Name: Wirkung von Anti-c-Fms-Antikörper auf Osteoklasten Bildung und Verbreitung von Osteoklasten-Vorläufer In-vitro- (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-18T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Erfahren Sie die Osteoklastengenerierung aus Knochenmark von Mäusen mit M-CSF und RANKL oder TNF-alpha. Dieses Protokoll zeigt die therapeutische Wirkung von Anti-c-Fms-Antikörpern bei entzündlichen Knochenerkrankungen.

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Diese Arbeit wurde teilweise durch eine JSPS KAKENHI unterstützt von der Japan Society for Promotion of Science (Nr. 16K 11776, H. K., Nr. 17K 17306, K. S., Nr. 16K 20637 K. K., Nr. 16K 20636, M. S., Nr. 18K 09862 I. m.) zu gewähren.

Alle tierischen Verfahren und Pflege der Tiere wurden nach Tohoku Universität Regeln und Vorschriften durchgeführt.
(1) murinen Megalosauridae Dissektion und Handling
<ol><li>Füllen Sie vor Dissektion eine Platte mit etwa 50 mL der α-MEM abhängig von der Größe des Behälters und legen Sie ihn auf Eis. Dies wird als ein Auffangbehälter dienen, bis das Sezieren von allen Knochen abgeschlossen ist. Für diese und die folgenden verwenden Experimente, Sie α-MEM mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 100 IU/mL Penicillin G und 100 μg/mL Streptomycin.</li>
	<li>C57Bl/6J Maus durch Inhalation einer Überdosierung von 5 % Isofluran einschläfern.</li>
	<li>Befestigen Sie die Maus in Rückenlage mit Nadeln durchbohrt die Handflächen und Füße und Spray gründlich mit 70 % Ethanol.</li>
	<li>Einen Hautschnitt über sterile Chirurgische Scheren und Pinzetten auf der Ebene der Hüfte zu machen und bis zu den Füßen aussetzen der Muskeln zu verlängern.</li>
	<li>Schneiden Sie die Sehne anbringen des Quadrizeps-Muskels und die Sehne anbringen die Kniesehne Muskeln bis auf die Knochen. Ziehen Sie die Muskeln, die Freilegung der Hüft-und Kniegelenke. Diese sehnen Ortung erleichtert beide Muskeln aus ihren Anlagen ohne Weichgewebe Tags zu befreien. Schneiden Sie nicht in den Knochen.</li>
	<li>Positionieren Sie die Schere zwischen dem Kopf des Oberschenkelknochens und der Gelenkspalt und schneiden in den Oberschenkelknochen zu befreien, sondern halten die Knochen intakt. Damit wird die Ablösung der Knochen ohne das Risiko der Freilegung des Knochenmarks.</li>
	<li>Ähnlich schneiden Sie die Muskeln an der Tibia anbringen. Schneiden der Tibia frei von seiner Anhaftung an das Sprunggelenk Knochen zur Vermeidung von Kontaminationen intakt zu halten.</li>
	<li>Kratzen Sie alle verbleibenden Weichgewebe aus dem Femur und Tibia mit der Schere Messer und Windex und legen Sie sie in einen Teller mit α-MEM auf Eis gelegt.</li>
</ol>(2) murinen Megalosauridae Knochenmark isoliert
<ol><li>Füllen Sie eine 30 G Nadel Spritze mit α-MEM.</li>
	<li>Trennen Sie die Tibia und Femur entfernt das Kniegelenk.</li>
	<li>Schneiden Sie die Enden der langen Knochen von beiden Seiten mit einer Schere.</li>
	<li>Halten Sie die Knochen von der Welle mit einer Pinzette, stechen Sie die Nadel in den Knochenmark-Raum des Knochens und spülen Sie langsam den Inhalt des Knochenmarks in der Kulturschale 6 cm. Der Knochen erscheint weiß, die Gewinnung von Knochenmark Inhalte anzeigt. Wiederholen Sie für alle Knochen.</li>
	<li>Belastung der Knochenmark-Extrakt mit einem 40 µm Nylon Zelle Sieb in eine konische Zentrifugenröhrchen 50 mL und Zentrifuge bei 300 X g für 5 min.</li>
	<li>Den Überstand verwerfen, waschen mit 5 mL der α-MEM und Zentrifugieren bei 300 X g für 5 min. wiederholen Wash für insgesamt 2 Mal.</li>
	<li>
