Hochempfindliche Messung der Glomerularpermeabilität bei Mäusen mit Fluorescein-Isothiocyanat-Polysukrose 70
9. August 2019
Hier stellen wir ein Protokoll zur Prüfung der glomerulären Permeabilität bei Mäusen mit einem hochempfindlichen, nicht radioaktiven Tracer vor. Diese Methode ermöglicht repetitive Urinanalysen mit kleinen Urinvolumina.
Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Nephrologie über die Rolle der glomerulären Permeabilität bei Nierenerkrankungen zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass kleine und vorübergehende Erhöhungen der glomerulären Permeabilität mit einem fluoreszierenden Blei-markierten Tracer erkannt werden. Nach der Anästhesie einen Harnkatheter in die weibliche Maus geben.
Positionieren Sie die Maus in dorsaler Rekumbency. Ziehen Sie den Unterbauch fest und finden Sie das Urethralostium. Den Kunststoffteil des Katheters eines 22 G Angiokatheters besorgen und mit Xylocain-Gel schmieren.
Verwenden Sie den linken Zeigefinger, um eine sorgfältige Spannung am Unterbauch zu platzieren und den Katheter drei Millimeter in das Urethralostium einzuführen, während die distale Harnröhrenachse parallel zur distalen Harnröhrenachse verläuft. Drehen Sie die Spitze des Angiokatheters um 180 Grad, indem Sie die Spitze innerhalb des Harnröhrenostiums halten und die Achse der Harnröhre beibehalten. Dann führen Sie den Katheter sieben Millimeter weiter in die Maus ein, so dass er in der Blase platziert wird.
Legen Sie eine 1,5 Milliliter braune Röhre über die Oberseite des Angiokatheters, um den Urin zu sammeln. Tragen Sie einen Milliliter 0,9% Natriumchlorid subkutan auf, um die Urinproduktion zu verbessern. Rasieren Sie den Hals der Maus und legen Sie es in Recumbency mit dem Kopf in Richtung des Chirurgen.
Hyper verlängern Sie den Kopf der Maus mit einem Band. Desinfizieren Sie den Hals mit 70%isopropanol. Mit einer Pinzette und einer Schere machen Sie einen fünf Millimeter großen Hautschnitt unterhalb der Kieferlinie.
Schneiden Sie die Haut etwa einen Zentimeter in Richtung des Brustbeins, bis die Mitte des Brustbeins erreicht ist. Verwenden Sie eine Schere. Sezieren Sie die Haut vorsichtig auf der rechten Seite des Halses.
Machen Sie einen rechteckigen Schnitt der Haut auf der rechten Seite, um das Weichgewebe des Halses zu belichten. Achten Sie darauf, die Jugularvene nicht zu beschädigen. Verwenden Sie eine Schere und eine Pinzette, um die Hautklappen mit zwei Klemmen zu fixieren.
Mit der Spitze der feinen Pinzette, sorgfältig die jugular Vene durch stumpfe Vorbereitung aussetzen. Entfernen Sie bei Bedarf Gewebe mit einer feinen Schere. Vermeiden Sie Verletzungen an Venenzweigen.
Platzieren und schließen Sie eine Ligatur mit einem Seidenfaden am distalen Teil der sichtbaren Jugularvene, die sich zum Kopf der Maus hin befindet. Befestigen Sie den Seidenfaden mit einem Klebeband, um die Ligatur zu verspannungen. Dies sorgt für eine leichte Spannung an der Jugularvene.
Bereiten Sie eine Ligatur um den proximalen Teil der Jugularvene vor. Danach den Katheter mit der Gleichgewichts- und Fusionslösung füllen. Befestigen Sie den Katheter mit einem Klebeband, so dass der Katheter die Jugularvene ausrichtet.
Kontrolle für Blasen, um Luftembolie zu vermeiden. Heben Sie die Jugularvene mit feiner Pinzette an der Stelle der Einfügung. Richten Sie die Schläuche parallel zur Jugularvene aus und punktieren Sie die Jugularvene, die auf das Lumen zielt.
Einfügen für etwa zwei bis vier Millimeter parallel zur Achse der Jugularvene. Vermeiden Sie lebhafte Bewegungen. Schließen Sie die Ligatur, um den Katheter zu fixieren.
Kontrolle für dichige Ligatur durch sorgfältiges Betrachten durch das Mikroskop. Legen Sie einen feuchten Tupfer über den Ort der Operation. Legen Sie die Schwanzmanschette an der Unterseite des Mausschwanzes, während die Maus in dorsaler Restauumbenz liegt.
