Name: Alveolären Makrophagen Phagozytose und Bakterien-Clearance bei Mäusen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Lernen Sie die Phagozytose-Funktion alveolärer Makrophagen bei Mäusen zu analysieren und die bakterielle Clearance aus der Lunge zu bewerten. Diese Methode nutzt in vitro und in vivo Techniken mit Pseudomonas aeruginosa.

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Diese Arbeit wird unterstützt durch Zuschuss R01HL116826 an X. Zhao.

Dieses Protokoll folgt den Richtlinien der institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der Eastern Virginia Medical School.
(1) fluoreszierenden Perlen Phagozytose
<ol><li>Die Maus einschläfern (C57BL/6J, 6 Wochen alt, weiblich) durch CO2 ersticken nach IACUC Protokolle für die ethische Euthanasie von Tieren.</li>
	<li>Legen Sie die Maus Belly-up auf eine Dissektion Board mit Küchenpapier bedeckt. Festzunageln Sie seine Pfoten mit seinen Gliedmaßen Spread-Eagle und Haken Sie eine Zeichenfolge unter seine Vorderzähne, seinen Kopf zurück, so dass die Luftröhre gerade ausgerichtet ist und Niveau.</li>
	<li>Nass, Kehle, Brust und Bauch mit 70 % Ethanol zur Desinfektion und verhindern, dass das Fell kleben an den Werkzeugen der Maus.</li>
	<li>Mit regelmäßigen Pinzette, ziehen Sie die Haut an der Mittellinie des Körpers, und schneiden mit chirurgische scheren sich die Mittellinie an die Spitze der Kehle.</li>
	<li>Mit dem stumpfen Ende standard Chirurgische Scheren, sorgfältig wegziehen von Muskel- und Bindegewebe an der Kehle und Feder Schere (Microscissors) verwenden, um die Luftröhre aussetzen.</li>
	<li>Einen Knorpel-Ring mit der Zange greifen, sorgfältig machen Sie einen kleinen Schnitt (~1.5 mm), mit Microscissors, auf die Herzkammer Gesicht der Luftröhre und legen Sie eine 18 G-Kanüle in der Luftröhre.</li>
	<li>Sanft Lavage 3 mL Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), 1 mL zu einem Zeitpunkt. Jedes Mal sanft zurückziehen die Flüssigkeit in der Spritze und beleben ihn zurück in die Lunge, 3 X in Folge. Nach dem Sammeln der BALF, führen Sie durch zervikale Dislokation um Euthanasie zu gewährleisten. Übertragen der gesammelten PBS (~2.8 mL), die alvéolaire Lavage Fluid (BALF) ist, zu einem Schlauch, Zentrifuge bei 1.000 x g für 10 min, und sammeln Sie das Pellet. Am Rohr und Zentrifuge bei 1.000 X g für 10 min waschen den Schmutz und sammeln die gebeizte alveolären Makrophagen fügen Sie 1 mL frisch PBS hinzu.</li>
	<li>Aufschwemmen Sie das Pellet in 2 mL Dulbeccos modifizierten Eagle Medium (DMEM) mit 10 % Nonheat-inaktivierten fetalen bovine Serum (FBS) und Kultur primäre alveoläre Makrophagen in den gleichen Medien für 2 Tage auf einem Glasboden Teller bei 37 ° C in eine feuchte Atmosphäre.</li>
	<li>Aspirieren Sie die alten Medien, waschen Sie es mit 1 mL PBS, und 2 mL frische Medien. Perlen Sie FITC (Carboxylated Latex Perlen, 2 µm im Durchmesser, 50 Perlen/Zelle) und inkubieren Sie für 1 h bei 37 ° C in eine feuchte Atmosphäre.</li>
	<li>Waschen Sie ausgiebig mit PBS (1 mL in einer Zeit, für eine Gesamtmenge von fünf Wäschen), um extrazelluläre Perlen zu entfernen. Bild 100 Zellen nach dem Zufallsprinzip und zählen Sie die Zellen mit intrazellulären Perlen (488 nm). Hinweis: Phagocytic Indizes sind die Anzahl der aufgenommenen Perlen dividiert durch die Gesamtzahl der Makrophagen. der Anteil der phagocytic Zellen ist die Anzahl von Makrophagen, die mindestens eine Perle dividiert durch die Gesamtzahl der Makrophagen16aufnehmen.<ol>
<li>Alternativ nach einer 1 h Inkubation mit Perlen, die Zellen mit 3 mL PBS waschen und für Durchflusszytometrie für die Quantifizierung der Phagozytose zu verarbeiten. In ähnlicher Weise verarbeiten Sie AMs ohne Perlen als ungefärbten Zellen oder Kontrolle. Berechnen Sie die prozentuale Positivität und meine Fluoreszenzintensität, mit Flow Cytometry Software, indem Sie diese Optionen in der Software auswählen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. FcγR - und CR-vermittelten Phagozytose
<ol><li>Inkubieren Sie für die Opsonization 2 x 108 Schafe roten Blutkörperchen (SRBCs) mit 50 µL Kaninchen Anti-SRBC-IgM oder 50 µL Kaninchen Anti-SRBC-IgG für 30 min bei Raumtemperatur11.</li>
	<li>Beheben Sie die Ergänzung Fragmente C3b und C3bi auf IgM-beschichtete SRBCs IgM opsonized SRBCs mit 50 µL Humanserum C5-defizienten (C5D) für 30 min bei 37 ° C inkubieren.</li>
	<li>Seed murinen Makrophagen Zellen (MH-S) (10.000 Zellen/Na) in eine 96-Well-Platte und inkubieren Sie es über Nacht um einen Zusammenfluss ~ 70 % zu erhalten. Fügen Sie 100 µL 1 x 107/mL opsonized SRBCs in jede Vertiefung der MH-S Zellen und 1 h bei 37 ° c inkubieren Wash ungebunden SRBCs sehr schnell (~ 1 min) mit 100 µL Ammoniumchlorid-Kalium (ACK) Lysis Puffer.</li>
	<li>Lösen Sie die Zellen mit 0,1 % SDS und fügen Sie 50 µL 2,7-Diaminofluorene (DAF), 3 % Wasserstoffperoxid und 6 M Harnstoff enthält. Messen Sie die Absorption der Hämoglobin-katalysierte Fluorene blau Bildung bei 620 nm.</li>
