Echtzeit-Beobachtung der DNA-Strang Exchange Reaktion vermittelt durch Rad51
13. Februar 2019
Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer-basierte Echtzeit-Beobachtung, dass Systeme der DNA Strang Austausch Reaktion vermittelt durch Rad51 wurden entwickelt. Mithilfe der hier vorgestellten Protokolle, sind wir in der Lage, die Bildung von Zwischenprodukten Reaktion und ihre Umsetzung in Produkte, bei der Analyse auch die enzymatischen Kinetics der Reaktion zu erkennen.
Diese Methode kann helfen, die Schritte im DNA-Strangaustausch zu entschlüsseln und zeigt die Molekülrollen verschiedener Proteine, die während der Reparatur an der Kombination beteiligt sind. Mit dieser Technik können wir den AUSTAUSCH von DNA-Strängen in Echtzeit ohne Unterbrechung der Reaktion überwachen und den Operationssaal nutzen, um die Kinetik jedes Reaktionsschritts zu bestimmen. Mit einigen geringfügigen Anpassungen kann diese Technik angewendet werden, um die Aktivitäten von gereinigten Rekombinationsproteinen zu untersuchen, die von anderen Arten wie Säugetieren und Pflanzen gewonnen wurden.
Demonstriert wird das Verfahren von Kentaro Ito, einem Post-Doc aus meinem Labor. Bereiten Sie zunächst den Reaktionspuffer A entsprechend dem Textprotokoll vor. Als nächstes fügen Sie 36-Nanomol 16FA-Oligonukleotid in den Puffer für den DNA-Pairing-Test.
Die Mischung bei 37 Grad Celsius fünf Minuten lang inkubieren. RAD-51-Protein in einer Endkonzentration von 1,5 Mikromolen in die Mischung geben und fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius bebrüten. SWI5-SFR1-Protein in einer Endkonzentration von 0,15 Mikromolen in die Mischung geben und bei 37 Grad Celsius für weitere fünf Minuten brüten.
1,5 Milliliter des Gemischs in eine 1,0 mal 1,0 cm große Quarzküvette mit Magnetrührer geben. Setzen Sie die Küvette in ein Spektrofluorometer ein und stellen Sie den Temperaturregler und den Magnetrührer ein. Erfassen Sie die Veränderung der FAM-Fluoreszenzemission bei Anregung bei Anregung bei 493 Nanometern in einer Sekunde In- und Rhythmusintervall für 100 Sekunden.
Schließlich injizieren Sie mit einer Spritze ROX-markierte doppelsträngige DNA in einer Endkonzentration von 36 Nanomolen in die Küvette. Zeichnen Sie die Veränderung der Fluoreszenzemission in einer Sekunde Intervall für 30 Minuten auf. Um die Fluoreszenzspektren zwischen den Substraten und den Endprodukten zu vergleichen, legen Sie jede Küvette mit den 16 FA-Oligonukleotiden mit oder ohne RAD-51 in ein Spektrofluorometer ein und inkubieren Sie fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius.
Zeichnen Sie dann die FAM-Fluoreszenzemission bei Anregung bei 493 Nanometern bei 500 bis 600 Nanometern auf. Um die Wirkung von RAD-51 auf die Fluoreszenzspektren zu testen, fügen Sie RAD-51 mit einer Endkonzentration von 1,5 Mikromolen hinzu. Und die Mischung bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten inkubieren.
Notieren Sie schließlich die Fluoreszenzspektren von 500 bis 600 Nanometer bei Anregung bei 493 Nanometern. Die maximale FRET-Effizienz wird durch Messung der maximalen Reduktion der Fluoreszenzintensität erreicht, wenn alle einsträngigen DNA-Substrate im Pairing-Assay in doppelsträngige DNA umgewandelt werden. Oder durch Messung der maximalen Erhöhung der Intensität, wenn alle doppelsträngigen DNA-Substrat in einsträngige DNA im Verschiebungstest umgewandelt werden.
In beiden Assays hatte die Zugabe von RAD-51-Protein keinen Einfluss auf die Fluoreszenzemission von FAM oder seine Abschreckwirkungseffizienz durch Gesteine. Die Auswirkungen der spontanen Reaktionen zwischen Substrat-DNAs und der anschließenden Photobleichung sind gering. Wie die vernachlässigbaren Veränderungen der Emission von FAM ohne RAD-51 zeigen, im Vergleich zu den wesentlichen Veränderungen, die mit RAD-51 beobachtet wurden.
