Ein High-Content-Assay für die Überwachung der AMPA Rezeptor Menschenhandel

Hier zeigen wir einen high content receptor trafficking assay, der mit der primären neuronalen Kulturpräparation kompatibel ist. Diese Methode bezeichnet die Oberfläche separat als Interkellerrezeptorpools von festen Neuronen. Darstellung von Daten als Verhältnis zwischen normalisierter Oberfläche oder internalisierter Rezeptordichte zur Gesamtdichte dieses Rezeptors.

Der Test mit hohem Gehalt und Rezeptorhandel bietet ein bewirktes Mittel zur Messung von Massenveränderungen in Rezeptoren-Handelsprofilen innerhalb eines neuronalen Netzwerks als Reaktion auf verschiedene Faktoren. Viel weniger Zeit und Materialien als alternative Methoden verbrauchen. Störungen und im Lehrerhandel wurden mit mehreren neurologischen Erkrankungen in Verbindung gebracht und gelten als attraktive Ziele für die Medikamentierung.

Für Beispiele Studien haben gezeigt, eines der frühesten Anzeichen der Alzheimer-Krankheit ist synaptischen Verlust und verminderte synaptische und Preceptor Pools. Diese Technik erfordert viele verschiedene Schritte unterschiedlicher Schwierigkeit. Vor allem, weil der Umgang mit der 96-Brunnenplatte und das Manipulieren der Brunnen für jemanden ohne Erfahrung schwierig sein kann.

Und da die Ergebnisse des Experiments sehr empfindlich auf unsachgemäße Handhabung reagieren, ist es nützlich, die verschiedenen ausgeführten Schritte anzuzeigen. Instruktor Zu Beginn füttern Sie die Neuronen in der 96-Well-Platte, indem Sie 100 Mikroliter der bereits vorhandenen Medien aus jedem Brunnen entfernen. Und ersetzt es durch 100 Mikroliter Medien vorgewärmt auf 37 Grad Celsius.

Alle drei bis vier Tage. Verwenden Sie einen Tag in vitro 14, um 100 Mikroliter Medien aus jedem Brunnen zu entfernen und die Medien zu bündeln. Fügen Sie zwei Mikroliter TTX Stock-Lösung zu einem Milliliter der gepoolten konditionierten Medien hinzu, um eine viermikromolare Lösung von TTX zu erstellen.

Behandeln Sie die Neuronen in jedem Brunnen mit 100 Mikrolitern von vier mikromolaren TTX-Lösungen. Wenn nicht genügend gepoolte Zustandsmedien vorhanden sind, fügen Sie einige der zuvor gespeicherten Medien hinzu. Inkubieren Sie in einem 5%CO2-Inkubator bei 37 Grad Celsius für vier Stunden.

Danach entfernen Sie die vorhandenen TTX-haltigen Medien und fügen Sie 200 Mikroliter vorgewärmter neuronaler Medien hinzu, und inkubieren Sie die Mikroplatte bei Raumtemperatur für fünfzehn Minuten. Entfernen Sie zunächst die neuronalen Medien von der Mikroplatte. 50 Mikroliter der AntigluA1- oder AntigluA2-Antikörperlösung in die entsprechenden Brunnen der Mikroplatte geben.

Fügen Sie dem sekundären Antikörper fünfzig Mikroliter neuronaler Medien hinzu, die nur Brunnen kontrollieren. Bei Raumtemperatur für zwanzig Minuten inkubieren, um eine Antikörperbindung zu ermöglichen. Danach entfernen Sie die vorhandenen Medien aus Brunnen.

Waschen Sie die Mikroplatte dreimal mit 100 Mikrolitern Raumtemperatur neuronalen Medien pro Brunnen, um alle ungebundenen Antikörper zu entfernen. Dann fügen Sie 100 Mikroliter 100 Mikromolar DHPG Lagerlösung zu jedem Brunnen. Inkubieren Sie in einem 5% Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius für zehn Minuten.