	<li>Bestimmen Sie die Anzahl der SRBCs mithilfe einer Standardkurve bei 620 nm Absorption Werte mit einer bekannten Anzahl von SRBCs. In ähnlicher Weise inkubiert Prozess MH-S Zellen mit nonopsonized SRBCs, als negative Kontrollen zu verwenden.</li>
</ol>(3) PRR-vermittelten Phagozytose
<ol><li>Schritte 1.1-1.9 für die Isolierung und Kultivierung von Maus primäre alveoläre Makrophagen.</li>
	<li>Entfernen Sie nach 2 Tagen das Medium, die Zellen mit 1 mL PBS waschen und 500 µL frisches Medium mit Alexa Fluor-488-konjugiert Zymosan-A Bioparticles (100 Partikel/Gericht) hinzufügen.</li>
	<li>1 h bei 37 ° c inkubieren Stoppen Sie die Phagozytose durch Zugabe von 500 µL eiskaltem PBS.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen ausführlich mit PBS (1 mL in einer Zeit, für eine Gesamtmenge von fünf Waschungen). Befestigen Sie die Zellen mit 4 % Paraformaldehyd für 10 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Waschen der Zellen ausführlich mit PBS (1 mL in einer Zeit, für eine Gesamtmenge von fünf Wäschen) und halten Sie die Zellen in 500 µL PBS.</li>
	<li>Bild der Zellen unter differential Interferenz-Kontrast und einem fluoreszierenden Kanal bei 488 nm. Zählen Sie AMs mit Zymosan-A Bioparticles und bestimmen Sie den Prozentsatz der Phagozytose.</li>
</ol>4. in Vivo Phagozytose durch alveoläre Makrophagen
Hinweis: p. Aeruginosa GFP auf Nähragar Teller zu impfen und über Nacht die Platte bei 37 ° C inkubieren. Am nächsten Tag impfen Sie die einzige Kolonie bis 2 mL der Nährbouillon und wachsen Sie die Bakterien bei 37° C über Nacht.
<ol><li>Am nächsten Tag zu betäuben Mäuse mit einem intraperitonealer Verabreichung von 100 mg/kg Ketamin und 10 mg/kg Xylazin. Richtige Anesthetization über eine fehlende Reaktion auf die Zehe Prise zu bestätigen.</li>
	<li>Legen Sie die Maus auf ein flaches Brett mit einem Gummiband über die oberen Schneidezähne und positionieren Sie es semirecumbent (45°) mit der ventralen Oberfläche und Tribüne nach oben zeigt. Mit gebogenen Pinzette, teilweise zurückziehen der Zungenkrebs. Mit einem Mikrosprayer, Intratracheally 50 µL (5 x 106 Koloniebildenden Einheiten [CFU])17 von p. Aeruginosa GFP in die Lungen der narkotisierten Mäuse verwalten.</li>
	<li>Nach 1 h von Infektion Schritte 1,1-1,7.</li>
	<li>Aufschwemmen der Zellen in PBS und Cytocentrifuge sie (1.000 X g, 1 min bei Raumtemperatur) auf einen Objektträger.</li>
	<li>Differentiell Fleck der Cytospin Folien für alveolären Makrophagen, neutrophilen Granulozyten und Lymphozyten, gemäß den Anweisungen des Herstellers.</li>
	<li>Nach dem Zufallsprinzip wählen Sie 100 AMs, zählen Sie das AMs, die intrazelluläre Bakterien, und den Prozentsatz der Phagozytose.</li>
</ol>5. in Vivo Bakterien Clearance mittels p. Aeruginosa
<ol><li>P. Aeruginosa auf eine Agarplatte p. Aeruginosa Isolierung zu impfen und über Nacht die Platte bei 37 ° C inkubieren. Impfen Sie die einzige Kolonie bis 2 mL Lysogeny Brühe (LB) zu und wachsen Sie die Bakterien bei 37° C über Nacht. Berechnen Sie die KBE, mithilfe der folgenden Formel. KBE/mL = (Anzahl der Kolonien x Verdünnungsfaktor) / Volumen der Kultur-Platte. Die Kultur mit PBS der gewünschten KBE/mL zu verdünnen.</li>
	<li>In Studie 1 Intratracheally injizieren eine subletale Dosis von ~2.5 X 105 KBE/mL p. Aeruginosa in narkotisierten Wildtyp (WT) und TRIM72KO Mäusen, wie in Schritt 4.2 angegeben. Messen Sie das Körpergewicht täglich für 6 Tage.</li>
	<li>Spritzen Sie in Studie 2 eine zweite Dosis von p. Aeruginosa (5 x 105 KBE/mL) in die Mäuse, die in Studie 1 überlebt und das Körpergewicht für 4 Tage zu messen.</li>
	<li>Injizieren Sie in Studie 3, einen anderen Satz von Mäusen WT und TRIM72KO Mäusen mit einer tödlichen Dosis (3 x 107 KBE/mL) von p. Aeruginosa zu und erfassen Sie die Sterblichkeit innerhalb 2 Tagen nach der Injektion. Tiere Anzeichen von schweren Belastungen, wie bedeutende Körper-Gewicht-Verlust, wird durch die behandelnden Tierärzte Rundrücken, Magersucht oder Dyspnoe beurteilt werden. Sofort werden unheilbar Tiere geopfert werden.</li>
	<li>Bei Tod oder nach Euthanasie am 2. Tag nach der Injektion sammeln Sie das ganze Lungengewebe für die Quantifizierung der Lunge bakterielle Belastung am Gipfel Infektion.</li>
	<li>Um die bakterielle Belastung der Lunge zu testen, das Lungengewebe 200 µL des normalen Kochsalzlösung hinzu und homogenisieren sie, mit einer zuvor getesteten Einstellung auf eine elektronische Homogenisator, die völlig das Lungengewebe stört ohne Bakterien. Passen Sie das Gesamtvolumen der Lunge Homogenat zu 1 mL und Platte 100 µL der Lunge lysate auf Pseudomonas isoliert Agarplatten bei 10-divisibel serielle Verdünnungen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Platten bei 37 ° C für 24 h und zählen Sie die Bakterienkolonien um die KBE pro ganze Lunge festzustellen.</li>
</ol>6. statistische Analyse
<ol><li>Verwenden des Student t-Test, um die statistische Signifikanz der Differenz zwischen den beiden Gruppen festzustellen. Einen Unterschied als statistisch signifikant überlegen p < 0,05. Alle Daten werden dargestellt als ± Standardfehler des Mittelwertes (SEM) bedeutet.</li>
</ol>

