Verbesserung der hohen Viskosität Extrusion der Mikrokristalle für zeitaufgelöste serielle Femtosekunden Kristallographie an x-ray Laser

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um sicherzustellen, dass Probleme, die häufig bei zeitaufgelösten seriellen kristallographischen Experimenten auftreten, die Datenqualität nicht beeinträchtigen. Ein großer Vorteil dieser Methode ist ihre Anpassungsfähigkeit an einzelne Kristallsysteme. Der Hochgeschwindigkeitskamera-Extrusionstest ermöglicht es uns auch, die Extrusionsstabilität direkt zu messen.

Laden Sie zunächst 50 Mikroliter kristallbeladenes Monoolein-basiertes LCP in eine 100-Mikroliter-Spritze etwa 30 Minuten vor der Injektion. Zur Injektion in eine Vakuumumgebung fünf Mikroliter MAG 7.9 und fünf Mikroliter flüssiges Paraffin in den Rücken einer zweiten Spritze laden. Halten Sie die Spritze vertikal, vertreiben Sie die Luftblasen aus der Spritze.

Schließen Sie die Spritze mit MAG 7.9 und Paraffin an einen Standardspritzenkoppler an. Und spülen Sie die Luft aus der Kupplung, indem Sie sanft auf den Kolben drücken, bis ein kleines Volumen der Mischung an der Spitze der Kupplungsnadel sichtbar ist. Schließen Sie die Probenspritze an den Spritzenkoppler an, der das Auto nimmt, um keine Luft in die Probe einzuführen.

Mischen Sie das Lipid und Paraffin, indem Sie die Probe durch den Koppler mehrmals. Als nächstes 20 Mikroliter vorgemischtel LCP in eine weitere 100-Mikroliter-Spritze laden. Entfernen Sie die leere Spritze aus der Kupplung und befestigen Sie den vorgemischten LCP mit einem Standardspritzenkoppler an der kristallhaltigen Spritze.

Dann passieren Sie die Probe durch die Kupplung 100 Mal. Um die Probe in die kubische Phase zu bringen, fügen Sie drei Mikroliter Monoolein hinzu und mischen Sie 50 Mal. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis sich eine transparente Phase gebildet hat, um einen Überschuss an Monoolein zu vermeiden.

Als Vortest für Probensteifigkeit und Extrudierbarkeit, lösen Sie die leere Spritze aus dem Spritzenkoppler, und halten Sie die Spritze vertikal, drücken Sie eine kleine Menge Sampler durch den Koppler. Wenn die extrudierte Probe einen aufrechten Zylinder bildet, ist die Probe für extrusionsreife Tests bereit. Passen Sie das Gesamtvolumen der Probe auf 100 Mikroliter an, indem Sie mehr vorgemischteLCP hinzufügen.

Befestigen Sie die Probenspritze und zwei leere Spritzen an der Drei-Wege-Spritzenkupplung. Mindestens 50 Mal mischen, indem Sie die Hälfte der Probe in die zweite Spritze geben und dann beide Hälften der Probe gleichzeitig in die dritte Spritze drücken. Legen Sie die Spritze mit der gemischten Probe unter ein Stereomikroskop, um eine homogene Verteilung der Kristalle zu überprüfen.

Reinigen Sie eine HPLC-Pumpe und alle Wasserleitungen, um sicherzustellen, dass die Durchflussmengen genau sind. Reinigen Sie dann die hydraulische Stufe des Injektors. Schalten Sie als Nächstes die Kamera ein, und schließen Sie sie an die mitgelieferte Software an.

Mit einem Live-Video, das für visuelles Feedback läuft, positionieren Sie die Düsenspitze in der Mitte des Rahmens und bringen Sie sie mit der dreiachsigen Bühne in den Fokus. Legen Sie die Bildrate auf der Kamera auf 1.000 Bilder pro Sekunde fest. Legen Sie dann die Auflösung auf 512 x 512 Pixel fest.

