Echtzeit-Beobachtung der DNA-Strang Exchange Reaktion vermittelt durch Rad51
February 13th, 2019
Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer-basierte Echtzeit-Beobachtung, dass Systeme der DNA Strang Austausch Reaktion vermittelt durch Rad51 wurden entwickelt. Mithilfe der hier vorgestellten Protokolle, sind wir in der Lage, die Bildung von Zwischenprodukten Reaktion und ihre Umsetzung in Produkte, bei der Analyse auch die enzymatischen Kinetics der Reaktion zu erkennen.
Diese Methode kann helfen, die Schritte im DNA-Strangaustausch zu entschlüsseln und zeigt die Molekülrollen verschiedener Proteine, die während der Reparatur an der Kombination beteiligt sind. Mit dieser Technik können wir den AUSTAUSCH von DNA-Strängen in Echtzeit ohne Unterbrechung der Reaktion überwachen und den Operationssaal nutzen, um die Kinetik jedes Reaktionsschritts zu bestimmen. Mit einigen geringfügigen Anpassungen kann diese Technik angewendet werden, um die Aktivitäten von gereinigten Rekombinationsproteinen zu untersuchen, die von anderen Arten wie Säugetieren und Pflanzen gewonnen wurden.
Demonstriert wird das Verfahren von Kentaro Ito, einem Post-Doc aus meinem Labor. Bereiten Sie zunächst den Reaktionspuffer A entsprechend dem Textprotokoll vor. Als nächstes fügen Sie 36-Nanomol 16FA-Oligonukleotid in den Puffer für den DNA-Pairing-Test.
Die Mischung bei 37 Grad Celsius fünf Minuten lang inkubieren. RAD-51-Protein in einer Endkonzentration von 1,5 Mikromolen in die Mischung geben und fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius bebrüten. SWI5-SFR1-Protein in einer Endkonzentration von 0,15 Mikromolen in die Mischung geben und bei 37 Grad Celsius für weitere fünf Minuten brüten.
1,5 Milliliter des Gemischs in eine 1,0 mal 1,0 cm große Quarzküvette mit Magnetrührer geben. Setzen Sie die Küvette in ein Spektrofluorometer ein und stellen Sie den Temperaturregler und den Magnetrührer ein. Erfassen Sie die Veränderung der FAM-Fluoreszenzemission bei Anregung bei Anregung bei 493 Nanometern in einer Sekunde In- und Rhythmusintervall für 100 Sekunden.
Schließlich injizieren Sie mit einer Spritze ROX-markierte doppelsträngige DNA in einer Endkonzentration von 36 Nanomolen in die Küvette. Zeichnen Sie die Veränderung der Fluoreszenzemission in einer Sekunde Intervall für 30 Minuten auf. Um die Fluoreszenzspektren zwischen den Substraten und den Endprodukten zu vergleichen, legen Sie jede Küvette mit den 16 FA-Oligonukleotiden mit oder ohne RAD-51 in ein Spektrofluorometer ein und inkubieren Sie fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius.
Zeichnen Sie dann die FAM-Fluoreszenzemission bei Anregung bei 493 Nanometern bei 500 bis 600 Nanometern auf. Um die Wirkung von RAD-51 auf die Fluoreszenzspektren zu testen, fügen Sie RAD-51 mit einer Endkonzentration von 1,5 Mikromolen hinzu. Und die Mischung bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten inkubieren.
Notieren Sie schließlich die Fluoreszenzspektren von 500 bis 600 Nanometer bei Anregung bei 493 Nanometern. Die maximale FRET-Effizienz wird durch Messung der maximalen Reduktion der Fluoreszenzintensität erreicht, wenn alle einsträngigen DNA-Substrate im Pairing-Assay in doppelsträngige DNA umgewandelt werden. Oder durch Messung der maximalen Erhöhung der Intensität, wenn alle doppelsträngigen DNA-Substrat in einsträngige DNA im Verschiebungstest umgewandelt werden.
In beiden Assays hatte die Zugabe von RAD-51-Protein keinen Einfluss auf die Fluoreszenzemission von FAM oder seine Abschreckwirkungseffizienz durch Gesteine. Die Auswirkungen der spontanen Reaktionen zwischen Substrat-DNAs und der anschließenden Photobleichung sind gering. Wie die vernachlässigbaren Veränderungen der Emission von FAM ohne RAD-51 zeigen, im Vergleich zu den wesentlichen Veränderungen, die mit RAD-51 beobachtet wurden.
Das Hinzufügen des SWI5-SFR1-Komplexes stimuliert stark die Kopplungsaktivität von RAD-51. Die Kopplungsreaktion wird mit einem dreistufigen Modell simuliert, das aus der Bildung des ersten dreistrangigen Zwischenprodukts, dem Übergang in das zweite Zwischenprodukt und der Freisetzung der einsträngigen DNA und der Bildung des Hetero-Duplex besteht. Ein Vergleich des dreistufigen Modells mit einem zweistufigen Modell zeigt, dass das dreistufige Modell besser für die Simulation der DNA-Kopplung geeignet ist, ohne oder mit dem SWI5-SFR1-Komplex.
Die berechnete Gleichgewichtskonstante jedes Reaktionsschritts mit oder ohne SWI5-SFR1 zeigt, dass der SWI5-SFR1-Komplex nicht die Bildung des ersten dreisträngigen Zwischenprodukts stimuliert, sondern den Übergang zwischen den beiden dreistrangigen Zwischenprodukten und die Freisetzung von SS-DNA stark stimuliert. Es ist wichtig zu überprüfen, ob jede Charge gereinigten Proteins frei von Nuklease- und Helicasekontamination ist.