<ol><li>Hussell, T., Bell, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophages%3A+plasticity+in+a+tissue-specific+context%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophages: plasticity in a tissue-specific context.</a> Nature Reviews Immunology. 14, 81-93 (2014).</li>
<li>Belchamber, K. B. R., Donnelly, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+Dysfunction+in+Respiratory+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Results+and+Problems+in+Cell+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Macrophage Dysfunction in Respiratory Disease.</a> Results and Problems in Cell Differentiation. 62, 299-313 (2017).</li>
<li>Broug-Holub, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophages+are+required+for+protective+pulmonary+defenses+in+murine+Klebsiella+pneumonia%3A+elimination+of+alveolar+macrophages+increases+neutrophil+recruitment+but+decreases+bacterial+clearance+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophages are required for protective pulmonary defenses in murine Klebsiella pneumonia: elimination of alveolar macrophages increases neutrophil recruitment but decreases bacterial clearance and survival.</a> Infection and Immunity. 65, 1139-1146 (1997).</li>
<li>Knapp, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophages+have+a+protective+antiinflammatory+role+during+murine+pneumococcal+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophages have a protective antiinflammatory role during murine pneumococcal pneumonia.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 167, 171-179 (2003).</li>
<li>Bhatia, M., Zemans, R. L., Jeyaseelan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+chemokines+in+the+pathogenesis+of+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Role of chemokines in the pathogenesis of acute lung injury.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46, 566-572 (2012).</li>
<li>Marriott, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1beta+regulates+CXCL8+release+and+influences+disease+outcome+in+response+to+Streptococcus+pneumoniae%2C+defining+intercellular+cooperation+between+pulmonary+epithelial+cells+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1beta regulates CXCL8 release and influences disease outcome in response to Streptococcus pneumoniae, defining intercellular cooperation between pulmonary epithelial cells and macrophages.</a> Infection and Immunity. 80, 1140-1149 (2012).</li>
<li>Greenlee-Wacker, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+apoptotic+neutrophils+and+resolution+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Clearance of apoptotic neutrophils and resolution of inflammation.</a> Immunological Reviews. 273, 357-370 (2016).</li>
<li>Haslett, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulocyte+apoptosis+and+its+role+in+the+resolution+and+control+of+lung+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Granulocyte apoptosis and its role in the resolution and control of lung inflammation.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 160, 5-11 (1999).</li>
<li>Cox, G., Crossley, J., Xing, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+engulfment+of+apoptotic+neutrophils+contributes+to+the+resolution+of+acute+pulmonary+inflammation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Macrophage engulfment of apoptotic neutrophils contributes to the resolution of acute pulmonary inflammation in vivo.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 12, 232-237 (1995).</li>
<li>Groves, E., Dart, A. E., Covarelli, V., Caron, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+phagocytic+uptake+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of phagocytic uptake in mammalian cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 65, 1957-1976 (2008).</li>
<li>Mosser, D. M., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Opsonic+Phagocytosis+via+Fc%CE%B3+Receptors+and+complement+receptors+on+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Measuring Opsonic Phagocytosis via Fcγ Receptors and complement receptors on macrophages.</a> Current Protocols in Immunology. , CHAPTER: Unit-14.27 (2011).</li>
<li>He, J. Q., Wiesmann, C., van Lookeren Campagne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+of+macrophage+complement+receptor+CRIg+in+immune+clearance+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">A role of macrophage complement receptor CRIg in immune clearance and inflammation.</a> Molecular Immunology. 45, 4041-4047 (2008).</li>
<li>Nagre, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Macrophage+Complement+Receptor+CRIg+by+TRIM72+Polarizes+Innate+Immunity+of+the+Lung%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Macrophage Complement Receptor CRIg by TRIM72 Polarizes Innate Immunity of the Lung.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 58 (6), 756-766 (2018).</li>
<li>Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Method+to+Determine+the+Engulfment+of+Apoptotic+Cells+by+Macrophages+using+pHrodo+Succinimidyl+Ester%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A Novel Method to Determine the Engulfment of Apoptotic Cells by Macrophages using pHrodo Succinimidyl Ester.</a> Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).</li>
<li>Su, H., Chen, H., Jen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+exercise+enhances+phagocytosis+by+murine+bronchoalveolar+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Severe exercise enhances phagocytosis by murine bronchoalveolar macrophages.</a> Journal of Leukocyte Biology. 69, 75-80 (2001).</li>
<li>Amiel, E., Lovewell, R. R., O'Toole, G. A., Hogan, D. A., Berwin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa.+evasion+of+phagocytosis+is+mediated+by+loss+of+swimming+motility+and+is+independent+of+flagellum+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa. evasion of phagocytosis is mediated by loss of swimming motility and is independent of flagellum expression.</a> Infection and Immunity. 78, 2937-2945 (2010).</li>
<li>Giannoni, E., Sawa, T., Allen, L., Wiener-Kronish, J., Hawgood, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surfactant+Proteins+A+and+D+Enhance+Pulmonary+Clearance+of+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Surfactant Proteins A and D Enhance Pulmonary Clearance of Pseudomonas aeruginosa.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34, 704-710 (2006).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Während der Durchführung einer Gas-Austausch-Funktion, konfrontiert die Lunge anhaltend Fremdkörper, Krankheitserreger und Allergene. AMs bieten die erste Linie der Verteidigung aufgrund ihrer wichtigsten Funktion, nämlich Phagozytose. AMs auch mit anderen Immunzellen in der Krankheitserreger zu zerstören und die Auflösung der Entzündung zu koordinieren. Hier beschrieben wir Methoden zur Bewertung der speziell Phagozytose durch AMs isoliert von der Maus-Lunge. Das Protokoll präsentiert in diesem Manuskript erklärt, eine ...