Aufschwemmen Sie das Pellet in 10 mL von α-MEM und führen Sie eine Anzahl Zellen mit einem Hemocytometer wie folgt:
	<ol>
<li>Machen Sie eine 1:1 Verdünnung der Zellsuspension durch Zugabe von 10 μl Zellsuspension auf 10 μL von 0,4 % Trypan blau in einem 1,5 mL Röhrchen und pipette einmal.</li>
		<li>Die Hemocytometer Kammer mit einer Schiebeabdeckung abdecken und die Farbstoff-Suspension auf die Hemocytometer übertragen. Es ist wichtig, nicht zu überfüllen oder underfill Kammer und erlauben die Aussetzung, die Kammer durch Kapillarwirkung zu füllen.</li>
		<li>Legen Sie die Hemocytometer auf einen Mikroskoptisch. Mit 10 X-Objektiv, konzentrieren Sie sich auf das mittlere Quadrat. Zählen Sie alle Zellen von 3 Zeilen gebunden. Um sicherzustellen, dass Zellen nicht zweimal gezählt werden, zählen Sie die oberen und rechten Ecken jedes Quadrats. Abgestorbenen Zellen erscheint dunkelblau, diese sind von der Zählung ausgeschlossen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Abhängig von der nachgeschalteten Anwendung Samen der Zellen in einem entsprechenden Kulturgefäß. Folgen Sie für dieses besondere Experiment Abschnitt 3.</li>
</ol>3. Generation der BMM
<ol><li>Samen 1 x 107 Zellen/10 mL in ein 10 cm Kultur Schüssel und fügen Sie M-CSF 100 ng/mL. Die Endkonzentration von M-CSF ist 100 ng/mL Kulturmedium. Inkubieren Sie die Kultur bei 37 ° C, 5 % CO2 für 3 Tage.</li>
	<li>Nach 3 Tagen das Kulturmedium zu entfernen, die Zellen kräftig mit 10 mL von Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) zweimal, nicht anhaftende Zellen zu entfernen, fügen Sie 5 mL Raumtemperatur 0,02 % Trypsin-EDTA in PBS waschen und Inkubation bei 37 ° C, 5 % CO2 für 5 min.</li>
	<li>Lösen Sie die Zellen, indem gründliche pipettieren. Stellen Sie sicher, dass die Zellen getrennt wurde, durch die Beobachtung der Kultur unter dem Mikroskop (die Zellen sollte abgerundete und schwebend in den Medien erscheinen). Wenn die Zellen nicht wegziehen lassen, wiederholen Sie pipettieren gründlich um sie zu lösen. Wenn die Zellen getrennt haben, fügen Sie 5 mL α-MEM, die Reaktion zu inaktivieren.</li>
	<li>Sammeln Sie die Zellen in ein 50 mL konische Rohr und Zentrifuge bei 300 X g für 5 min. überstand verwerfen, und waschen Sie mit 5 mL der α-MEM.</li>
	<li>300 X g für 5 min Zentrifugieren und das Pellet in 10 mL von α-MEM aufzuwirbeln.</li>
	<li>Führen Sie eine Zellzahl im Schritt 2.7.1 wie zuvor beschrieben.</li>
	<li>Samen 1 x 106 Zellen/10 mL in ein 10 cm Kultur Schüssel und fügen Sie M-CSF 100 ng/mL. Die Endkonzentration von M-CSF ist 100 ng/mL Kulturmedium. Inkubieren Sie die Kultur bei 37 ° C, 5 % CO2 für 3 Tage.</li>
</ol>4. Generation von Osteoklasten von BMM als Osteoklasten-Vorläufer
<ol><li>Ernten Sie nach 3 Tagen die angeschlossenen Zellen, die Osteoklasten-Vorläufer, folgende Schritte 3.2-3.7 BMM darstellen.</li>
	<li>Samen BMM auf 5 x 104 Zellen/200 μL der α-MEM in eine 96-well-Platte. Fügen Sie RANKL für eine Endkonzentration von 50 ng/mL oder TNF-α für eine Endkonzentration von 100 ng/mL. Geben Sie in jede M-CSF für eine Endkonzentration von 100 ng/mL.</li>
	<li>Fügen Sie Anti-c-Fms-Antikörper (Endkonzentrationen von 0, 1, 10, 100, 1000 ng/mL) in jede Vertiefung.</li>
	<li>Inkubation bei 37 ° C, 5 % CO2 für 4 Tage. Medien täglich für 4 Tage zu wechseln.</li>
</ol>5. Tartrat-resistente saure Phosphatase (TRAP) Fleck
<ol><li>Aspirieren Sie nach 4 Tagen Inkubation sanft das Kulturmedium von jedem Bohrloch. Waschen Sie nun einmal mit 200 μL der Raumtemperatur 1 X PBS.</li>
	<li>Fügen Sie 200 μl 10 % Formalin in jede Vertiefung zur Fixierung und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. Aspirieren Sie der Formalin und waschen Sie jeweils gut 3 Mal mit entionisiertem Wasser.</li>