Übersicht
Dieser Artikel präsentiert eine Methode zur Echtzeit-Beobachtung von DNA-Strangaustauschreaktionen, die durch Rad51 mittels Fluoreszenzresonanzenergietransfer vermittelt werden. Die Technik ermöglicht die Erkennung von Reaktionszwischenprodukten und die Analyse der enzymatischen Kinetik, ohne die Reaktion zu stören.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Biochemie
- Molekularbiologie
- Genetik
Hintergrund
- Der DNA-Strangaustausch ist ein entscheidender Prozess bei der DNA-Reparatur.
- Rad51 spielt eine bedeutende Rolle bei der homologen Rekombination.
- Das Verständnis der Kinetik dieser Reaktion kann Einblicke in DNA-Reparaturmechanismen liefern.
- Echtzeit-Überwachungstechniken verbessern das Studium dieser komplexen biochemischen Prozesse.
Zweck der Studie
- Zur Entwicklung eines Systems zur Echtzeit-Beobachtung von DNA-Strangaustausch.
- Zur Analyse der Rollen verschiedener Proteine in der Reaktion.
- Zur Bestimmung der Kinetik jedes Schritts im DNA-Strangaustauschprozess.
Verwendete Methoden
- Zubereitung von Reaktionspuffer und Oligonukleotiden für DNA-Paarungsassays.
- Inkubation von RAD-51 und SWI5-SFR1 Proteinen mit DNA-Substraten.
- Verwendung eines Spektrofluorometers zur Überwachung von Fluoreszenzänderungen.
- Analyse von Reaktionszwischenprodukten und Produkten durch Fluoreszenzemissionsmessungen.
Hauptergebnisse
- Die Zugabe von SWI5-SFR1 stimuliert die Paarungsaktivität von RAD-51 erheblich.
- Ein Drei-Schritte-Modell passt besser zur DNA-Paarungssimulation als ein Zwei-Schritte-Modell.
- Die Studie liefert quantitative Daten zur Kinetik des DNA-Strangaustauschs.
- Fluoreszenzmessungen zeigten minimale Auswirkungen von spontanen Reaktionen.
Schlussfolgerungen
- Die entwickelte Methode ermöglicht eine detaillierte kinetische Analyse des DNA-Strangaustauschs.
- SWI5-SFR1 verbessert die Effizienz von RAD-51 bei der DNA-Paarung.
- Diese Technik kann für die Untersuchung von Rekombinationsproteinen verschiedener Spezies angepasst werden.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Real-time observation of DNA strand exchange mediated by Rad51 provides a quantitative framework for evaluating recombination protein function, supporting target validation in DNA repair pathways. The FRET-based assay enables kinetic de-risking of mechanistic hypotheses by resolving transient intermediates, informing lead identification for modulators of homologous recombination. This approach enhances predictive confidence in early discovery by linking protein activity to functional DNA repair outcomes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of Rad51-mediated strand exchange to validate therapeutic targets in DNA repair pathways.
- Operational Value: Resolves formation and maturation of three-strand DNA intermediates, clarifying mechanism of action for accessory proteins like Swi5-Sfr1.
- Predictive Value: Supports three-step kinetic modeling that improves confidence in target engagement and pathway modulation predictions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence readouts to measure strand exchange kinetics under varying protein conditions.
- Operational Value: Establishes a homogeneous, solution-based assay format compatible with spectrofluorometric detection for compound screening.
- Assay Readiness: Enables real-time monitoring without reaction disruption, supporting dose-response and time-course analyses for hit validation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Facilitates cross-species comparison of recombination protein activity, supporting extrapolation from model systems to human homologs.
- Mechanistic De-risking: Distinguishes effects of accessory proteins on specific reaction steps, reducing ambiguity in mechanism-based biomarker alignment.
- Preclinical Continuity: Provides a standardized method to assess functional conservation of Rad51 regulators across species, informing target selection.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, where kinetic profiling of DNA repair proteins informs go/no-go decisions prior to preclinical investment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying how Swi5-Sfr1 stimulates intermediate maturation and ssDNA release in Rad51-mediated strand exchange.
- Screening: Delivers reproducible, real-time FRET signals that enable comparison of inhibitor or activator effects on reaction kinetics.
- Analytics: Provides step-resolved rate constants and equilibrium constants that allow quantitative comparison of protein variants or conditions.
- Translational Research: Enables assessment of evolutionary conservation by applying the assay to recombination proteins from mammals and plants.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for characterizing recombinase activity, reducing redundant assay development across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by resolving transient intermediates and defining rate-limiting steps.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible kinetic data through real-time fluorescence monitoring in a cuvette-based format.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by quantifying how accessory proteins modulate specific steps of strand exchange, reducing mechanistic uncertainty.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of DNA repair targets based on quantitative kinetic profiles and evolutionary conservation data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein purification, fluorescence spectroscopy, and kinetic data analysis.
- Dependent on access to a temperature-controlled spectrofluorometer with magnetic stirring and syringe injection capability.
- Necessitates standardized protein preparation to exclude nuclease and helicase contaminants that could confound reaction interpretation.
- Requires optimization of oligonucleotide labeling and concentration for each target species to ensure detectable FRET signals.
- Limited to in vitro systems; does not capture chromatin or nuclear context effects present in vivo.