AMs sind die wichtigsten Residenten Fresszellen in die Alveolen in der Ruhephase und einer der Hauptakteure der angeborenen Immunantwort durch die Anerkennung und Internalisierung der eingeatmete Krankheitserreger und Fremdkörper1,2. Es wurde berichtet, dass AMs unerlässlich für die schnelle Abfertigung von vielen pulmonale Krankheitserreger wie p. Aeruginosa und Klebsiella Pneumonie3,4, sind also ein Mangel an AM Phagozytose oft in die Atemwege führt Infektionen, wie z. B. akute Lungenentzündung, die höhere Mortalität und Morbidität führen.
AMs initiieren auch angeborene Entzündungsreaktionen in der Lunge durch die Herstellung Zytokine und Chemokine wie TNF-α und IL-1β, welche Übersprechen mit anderen Zellen der alveolären Umwelt produzieren Chemokine und entzündliche Neutrophilen, Monozyten, rekrutieren und Adaptive Immunzellen in der Lunge5. Zum Beispiel hilft IL-1β von AMs produziert die Freisetzung von Neutrophilen Chemokin CXCL8 aus Epithelzellen6Prime. Darüber hinaus tragen AMs zur Phagozytose des apoptotischen polymorphkernige Leukozyten (PMNs), was dazu führt, das nachhaltige Austreten von intrazellulären Enzyme von PMNs Nichtbeachtung umliegendes Gewebe, wodurch Gewebeschäden und längerer Entzündung 7 , 8 , 9.
Phagozytose durch das AMs wird durch eine direkte Anerkennung der Pathogen-assoziierte molekulare Muster auf der Oberfläche der Erreger durch die Muster-Anerkennung-Rezeptoren (PRRs) des AMs oder durch die Bindung von opsonized Krankheitserreger mit immun-Effektor-Rezeptoren des AMs vermittelt. 10. für Letzteres AMs erkennt die Ziele mit Immunglobulin (IgG) opsonized durch ihre Fcγ Rezeptoren (FcγR) oder die Erreger beschichtet mit Ergänzung Fragmente, C3b und C3bi, durch deren Komplement-Rezeptoren (CR)11. Unter Ergänzung Rezeptoren die CR die Immunglobulin-Superfamilie (CRIg) drückt sich selektiv im Gewebe Makrophagen12und den letzten Feststellung hob die Rolle der CRIg in AM Phagozytose im Zusammenhang mit p. Aeruginosa Lungenentzündung 13.
Viele Originalstudien verwenden Methoden, um Makrophagen Phagozytose um zu beschreiben, die molekularen Mechanismen der Makrophagen Funktion14,15zu bewerten. Methoden wie in-vivo Phagozytose erfordern jedoch eine präzise Quantifizierung der Phagozytose. Hier fassen wir eine detaillierte Methode für in-vitro- und in-vivo Phagozytose mit Fluorescein erfolgt (FITC)-Glas Perlen und p. Aeruginosa grün fluoreszierenden Proteins (GFP), beziehungsweise. Darüber hinaus erläutern wir die Methode der Unterscheidung zwischen PRR, CR und FcγR vermittelt Phagozytose. Zu guter Letzt berichten wir über eine Methode, um bakterielle Clearance bei Maus in Bezug auf p. Aeruginosa Lungenentzündung zu charakterisieren.