Starten Sie die Messungen und wiederholen Sie sie zehnmal pro Zeitpunkt. Wenn Blutdruckmessungen nicht korrekt erscheinen und falsche Daten erstellt werden, passen Sie die Position der Schwanzmanschette an. Vor der Gleichgewichtsphase das Harnsammelrohr wechseln und auf Eis legen.
Falten Sie einen Tupfer und legen Sie ihn um den kleinen Gefäßkatheter, der in die Jugularvene eingeführt wird. Legen Sie eine Klemme über den Tupfer, um retrograde Durchblutung oder Luftembolie abzuschaffen. Schließen Sie eine 27 G Nadel mit einer mit dem FITC-Bolus gefüllten 1-Milliliter-Spritze an das Ende des kleinen Gefäßkatheters an.
Öffnen Sie die Klemme und tragen Sie den 100 Mikroliter FITC Bolus auf. Schließen Sie die Klemme erneut und verbinden Sie den größeren Katheter mit dem kleineren Katheter. Öffnen Sie die Klemme erneut und starten Sie die Spritzenpumpe mit einem Durchfluss von 0,008 Milliliter pro Minute.
Setzen Sie die Infusion 60 Minuten fort. In dieser Phase werden die wirksamen Medikamente auf glomeruläre Permselektivität untersucht. Ändern Sie den Harnröhren-Formzeitpunkt Null Minute in eine weitere 1,5 Milliliter braune Röhre.
Legen Sie einen Tupfer um den kleinen Gefäßkatheter und trennen Sie den großen Katheter vom kleinen Gefäßkatheter. Füllen Sie die Spritze mit der experimentellen Phasenlösung. Legen Sie sie in die Spritzenpumpe und lassen Sie die Infusionspumpe laufen, so dass der große Katheter mit der experimentellen Phasenlösung gefüllt ist.
Schließen Sie die Katheter wieder an, während Sie Luftembolie vermeiden und die Klemme wieder öffnen. Starten Sie die Spritzenpumpe mit einer Durchflussrate von 0,008 Milliliter pro Minute. Fahren Sie die Spritzenpumpe 60 Minuten lang weiter und sammeln Sie danach den Urin in der Harnröhre.
Legen Sie den Urinschlauch auf Eis. In dieser Studie zeigt der Fluoreszenzscan von einheimischem Mausurin einen Spitzenwert von 395 Nanometern. FITC-Polysucrose 70 bei einer Konzentration von 40 Mikrogramm pro Milliliter im Urin der Maus zeigt ein Fluoreszenzmaximum von 525 Nanometern an.
Mausurin stört die Fluoreszenzmessung von FITC-Polysukrose 70 nicht. Bei der Zulassung von 525 Nanometern zeigen steigende Konzentrationen von FITC-Polysukrose 70 eine erhöhte Fluoreszenzintensität. Diese Methode ist auch in der Lage, Unterschiede in der glomerulären Permeabilität zu erkennen.
Die weißen Säulen stellen FITC-Polysukrose 70-Stufen vor Beginn der Angiotensin-II-Stimulation in der experimentellen Phase dar. Nach Dosierungen für 60 Minuten, die glomeruläre Permeabilität im Vergleich zu Kontrollgruppe erhöht. Angiotensin II auswaschen verringerte glomeruläre Durchlässigkeit.
Die FITC-Polysucrose 70-Spiegel verringerten sich nach weiteren 60 Minuten Angiotensin-II-Stimulation oder 60 Minuten Angiotensin-II-Auswaschung. Die Erhöhung der glomerulären Permeabilität durch Angiotensin II könnte durch einen Angiotensin-II-Rezeptorblocker blockiert werden. Der blutdrucküberwachte Blutdruck zeigte keine signifikanten Unterschiede zwischen der Kontrolle und den mit Angiotensin II behandelten Gruppen.
Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, Luftembolie beim Wechsel von Infusionslösungen zu vermeiden.
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Überblick
Dieser Artikel präsentiert ein Protokoll zur Untersuchung der glomerulären Permeabilität bei Mäusen unter Verwendung eines empfindlichen, nicht-radioaktiven Tracers. Diese Methode ermöglicht wiederholte Urinanalysen mit minimalen Urinvolumina.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Nephrologie
- Nierenkrankheiten-Forschung
- Beurteilung der glomerulären Funktion
Hintergrund
- Das Verständnis der glomerulären Permeabilität ist entscheidend bei Nierenerkrankungen.