Als nächstes entfernen Sie die DHPG-Lösung und fügen Sie 100 Mikroliter neuronalen Medien zu jedem Brunnen hinzu. Wiederholen Sie diesen Vorgang ein zweites Mal. Dann in kubieren in der 5% Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten.

Am Tag des Experiments eine Lösung von 4%Paraformaldehyd und 4%Saccharose NPBS vorbereiten. Entfernen Sie das Medium aus jedem Brunnen und ersetzen Sie es durch 100 Mikroliter der Paraformaldehyd- und Saccharoselösung. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden Additionszeitpunkt.

Inkubieren Sie die Mikroplatte bei 4 Grad Celsius für zwanzig Minuten. Entfernen Sie dann das Fixativ und fügen Sie 100 Mikroliter DPBS zu jedem Brunnen hinzu. Entfernen Sie die DPBS und fügen Sie 150 Mikroliter Blockierpuffer zu jedem Brunnen hinzu.

Bei Raumtemperatur neunzig Minuten inkubieren. Entfernen Sie den Blockierpuffer und fügen Sie jedem Brunnen 50 Mikroliter der sekundären Antikörperlösung hinzu. Bei Raumtemperatur für sechzig Minuten inkubieren, während die Platte vor Licht geschützt ist.

Entfernen Sie die Antikörperlösung und fügen Sie jedem Brunnen 100 Mikroliter TBS hinzu. Bei Raumtemperatur fünf Minuten inkubieren. Wiederholen Sie diesen Vorgang, entfernen Sie die Medien aus den Brunnen, die TBS hinzufügen, und inkubieren Sie bei Raumtemperatur vier weitere Male.

Entfernen Sie anschließend das TBS von der Mikroplatte. Fügen Sie 100 Mikroliter einer Lösung von 4%Paraformaldehyd und 4%Saccharose in PBS zu jedem Brunnen hinzu. Bei Raumtemperatur 15 Minuten inkubieren.

Entfernen Sie die Paraformaldehydlösung und fügen Sie 100 Mikroliter TBS in jedem Brunnen hinzu und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Wiederholen Sie diesen Schritt zwei weitere Male. Bereiten Sie zunächst eine Lösung aus TBS vor, die 2%Saponin enthält, und wirbeln Sie die Lösung kurz, um das Saponinpulver vollständig aufzulösen.

Filtern Sie die Lösung mit einem 2-Mikrometer-Filter, um Partikel zu entfernen, die eine Autofluoreszenz verursachen könnten. Fügen Sie 150 Mikroliter dieser 2%Saponin-Lösung zu jedem Brunnen hinzu und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für fünfzehn Minuten. Entfernen Sie dann die Saponin-Lösung, und fügen Sie 150 Mikroliter Blockierpuffer zu jedem Brunnen hinzu.

Bei Raumtemperatur neunzig Minuten inkubieren. Danach entfernen Sie den Sperrpuffer und fügen Sie jedem Brunnen fünfzig Mikroliter der sekundären Antikörperlösung hinzu. Bei Raumtemperatur für sechzig Minuten inkubieren.

Dann 100 Mikroliter TBS zu jedem Brunnen hinzufügen und bei Raumtemperatur für fünf Minuten inkubieren. Wiederholen Sie diesen Vorgang, indem Sie TBS hinzufügen und bei Raumtemperatur viermal zusätzlich inkubieren. Mit Hilfe eines Infrarot-Laser-Bildgebungssystems bilde die 96-Well-Mikroplatte nach Herstelleranleitung ab.

Stellen Sie die Scanauflösung auf 84 Mikrometer ein. Die Scanqualität bis mittel und der Fokusversatz entsprechend der Grundhöhe der verwendeten 96-Well-Mikroplatte. Klicken Sie auf die Bildstudio-Menüschaltfläche, exportieren Sie das Bild für digitale Medien und exportieren Sie die Bilder mit einer Auflösung von 300 dpi im TIFF-Format.

Öffnen Sie das Bild in ImageJ Fiji. Teilen Sie die Farbkanäle, indem Sie auf das Bildmenü klicken und dann Farbe, geteilte Kanäle. Öffnen Sie dann den ROI-Manager aus analyse-Tools.