<table><tbody><tr><td>18-G-Nadel</td><td>Nipro Medical&nbsp;</td><td>CI+1832-2C</td><td>Molekularbiologie Klasse</td></tr><tr><td>2,7-Diaminofluoren (DAF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D17106</td><td>Molekularbiologie Klasse</td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td>Decon Labs Inc.</td><td>18C27B</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Platte</td> in analytischer Qualität <td>Corning</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>ACK-Lysepuffer</td> in Zellbiologiequalität <td>Life Technologies</td><td>A10492</td><td>Molekularbiologie</td></tr><tr><td>Alexa Fluor-488 Zymosan-A-Biopartikel</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Z23373</td><td>Molekularbiologie Klasse</td></tr><tr><td>C5 mangelhaftes Serum&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1163</td><td>Biochemische Reagenzienzentrifuge</td></tr><tr><td></td><td>Labnet International</td><td>C0160-R</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin 4 Zytozentrifuge</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A78300101 Ausgabe 11</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Zellkulturmedien</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>Zellbiologie</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td>Zellbiologie</td></tr><tr><td>Qualität Durchfluss Zytometer</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSCalibur</td><td></td></tr><tr><td>Flow Jo Software</td><td>FlowJo, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Dumont</td><td>0508-SS/45-PS-1</td><td>Geeignet für die Dissektion von Labortieren</td></tr><tr><td>FITC-carboxylierte Latexkügelchen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4530</td><td>Zellbiologie</td></tr><tr><td>Qualität GFP-P. aeruginosa</td><td>ATCC</td><td>101045GFP</td><td>Geeignet für&nbsp; Assays für Zellinfektionen</td></tr><tr><td>Glasbodenschale</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35G-0.170-14-C</td> Hochdruckspritze <td>in Zellbiologiequalität</td></tr><tr><td></td><td>Penn-Century</td><td>FMJ-250</td><td>Geeignet für den Einsatz bei Labortieren</td></tr><tr><td>Homogenisator</td><td>Omni International</td><td>TH-01</td><td></td></tr><tr><td>Wasserstoffperoxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>Inverses Fluoreszenzmikroskop</td> in analytischer Qualität <td>Olympus</td><td>IX73</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin Hydrochlorid</td><td>Hospira</td><td>CA-2904</td><td></td></tr><tr><td>Shandon Kwik-Diff Flecken</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>9990700</td><td>Zellbiologie Qualität</td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Fisher</td><td>Scientific BP1425</td><td>Molekularbiologie</td></tr><tr><td>Qualität LB Bouillon</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1427</td><td></td></tr><tr><td>Molekularbiologie Qualität MicroSprayer Aerosolizer</td><td>Penn-Century</td><td>IA-1C</td><td>Geeignet für den Einsatz bei Labortieren</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Reagenzqualität</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>20012-027</td><td>Kaninchen in Zellbiologiequalität</td></tr><tr><td>Anti-SRBC-IgG&nbsp;</td><td>MP Biomedicals</td><td>55806</td><td>Geeignet für Immunoassays</td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-SRBC-IgM&nbsp;</td><td>Cedarline Laboratories</td><td>CL9000-M</td><td>Geeignet für Immunoassays</td></tr><tr><td>Schere</td><td>Miltex</td><td>5-2</td><td>Geeignet für die Dissektion</td></tr> von <tr><td>Labortieren Laryngoskop für Kleintiere</td><td>Penn-Century</td><td>LS-2</td><td>Geeignet für den Einsatz bei Labortieren</td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat (SDS)</td><td>BioRad</td><td>1610301</td><td>Federschere in analytischer Qualität</td></tr><tr><td>(Med)</td><td>Feinwissenschaftliche Werkzeuge</td><td>15012-12</td><td>Geeignet für das Sezieren</td></tr> von <tr><td>Labortieren Federschere (klein)</td><td>Fine Science Tools</td><td>91500-09</td><td>Geeignet für das Sezieren</td></tr> von <tr><td>roten Blutkörperchen (SRBCs) von Schafen im Labortier&nbsp;</td><td>MP Biomedicals</td><td>55876</td><td>Gewaschene, konservierte SRBCs</td></tr><tr><td>Harnstoff</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5378</td><td>Xylazin in molekularbiologischer Qualität</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Akorn Animal Health</td><td>59399-110-20</td><td>Pharmazeutische Qualität</td></tr></tbody></table>

alveolären makrophagen phagozytose und bakterien-clearance bei mäusen

Alveolar Macrophage Phagocytosis and Bacteria Clearance in Mice

Alveoläre Makrophagen (AMs) bewachen den alveolären Raum der Lunge. Phagozytose durch AMs spielt eine entscheidende Rolle bei der Verteidigung gegen eindringende Krankheitserreger, die Entfernung von abgestorbenen Zellen oder Fremdkörper, und bei der Lösung von Entzündungsreaktionen und Umbau-Gewebe verarbeitet, die durch verschiedene Oberflächen-Rezeptoren vermittelt werden Das AMs. Hier berichten wir über Methoden zur Analyse der phagocytic Funktion des AMs mit in-vitro- und in-vivo-Tests und experimentelle Strategien um zu unterscheiden, die Muster-Anerkennung-Rezeptor - Komplement-Rezeptor- und Fc-Gamma-Rezeptor-vermittelten Phagozytose. Schließlich diskutieren wir eine Methode zu etablieren und zu charakterisieren ein p. Aeruginosa Lungenentzündung Modell bei Mäusen zu in-vivo bakterielle Abstand beurteilen. Diese Tests sind die am häufigsten verwendeten Methoden, AM Funktionen zu bewerten und können auch zur Funktion der Makrophagen und bakterielle Spiel in andere Organe zu studieren.

Zuerst führten wir das Experiment zu analysieren, Phagozytose per Mausklick primäre AMs. Während alle Analysen verglichen wir AMs von WT und TRIM72KO Mäusen isoliert. Wie in Abbildung 1Adargestellt, offenbart Fluoreszenz-Mikroskopie die Phagozytose von FITC-Glasperlen von Maus primären AMs tritt nach 1 h Inkubation. Abbildung 1 B zeigt die Auswertung der Phagozytose durch Durchflusszyt...

Hier berichten wir über gemeinsame Methoden für die Analyse der phagocytic Funktion der murinen alveolären Makrophagen und bakterielle Freiraum aus der Lunge. Diese Methoden studieren in-vitro-Phagozytose von Fluorescein Herstellung Perlen und in-vivo Phagozytose von Pseudomonas Aeruginosa Green Fluorescent Protein. Wir beschreiben auch eine Methode für das clearing von p. Aeruginosa bei Mäusen.

Alveolären Makrophagen Phagozytose und Bakterien-Clearance bei Mäusen

Alveolar macrophages (AMs) guard the alveolar space of the lung. Phagocytosis by AMs plays a critical role in the defense against invading pathogens, the ...

