres entnommen werden können. Für die Quantifizierung und den Vergleich der Lungenakkumulation menschlicher CD4-positiver T-Zellen zwischen verschiedenen Bedingungen können die markierten Zellen auch in mehreren Lungenwürfeln mit definiertem Volumen gezählt werden, wie gezeigt. Eine sorgfältige Gewebeaufbereitung einschließlich Lungenperfusion, Inflation und Gewebereinigung ist für eine optimierte Erzeugung hochauflösender lichtbogenmikroskopischer Bilder sehr wichtig.

Um die erfolgreiche Diapedese übertragener menschlicher Lymphozyten weiter zu bestätigen, kann dieses Protokoll leicht mit der zytometrischen Durchflussquantifizierung menschlicher Lymphozyten innerhalb der murinen Bronchoalveolar-Lava gekombiniert werden. Die Fähigkeit, Immunzellen von einzelnen Patienten unter in vivo Bedingungen zu überwachen, unterstützt die Identifizierung funktioneller Veränderungen in Immunzellen, die durch eine bestimmte Krankheit oder Therapie geprägt sind.