Aktivieren Sie das Kontrollkästchen für Etiketten im ROI-Manager, um die Kreise mit Zahlen zu klassifizieren. Wählen Sie im roten Kanal 6 80 den Interessenbereich aus, indem Sie das Kreiswerkzeug auswählen und einen Kreis zeichnen, der genau zum ersten Brunnen passt. Drücken Sie dann Strg plus T und ziehen Sie den Kreis zum nächsten Brunnen.

Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Brunnen eingekreist sind. Klicken Sie aus dem ROI-Manager auf Messen. Wählen Sie die angezeigten Werte aus, und kopieren Sie sie in ein Spreadsheet.

Klicken Sie als Nächstes auf den grünen Kanal und transponieren Sie die ausgewählten ROIs in das Bild. Klicken Sie aus dem ROI-Manager auf Messen. Wählen Sie die angezeigten Werte aus, und kopieren Sie sie in ein Spreadsheet.

Danach berechnen Sie die Änderungen der Oberflächenrezeptorexpression, wie im Textprotokoll beschrieben. In diesem Verfahren wird das Fortbestehen von Lichtbogen bei der Regulierung des Amparezeptorhandels mit dem High-Content-Ampa-Rezeptor-Handel und Assay untersucht. Neuronen werden mit dem Natrium-Ionen-Kanalblocker TTX behandelt, der Aktionspotentiale hemmt und Lichtbogenspiegel reduziert.

Gefolgt von DHPG, das Bogenübersetzung und Ubiquitination induziert. Sowohl Oberflächen- als auch Verinnerungspools von GluA1 und GluA2, die Apa-Rezeptor-Untereinheiten enthalten, wurden fünf und fünfzehn Minuten nach dem DHPG-Auswaschen gemessen. ArcKR Neuronen zeigen erhöhte GluA1-Endositose, wenn mit DHPG behandelt, im Vergleich zu, während Typ Neuronen.

Dieser Effekt wird nicht gesehen, wenn Neuronen nur mit TTX behandelt werden. Die Oberflächenexpression der GluA2-Untereinheit wird bei kurzen Zeitpunkten im Vergleich zu Wile-Typ-Neuronen signifikant erhöht. Anzeige eines potenziellen Austauschs von Untereinheiten.

Sicherstellen, dass die Zellen illiquides festes Paraformaldehyd sind, sollte am Tag des Experiments frisch zubereitet werden. Die Zellen müssen nach der Beschriftung für die Oberflächenrezeptoren neu fixiert werden. Andere Methoden wie die konfokale Mikroskopie werden in der Lage sein, einzellige Auflösung bereitzustellen, um verwandte veränderte in der neuronalen Struktur und Rezeptorlokalisierung weiter zu charakterisieren.

Unterbrechung der zeitlichen Dynamik des Bogenalters Ampa-Rezeptoren-Handels als Reaktion auf MgluR vermittelte LTD. Zukünftige Richtungen werden sein, Ampa-Rezeptoren Handel als Reaktion auf andere Reize zu messen. Dieser Test kann möglicherweise an andere Zelltypen, Behandlungen und Rezeptoren angepasst werden, vorausgesetzt, dass das Verfahren sorgfältig angepasst und entsprechend validiert wird.

Es muss darauf geachtet werden, dass Zelldichten, Behandlungszeiten, Fixierungsschritte, Permeabilisierungsschritte und Reagenzienauswahlen für Ihr Interessensystem optimiert werden. Für eine erfolgreiche und effiziente Abwicklung des Assays ist es wichtig, die DHPG-Lösung und die 4%Paraformaldehyd-Lösung 4%Saccharose-Lösung am Tag des Experiments vorzubereiten. Die mit Vakeel oder TTX gut behandelte Kontrolle ist erforderlich, um sicherzustellen, dass die beobachteten Wirkungen behandlungsspezifisch sind.

Es ist auch wichtig, Brunnen einzubeziehen, die nur mit den sekundären Antikörpern behandelt werden, um die durch nicht spezifische Bindung erzeugte Hintergrundfluoreszenz zu kontrollieren.