Pseudomonas aeruginosa ist ein BSL-2-Level-Erreger. Denken Sie daran, alle Sicherheitspraktiken auf BSL-2-Ebene zu befolgen, wenn Sie mit diesem Organismus umgehen. Hier zeigen wir primäre Zellisolation, In-vitro-Phagozytose und phagozytische Signalweganalyse sowie in vivo Phagozytose und bakterielle Clearance-Bewertung bei Mäusen.Erfolgreiche intratracheale Lieferung erfordert Praxis zu meistern. Stellen Sie sicher, dass der Microsprayer richtig geladen ist, die Nadel zwischen den beiden Stimmfalten liegt und die Kolbengeschwindigkeit richtig gesteuert wird. Beginnen Sie, indem Sie die Maus in der Rückenlage mit den Gliedmaßen auf einer mit Papiertüchern bedeckten Sezierplatte sichern und eine Schnur unter den Vorderzähnen einhaken, um den Kopf so zurückzuziehen, dass die Luftröhre gerade und eben positioniert ist.Desinfizieren Sie die Maus mit 70% Ethanol und verwenden Sie regelmäßige Zangen, um die Haut an der Mittellinie des Körpers hochzuziehen. Verwenden Sie eine chirurgische Schere, um die Haut vom Bauch bis zur Oberseite des Halses zu schneiden. Verwenden Sie das stumpfe Ende der Standard-Chirurgischen Schere, um den Halsmuskel und das Bindegewebe sorgfältig zu sezieren.Öffnen Sie die Bauchwand unter dem Brustkorb. Schneiden Sie das Zwerchfell und schneiden Sie den unteren Teil des Brustkorbs weg, um die Lunge teilweise freizulegen. Verwenden Sie eine Federschere, um die Luftröhre freizulegen, und verwenden Sie die Zange, um einen Knorpelring zu greifen.Verwenden Sie Mikroscheren, um sorgfältig einen etwa 1,5-Millimeter-Schnitt auf der ventralen Fläche der Luftröhre zu machen. Eine kurze Länge des Nahtgewindes vorsichtig unter die Luftröhre spannen und eine 18 Gauge Kanüle in die Luftröhre einlegen. Wenn die Kanüle an Ort und Stelle ist, spülen Sie die Lunge dreimal mit einem Milliliter frischer PBS pro Wäsche, und ziehen Sie die Flüssigkeit vorsichtig in die Spritze zurück, bevor Sie sie dreimal hintereinander wieder in die Lunge einfließen lassen.Nach jeder Spülung die gesammelte Bronchoalveolar-Spülflüssigkeit oder BALF in ein 15-Milliliter-Konusrohr zur Zentrifugierung der gesamten geernteten Flüssigkeit übertragen. Setzen Sie das Pellet in einem Milliliter frischer PBS für eine zweite Zentrifugation wieder aus und setzen Sie die gewaschenen Alveolarmakrophagen in zwei Milliliter von Dulbeccos Modified Eagles Medium oder DMEM ab, ergänzt mit 10%nicht-hitzeaktiviertem fetalaktiviertem Rinderserum. Dann übertragen Sie die primären Alveolar-Makrophagen auf eine Glasboden-Petrischale für ihre zweitägige Kultur bei 37 Grad Celsius in einem Zellbrutkasten.Nach 48 Stunden die Kultur mit einem Milliliter PBS waschen, bevor Sie die Kultur mit zwei Millilitern frischem Medium füttern. Als nächstes fügen Sie 50 zwei Mikrometer Durchmesser carboxylierte Latex FITC-konjugierte Perlen pro Zelle in die Kultur für eine einstündige Inkubation bei 37 Grad Celsius in einem Zell-Inkubator. Am Ende der Inkubation, waschen Sie die Platte ausgiebig fünf Mal mit einem Milliliter frische PBS pro Wäsche, um die extrazellulären Perlen zu entfernen und zufällig 100 Zellen zu bilden, um die Zellen zu zählen, die intrazelluläre Perlen enthalten.Für einen Opsonisationstest zwei Mal 10 bis zum achten Schaf rote Blutkörperchen oder SRBCs mit 50 Mikroliter Kaninchen Anti-SRBC Immunglobulin M oder IgM für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Dann inkubieren Sie die opsonisierten SRBCs mit 50 Mikrolitern C5-mangelhaftem humanem Serum für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius, um die C3b- und C3b-Inhibitoren zu reparieren, die Fragmente auf den IgM-beschichteten SRBCs ergänzen. Als nächstes aspirieren Sie die Medien und fügen Sie 100 Mikroliter von einem mal 10 zu den sieben opsonisierten SRBCs pro Milliliter Medium zu jedem Brunnen einer 96-Well-Platte hinzu, die ein mal 10 zu den vierten über Nacht kultivierten murinen Makrophagen pro Brunnen enthält.Inkubieren Sie die SRBC-Mausmakrophagen-Kokultur für eine Stunde bei 37 Grad Celsius und entfernen Sie dann die ungebundenen SRBCs, indem Sie mit 100 Mikroliter ammoniumchloridkaliumlysepuffer für eine Minute waschen. Nachdem die ungebundenen SRBCs entfernt wurden, spülen Sie mit 100 Mikroliter Medien ab. Lyse die verbleibenden Zellen mit 0,1%Natriumdodecylsulfat und behandeln die Lysate mit 50 Mikroliter 2, 7-Diaminofluoren ergänzt mit 3%Wasserstoffperoxid und sechs Molharnstoff.Messen Sie dann die Absorption der hämoglobinkatalysierten Fluorenblaubildung auf einem Spektralphotometer bei 620 Nanometern. Verwenden Sie eine Standardkurve bei 620 Nanometer Absorptionswerten mit bekannter Anzahl von SRBCs, um die Anzahl der opsonisierten SRBCs zu bestimmen, die phagozytisiert sind. Um die von Mustererkennungsrezeptor-vermittelte Phagozytose zu bewerten, waschen Sie zweitägige kultivierte Maus-Primär-Alveolar-Makrophagen mit einem Milliliter PBS und behandeln Sie