Das Hinzufügen des SWI5-SFR1-Komplexes stimuliert stark die Kopplungsaktivität von RAD-51. Die Kopplungsreaktion wird mit einem dreistufigen Modell simuliert, das aus der Bildung des ersten dreistrangigen Zwischenprodukts, dem Übergang in das zweite Zwischenprodukt und der Freisetzung der einsträngigen DNA und der Bildung des Hetero-Duplex besteht. Ein Vergleich des dreistufigen Modells mit einem zweistufigen Modell zeigt, dass das dreistufige Modell besser für die Simulation der DNA-Kopplung geeignet ist, ohne oder mit dem SWI5-SFR1-Komplex.
Die berechnete Gleichgewichtskonstante jedes Reaktionsschritts mit oder ohne SWI5-SFR1 zeigt, dass der SWI5-SFR1-Komplex nicht die Bildung des ersten dreisträngigen Zwischenprodukts stimuliert, sondern den Übergang zwischen den beiden dreistrangigen Zwischenprodukten und die Freisetzung von SS-DNA stark stimuliert. Es ist wichtig zu überprüfen, ob jede Charge gereinigten Proteins frei von Nuklease- und Helicasekontamination ist.
Übersicht
Dieser Artikel stellt eine Methode zur Echtzeitbeobachtung von durch Rad51 vermittelten DNA-Strangwechselreaktionen mittels Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer vor. Die Technik ermöglicht die Detektion von Reaktionsintermediaten und die Analyse enzymatischer Kinetik, ohne die Reaktion zu stören.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Biochemie
- Molekularbiologie
- Genetik
Hintergrund
- Der DNA-Strangwechsel ist ein entscheidender Prozess bei der DNA-Reparatur.
- Rad51 spielt eine bedeutende Rolle bei der homologen Rekombination.
- Das Verständnis der Kinetik dieser Reaktion kann Einblicke in die Mechanismen der DNA-Reparatur liefern.
- Echtzeit-Überwachungstechniken verbessern die Untersuchung dieser komplexen biochemischen Prozesse.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines Systems zur Beobachtung des DNA-Strangwechsels in Echtzeit.
- Analyse der Rollen verschiedener Proteine in der Reaktion.
- Bestimmung der Kinetik jedes Schritts im DNA-Strangwechsel-Prozess.
Verwendete Methoden
- Herstellung des Reaktionspuffers und der Oligonukleotide für DNA-Paarungsassays.
- Inkubation der RAD-51- und SWI5-SFR1-Proteine mit DNA-Substraten.
- Verwendung eines Spektralfluorometers zur Überwachung von Fluoreszenzänderungen.
- Analyse von Reaktionszwischenprodukten und -produkten mittels Messung der Fluoreszenzemission.
Hauptergebnisse
- Die Zugabe von SWI5-SFR1 stimuliert die Paarungsaktivität von RAD-51 erheblich.
- Ein dreistufiges Modell passt besser zur DNA-Paarungssimulation als ein zweistufiges Modell.
- Die Studie liefert quantitative Daten zur Kinetik des DNA-Strangwechsels.
- Fluoreszenzmessungen zeigten minimale Effekte durch spontane Reaktionen.
Schlussfolgerungen
- Die entwickelte Methode ermöglicht eine detaillierte kinetische Analyse des DNA-Strangwechsels.
- SWI5-SFR1 verbessert die Effizienz von RAD-51 bei der DNA-Paarung.
- Diese Technik kann zur Untersuchung von Rekombinationsproteinen aus verschiedenen Arten angepasst werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Echtzeitbeobachtung des durch Rad51 vermittelten DNA-Strangwechsels bietet einen quantitativen Rahmen zur Bewertung der Funktion von Rekombinationsproteinen und unterstützt die Zielvalidierung in DNA-Reparaturwegen. Der FRET-basierte Assay ermöglicht eine kinetische Absicherung mechanistischer Hypothesen, indem er transiente Intermediate auflöst, und liefert Hinweise zur Identifizierung von Wirkstoffkandidaten, die die homologe Rekombination modulieren. Dieser Ansatz erhöht die Vorhersagesicherheit in der frühen Entdeckungsphase, indem er die Proteinfunktion mit funktionellen DNA-Reparaturergebnissen verknüpft.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung des Rad51-vermittelten Strangwechsels, um therapeutische Zielstrukturen in DNA-Reparaturwegen zu validieren.