Wenn die Belichtungszeit nun durch die Bildrate eingestellt ist, stellen Sie die Beleuchtungsstärke ein, bis die Düse sichtbar ist. Positionieren Sie die Düsenspitze so, dass sie nach links nach rechts zentriert ist und sich im oberen Drittel des Rahmens befindet. Richten Sie die Kamera im Zeitraffermodus ein.

Stellen Sie das Intervall auf 30 Sekunden und die Wiederholungen auf 40 Mal ein. Legen Sie den Triggermodus auf zufällig fest. Geben Sie die Anzahl der aufzuzeichnenden Frames auf 1 000 ein.

Laden Sie nun das Reservoir mit 20 Mikrolitern der Testprobe und befestigen Sie die Kapillardüse. Befestigen Sie das gefüllte Reservoir am Injektor. Befestigen Sie dann die Gasleitung am Anschluss an der Düse und starten Sie den Gasstrom.

Starten Sie anschließend gleichzeitig die Pumpe und die Kameraaufnahme. Überwachen Sie die Extrusion, bis der Pumpendruck in der Nähe der erwarteten Endzeit stark ansteigt. Beenden Sie dann die Aufnahme, schalten Sie die Pumpe ab, und entlüften Sie den Systemdruck, indem Sie das Entlastungsventil öffnen.

Öffnen Sie anschließend die Videodatei mit der Analysesoftware und kalibrieren Sie die Messwerkzeuge. Suchen Sie einen Frame im Video, in dem ein nachvollziehbares Feature in der Extrusion sichtbar ist. Zeichnen Sie die Framenummer auf.

Als Nächstes leiten Sie das Video zu einem Frame weiter, in dem dasselbe Feature sichtbar ist, sich aber im vorherigen Schritt von seiner Position verschoben hat. Zeichnen Sie die Framenummer auf. Messen Sie mit dem geraden Messwerkzeug den Abstand vom Start- und Endpunkt des Features mittels Analysemessung.

Wiederholen Sie die vorherigen Schritte einige Male für jedes Segment des Videos. Zeichnen Sie schließlich die Datenreihen. Das ideale Ausgangsmaterial für das hier beschriebene Verfahren sind hohe Dichten von Mikrokristallen, die in ein viskoses Trägermedium für den Injektor eingebaut sind.

Proteinkristalle wurden verwendet, um TRSFX-Daten über die Protonen gepumptBakterien Rhodopsin zu sammeln, die die ultraschnellen Veränderungen, die nach photonen Absorption auftreten offenbart. Nach der Probenvorbereitung mit einem Drei-Wege-Koppler zeigt die Visuelle Inspektion des Materials in der Spritze die Homogenität der Probe. Und Mikroskopbilder können die Dichte der Kristalle bestätigen.

Die Probe befindet sich in der kubischen Phase, wenn das Abgabemedium klar und zähflüssig ist. Trübungsmischungen sind ein Hinweis darauf, dass sich die Probe in einer Schwamm- oder Lamellenphase befindet, sind aber nicht schlüssig, da eine hohe Kristalldichte die Klarheit des LCP verschleiern kann. Ein Niederdrucktest zur Identifizierung der Schwammphase kann durchgeführt werden, indem der Spritzenkolben von der Probe weggezogen wird.

Während des Jet-Tests sollte die Probe eine lange kontinuierliche Spalte von LCP extrudieren, die sich mit einer nahezu konstanten Geschwindigkeit bewegt. Proben, die im Tropfmodus ausgeführt werden, zeigen an, dass die Viskosität zu niedrig ist. Daten aus Stichproben, die eine Spalte bilden, sollten zeigen, dass die Extrusion über einer minimalen Geschwindigkeit bleibt, die von den experimentellen Parametern diktiert wird.

Nach der Optimierung mit diesem Protokoll können serielle kristallographische Daten in einer Experteneinrichtung gesammelt werden. Dies wird die konformen Veränderungen im gesamten Protein offenbaren, während es seine Funktion erfüllt.