die Zellen mit 500 Mikroliter frischem Medium, das 100 Alexa Fluor-488 konjugierte Zymosan-A-Biopartikel enthält.Nach einer Stunde bei 37 Grad Celsius die Phagozytose mit 500 Mikrolitereeis PBS festnehmen und die Zellen fünfmal mit einem Milliliter PBS pro Waschgang ausgiebig waschen. Nach der letzten Wäsche die Zellen mit 4% Paraformaldehyd für 10 Minuten bei Raumtemperatur fixieren und die Zellen fünfmal waschen, wie gezeigt. Nach der letzten Wäsche die Zellen mit 500 Mikrolitern frischer PBS für die Bildgebung unter Differentialinterferenzkontrast und Fluoreszenzkanal bei 488 Nanometern abdecken, um die Anzahl der Zymosan-A-Biopartikel-haltigen Alveolarmakrophagen zu quantifizieren.Für in vivo alveolar Makrophagozytose-Auswertung, bestätigen Sie das angemessene Niveau der Sedierung durch mangelnde Reaktion auf Zehenkneifen in einer anästhesierten Maus und legen Sie die Maus auf einem flachen Brett mit einem Kunststoffdraht unter den oberen Schneidezähnen. Legen Sie die Maus in eine halb liegeförmige Tribüne in 45-Grad-Position mit der ventralen Oberfläche nach oben und verwenden Sie gekrümmte Zangen, um die Zunge herauszuziehen und zu unterdrücken. Dann legen Sie einen Mikrosprayer zwischen den Stimmfalten ein, um 50 Mikroliter von fünf mal 10 in die Lunge des anästhesierten Tieres zu verabreichen.Um zu bestätigen, dass sich die Mikrosprühnadel in der Luftröhre befindet, bewegen Sie die Spritze vorsichtig und beobachten Sie die Stimmfalten auf beiden Seiten der Nadel. Eine Stunde nach der Infektion, sammeln Sie die Spülflüssigkeit, wie gerade gezeigt und Pellet der Alveolar Makrophagen durch Zentrifugation. Setzen Sie ein mal 10 bis zu den dritten Zellen in 100 Mikrolitern frischer PBS für Zytozentrifuge auf eine Glasrutsche.Dann differenziell flecken die zytospun Dias für Alveolar Makrophagen, Neutrophile, und Lymphozyten, nach den Standard histochemischen Protokollen. Wählen Sie nach dem Zufallsprinzip 100 alveolare Makrophagen aus, um den Prozentsatz der Zellen zu quantifizieren, die bakterien phagozytosiert haben. In der ersten In-vivo-Bakterien-Clearance-Studie intratracheal injizieren eine subletle Dosis von etwa 2,5 bis fünf mal 10 die fünfte koloniebildende Einheiten pro Milliliter P.aeruginosa in anästhesisierte wildArt und mutierte Mäuse und messen das Körpergewicht jedes Tieres jeden Tag für sechs Tage.In der zweiten Studie injizieren Sie einen neuen Satz von wilden und mutierten Mäusen mit einem tödlichen dreimal 10 zu den sieben koloniebildenden Einheiten pro Milliliter Dosis von P.aeruginosa und erfassen Sie die Sterblichkeit innerhalb von zwei Tagen nach einer Injektion, wobei das gesamte Lungengewebe zum Zeitpunkt des Todes oder zwei Tage nach der Injektion zur Quantifizierung der Lungenbakterienbelastung bei Einer Spitzeninfektion gesammelt wird. Nach der Ernte der Lunge die Lungenproben in kleine Stücke auf Eis schneiden und die Lungenfragmente mit einer angepassten elektrischen Homogenisator-Einstellung homogenisieren. Dann Platte 100 Mikroliter Homogenat auf Pseudomonas Isolation Agar Platten in 10-fach seriellen Verdünnungen.Die Fluoreszenzmikroskopie zeigt, dass die primäre alveolare Makrophagenphagozytose der FITC-Latexperlen nach einer Stunde Inkubation auftritt, wobei TRIM72-Knockout-Makrophagen eine signifikant höhere phagozytische Fähigkeit zeigen. Umgekehrt führt die Überexpression von TRIM72, einem Protein mit unbekannter Funktion in murinen Makrophagenzellen, zu einer mehr als fünffachen Abnahme der Komplementphagozytose. Alexa fluor-488 konjugierte Zymosan-A-Partikel werden jedoch in gleicher Menge durch primäre Alveolar-Makrophagen aufgenommen, die entweder von Wild-Typ- oder Knockout-Mäusen isoliert werden.Die Differenzfärbung von BALF, die von wilden Typ- und Knockout-Tieren geerntet wird, zeigt eine ähnliche Anzahl von Makrophagen, aber eine höhere phagozytische Fähigkeit für die Makrophagen, die von Knockout-Mäusen geerntet werden. Darüber hinaus zeigen TRIM72 Knockout-Mäuse eine schnellere Erholung ihrer Körpergewichte, halten ihr Überleben aufrecht und weisen eine geringere bakterielle Belastung auf als Wildtiere nach der verabreichung von P.aeruginosa. Mit dieser Technik können andere phagozytische Prozesse analysiert werden, die für die Lungenentzündung wichtig sind, wie z. B. die neutrophile Phagozytose und der relative Beitrag anderer Phagozyten bei der Bakterienclearance.In Kombination mit pharmakologischen Inhibitoren, adaptivem Transfer und transgenen Tieren kann diese Technik Forschern helfen, die molekulare Komponente bestimmter Phagozytose-Typen für die Phagozyten von Interesse zu erforschen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Hier beschreiben wir Protokolle zum Ernten von murinen Alveolarmakrophagen, die ihren Sitz angeborenen Immunsystems Zellen in der Lunge und Prüfung ihrer Aktivierung in Reaktion auf Co-Kultur mit Polyanhydrid Nanopartikel.