- Operativer Wert: Erlaubt die Aufklärung der Bildung und Reifung dreisträngiger DNA-Zwischenprodukte und klärt so den Wirkmechanismus von Hilfsproteinen wie Swi5-Sfr1.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die dreistufige kinetische Modellierung, wodurch die Zuverlässigkeit von Vorhersagen zur Zielstrukturenbindung und zur Modulation von Wegen verbessert wird.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantitative Fluoreszenzsignale, um die Kinetik des Strangwechsels unter variierenden Proteinbedingungen zu messen.
- Operativer Wert: Etabliert ein homogenes, lösungsbasiertes Testformat, das mit der spektrofluorometrischen Detektion für die Wirkstoffscreening kompatibel ist.
- Testtauglichkeit: Ermöglicht die Echtzeitüberwachung ohne Störung der Reaktion und unterstützt Dosis-Wirkungs- und Zeitverlaufsanalysen zur Bestätigung von Hits.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationeller Wert: Ermöglicht den vergleichenden Nachweis der Rekombinationsproteinaktivität über Arten hinweg und unterstützt die Übertragung von Modellsystemen auf humane Homologe.
- Mechanistische Ent风险bewertung: Unterscheidet die Wirkung von Hilfsproteinen auf spezifische Reaktionsschritte und verringert damit die Mehrdeutigkeit bei der zu mechanismenbasierten Biomarkern gehenden Zuordnung.
- Vorklinische Kontinuität: Stellt ein standardisiertes Verfahren zur Beurteilung der funktionellen Erhaltung von Rad51-Regulatoren über verschiedene Arten hinweg bereit und unterstützt so die Zielstrukturauswahl.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Entdeckungsprozess von der Target-Validierung bis zur Lead-Optimierung ein, wobei die kinetische Charakterisierung von DNA-Reparaturproteinen die Go/No-Go-Entscheidungen vor der präklinischen Investition maßgeblich beeinflusst.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung, indem quantifiziert wird, wie Swi5-Sfr1 die Reifung des Intermediats und die Freisetzung von Einzelstrang-DNA im Rad51-vermittelten Strangwechsel stimuliert.
- Screening: Liefert reproduzierbare, echtzeitfähige FRET-Signale, die den Vergleich der Wirkung von Inhibitoren oder Aktivatoren auf die Reaktionskinetik ermöglichen.
- Analytik: Stellt schrittenspezifische Geschwindigkeitskonstanten und Gleichgewichtskonstanten bereit, die einen quantitativen Vergleich von Proteinvarianten oder Bedingungen erlauben.
- Translationale Forschung: Ermöglicht die Beurteilung der evolutionären Konservierung, indem der Assay auf Rekombinationsproteine aus Säugetieren und Pflanzen angewendet wird.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Charakterisierung der Rekombinase-Aktivität und reduziert so redundante Assay-Entwicklungen über verschiedene Projekte hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung, indem vorübergehende Zwischenprodukte aufgeklärt und geschwindigkeitsbestimmende Schritte definiert werden.
- Operativer Wert: Liefert standardisierte, reproduzierbare kinetische Daten durch Echtzeit-Fluoreszenzüberwachung in einem kuvettenbasierten Format.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch von Projekten, indem quantifiziert wird, wie Hilfsproteine spezifische Schritte des Strangwechsels modulieren und damit mechanistische Unsicherheiten verringert werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung von DNA-Reparatur-Targets basierend auf quantitativen kinetischen Profilen und Daten zur evolutionären Konservierung.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Proteinaufreinigung, Fluoreszenzspektroskopie und kinetischen Datenanalyse.
- Setzt den Zugang zu einem temperaturgesteuerten Spektrofluorometer mit magnetischem Rührer und Spritzeninjektionsmöglichkeit voraus.
- Erfordert standardisierte Proteinpräparation, um Nuklease- und Helikase-Verunreinigungen auszuschließen, die die Interpretation der Reaktion beeinträchtigen könnten.
- Benötigt die Optimierung der Oligonukleotid-Markierung und -Konzentration für jede Zielart, um nachweisbare FRET-Signale sicherzustellen.
- Auf In-vitro-Systeme beschränkt; erfasst nicht die Chromatin- oder nukleären Kontexteffekte, die in vivo vorliegen.