- Aktuelle Methoden können kleine Veränderungen in der Permeabilität möglicherweise nicht erkennen.
- Dieses Protokoll zielt darauf ab, die Nachweisempfindlichkeit zu verbessern.
- Fluoreszierende Tracer bieten eine nicht-radioaktive Alternative für Studien.
Zweck der Studie
- Um die glomeruläre Permeabilität in einem Mausmodell zu bewerten.
- Um die Auswirkungen kleiner Erhöhungen der Permeabilität auf die Nierenfunktion zu beurteilen.
- Um eine zuverlässige Methode für die nephrologische Forschung bereitzustellen.
Verwendete Methoden
- Verwendung eines fluoreszierenden, mit Blei markierten Tracers zur Erkennung.
- Anästhesie der Mäuse.
- Einsetzen eines Harnleiterkatheters bei weiblichen Mäusen.
- Positionierung der Maus in Rückenlage für den Eingriff.
Hauptergebnisse
- Kleine und vorübergehende Erhöhungen der glomerulären Permeabilität können erkannt werden.
- Die Methode ermöglicht wiederholte Messungen mit minimalem Urinvolumen.
- Fluoreszierende Tracer erhöhen die Empfindlichkeit der Analyse.
- Das Protokoll ist unkompliziert und reproduzierbar.
Schlussfolgerungen
- Diese Methode bietet ein wertvolles Werkzeug für die nephrologische Forschung.
- Sie ermöglicht ein besseres Verständnis der glomerulären Funktion bei Gesundheit und Krankheit.
- Zukünftige Studien können diese Technik nutzen, um tiefere Einblicke in die Nierenpathologie zu gewinnen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
This method enables detection of small, transient increases in glomerular permeability using a nonradioactive fluorescent tracer, addressing a critical gap in early kidney disease biomarker discovery. By allowing repetitive urine analysis with minimal sample volume, it supports longitudinal monitoring in preclinical models, improving predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking for renal therapeutics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying glomerular permselectivity changes in response to pharmacological modulators.
- Operational Value: Enables functional target validation through direct measurement of tracer flux, reducing reliance on indirect albuminuria endpoints.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by detecting early permeability shifts that may predict later pathological outcomes.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream compound screening by establishing baseline permeability metrics.
- Quantitative Output: Generates fluorescence-based readouts normalized to creatinine, enabling standardized, reproducible measurements across studies.
- Scalability: Facilitates high-frequency sampling with low urine volume requirements, supporting longitudinal assay designs.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models human glomerular dysfunction by capturing permeability changes induced by angiotensin II, a known pathophysiological mediator.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical phases by providing a consistent permeability readout across intervention and washout phases.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs go/no-go criteria by demonstrating reversibility of permeability changes with receptor blockade, supporting mechanistic de-risking.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, enabling hypothesis-driven assessment of glomerular function prior to lead optimization and supporting data-driven advancement decisions.
- Discovery Biology: Supports mechanistic interrogation of pathways affecting glomerular barrier integrity, such as RAAS modulation.
- Screening: Delivers assay-ready systems with standardized tracer handling and fluorescence detection protocols.
- Analytics: Provides quantitative, normalized fluorescence intensity measurements that allow comparison of permeability states across experimental conditions.
- Translational Research: Connects early permeability changes to preclinical validation by tracking responses to angiostensin II and its blockade.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable permeability testing platform applicable across multiple renal disease models and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances target confidence by detecting subtle, early-stage permeability changes missed by conventional biomarkers.
- Operational Value: Improves reproducibility through standardized catheterization, infusion, and fluorescence measurement procedures.
- Strategic Value: Increases capital efficiency by enabling early detection of ineffective compounds, reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying compounds that modulate glomerular permselectivity with mechanistic clarity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine vascular access and urinary catheterization techniques.
- Dependent on fluorescence plate reader instrumentation capable of excitation/emission at 490/525 nm for FITC detection.
- Necessitates cross-team standardization of urine collection, handling, and creatinine normalization procedures.
- Involves adaptation considerations when translating protocols across strains, sexes, or disease models.
- Limited by the need for careful air embolism prevention during infusion solution changes, as noted in procedural controls.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:28
Preparation Phase Urinary Catheter
1:43
Preparation Phase - Central Venous Catheter
4:16
Blood Pressure Measurement and Equilibration Phase
5:51
Experimental Phase
7:10
Results: Fluorescence Scan, Glomerular Permeability and Blood Pressure
9:00
Conclusion