Ernte Murine Alveolarmakrophagen und Auswerten zelluläre Aktivierung von Polyanhydrid Nanopartikel Induced

Makrophagen spielen eine zentrale Rolle bei der Homöostase und Pathologie in vielen Geweben. Das Protokoll beschreibt hier vorgestellte Verfahren zur Abreicherung von...

Depletion und Rekonstitution von Makrophagen in Mäuse

Quelle: Nagre, N., et al. Phagozytose und Bakterienbeseitigung der Alveolaren Makrophagen bei Mäusen. J. Vis. Exp. (2019).Dieses Video zeigt die Bewertung der komplementrezeptorvermittelten Phagozytose mit roten Blutkörperchen von Schafen, die mit IgM und Komplement opsonisiert sind, gefolgt von deren Aufnahme durch Mausmakrophagen. Das Ausmaß der Phagozytose wird quantifiziert, indem ein blaues chromogenes Produkt gemessen wird, das durch hämoglobinkatalysierte Oxidation von Diaminofluoren...

Modellierung komplement-vermittelter Phagozytose unter Verwendung von opsonisierten roten Blutkörperchen in vitro

Nehmen Sie eine adhärente Kultur von Maus-Makrophagen.Behandle den Test gut mit einem Puffer, der Wnt5A, ein Signalmolekül, enthält, und die Kontrolle nur mit einem Puffer.Mit einem bakteriellen Erreger infizieren und inkubieren.In den Testzellen aktiviert Wnt5A eine Signalkaskade, die die Umstrukturierung des Zytoskeletts fördert und die bakterielle Aufnahme in Phagosomen fördert, während Kontrollzellen ohne dieses Signal weniger Bakterien internalisieren.Waschen Sie, um nicht internalisierte...

Wnt5A-vermittelte Verstärkung der bakteriellen Entfernung in murinen Makrophagen

Ein Verfahren, um die Fähigkeit der isolierten Maus-Alveolarmakrophagen, um das Wachstum von phagozytierten Aspergillus-Sporen durch konfokale Mikroskopie Steuerung auszuwerten.

Beurteilung der Anti-Pilz-Aktivität von isolierten Alveolarmakrophagen durch konfokale Mikroskopie

Während in vitro Studien von Wirt-Erreger-Interaktionen die Charakterisierung spezifischer Immunantworten ermöglichen, sind in vivo Modelle erforderlich, um die Auswirkungen komplexer Reaktionen zu beobachten. Unter Verwendung der Exposition von Candida albicans, gefolgt von einer Pseudomonas aeruginosa-vermittelten Lungeninfektion, etablierten wir ein Mausmodell für mikrobielle Interaktionen, die an der Pathogenität der beatmungsassoziierten Pneumonie beteiligt sind.

Studieren Mikrobielle Gemeinschaften<em&gt; In-vivo-</em&gt;: Ein Modell von Host-vermittelte Interaktion zwischen<em&gt; Candida albicans</em&gt; Und<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; In den Atemwegen

Hier beschreiben wir das Modell und den Ansatz zur Untersuchung der Funktionen von Lungenalveolarmakrophagen bei der Metastasierung von Krebs. Um die Rolle dieser Zellen bei der Metastasierung zu demonstrieren, wurde das syngene (4T1) Modell des Brustkrebses in Verbindung mit der Depletion von Alveolarmakrophagen mit Clodronat-Liposomen verwendet.

Untersuchung der Rolle von Alveolarmakrophagen in Metastasierung von Brustkrebs

Verschiedene Verfahren wurden für die Modellierung von bakterieller Pneumonie bei Mäusen in der Literatur beschrieben. Hier beschreiben wir eine nicht-invasive, kostengünstige, schnelle Methode zur Lungenentzündung durch Aspiration induzierenden (dh Inhalation) eines bakteriellen Inokulums in den Oropharynx pipettiert. Downstream Methoden zur Beurteilung der Lungen angeborenen Immunantwort sind auch detailliert.

Ein Nicht-invasive und in technischer Hinsicht nicht intensive Verfahren zur Induktion und Phänotypisierung für experimentelle bakterielle Pneumonie bei Mäusen

Diese Mitteilung beschreibt Methoden zur Isolierung und Kultur der alveolären Makrophagen aus Menschen und murinen Modellen zu Versuchszwecken.

Isolation und In-vitro- Kultur von murinen und menschlichen alveoläre Makrophagen

Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll zur Bestimmung, ob die Exposition gegenüber Ozon, einem Kriterium des Luftschadstoffs, die Alveolarmakrophagen-Efferozytose in vivo beeinträchtigt. Dieses Protokoll verwendet häufig verwendete Reagenzien und Techniken und kann an mehrere Modelle von Lungenverletzungen angepasst werden, um Die Auswirkungen auf die Alveolar-Makrophagen-Efferozytose zu bestimmen.

In Vivo Bewertung der Alveolar Makrophagen-Efferozytose nach Ozon-Exposition

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von pulmonalen interstitiellen Makrophagen (IMs) und deren adoptiven Transfer nach IL-33-Stimulation der Lungenbläschen in einem Mausmodell, was die In-vivo-Untersuchung der idiopathischen Lungenfibrose (IPF) erleichtern kann.

Adoptiver Transfer von IL-33-stimulierten Makrophagen in Bleomycin-induzierte Mausmodelle, um ihre Wirkung auf die idiopathische Lungenfibrose in vivo zu untersuchen

Lernen Sie die Phagozytose-Funktion alveolärer Makrophagen bei Mäusen zu analysieren und die bakterielle Clearance aus der Lunge zu bewerten. Diese Methode nutzt in vitro und in vivo Techniken mit Pseudomonas aeruginosa.

Alveolären Makrophagen Phagozytose und Bakterien-Clearance bei Mäusen

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