	<li>Fügen Sie 200 μL von 0,2 % Triton x-100 mit PBS-Puffer zu jedem gut für Permeabilisierung und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. Aspirieren Sie der Triton x-100 und waschen Sie jeweils gut 3 Mal mit entionisiertem Wasser.</li>
	<li>Fügen Sie 200 μL der TRAP-Fleck-Lösung in jede Vertiefung. Visualisieren Sie den Fleck unter dem Mikroskop. Es dauert 10-30 min für den Fleck richtig entwickeln.</li>
	<li>Aspirieren Sie den Fleck und waschen jeweils gut mit entionisiertem Wasser 3mal, und an der Luft trocknen. Halten Sie bei Raumtemperatur, in weitere Beobachtungen zu verwenden.</li>
</ol>6. Verbreitung Assay
<ol><li>Samen BMM als Osteoklasten-Vorläufer auf 5 x 103 Zellen/200 μL der α-MEM in eine 96-well-Platte. Geben Sie in jede M-CSF für eine Endkonzentration von 100 ng/mL.</li>
	<li>Fügen Sie Anti-c-Fms-Antikörper (Endkonzentrationen von 0, 1, 10, 100, 1.000 ng/mL) und Inkubation bei 37 ° C, 5 % CO2 für 3 Tage ohne mittlere Änderung.</li>
	<li>Nach 3 Tagen Waschen der Zellen mit 1 X PBS. Geben Sie in jedes 100 μL der α-MEM.</li>
	<li>Hinzufügen von 10 μL der Zelle zählen Kit Lösung und Inkubation bei 37 ° C, 5 % CO2 für 2 h und bestimmen die Extinktion von jedem Bohrloch bei 450 nm mit einer Mikrotestplatte Reader.</li>
</ol>

<ol><li>Crotti, T. N., Dharmapatni, A. A., Alias, E., Haynes, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoimmunology%3A+Major+and+Costimulatory+Pathway+Expression+Associated+with+Chronic+Inflammatory+Induced+Bone+Loss%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Osteoimmunology: Major and Costimulatory Pathway Expression Associated with Chronic Inflammatory Induced Bone Loss.</a> Journal of Immunology Research. 2015, 281287(2015).</li>
<li>Teitelbaum, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+resorption+by+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bone resorption by osteoclasts.</a> Science. 289 (5484), 1504-1508 (2000).</li>
<li>Azuma, Y., Kaji, K., Katogi, R., Takeshita, S., Kudo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor-alpha+induces+differentiation+of+and+bone+resorption+by+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor-alpha induces differentiation of and bone resorption by osteoclasts.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (7), 4858-4864 (2000).</li>
<li>Kobayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor+alpha+stimulates+osteoclast+differentiation+by+a+mechanism+independent+of+the+ODF%2FRANKL-RANK+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor alpha stimulates osteoclast differentiation by a mechanism independent of the ODF/RANKL-RANK interaction.</a> Journal of Experimental Medicine. 191 (2), 275-286 (2000).</li>
<li>Kim, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+differentiation+independent+of+the+TRANCE-RANK-TRAF6+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Osteoclast differentiation independent of the TRANCE-RANK-TRAF6 axis.</a> Journal of Experimental Medicine. 202 (5), 589-595 (2005).</li>
<li>Redlich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclasts+are+essential+for+TNF-alpha-mediated+joint+destruction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investestigation%22%5BJournal%5D)">Osteoclasts are essential for TNF-alpha-mediated joint destruction.</a> Journal of Clinical Investestigation. 110 (10), 1419-1427 (2002).</li>
<li>Abu-Amer, Y., Ross, F. P., Edwards, J., Teitelbaum, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide-stimulated+osteoclastogenesis+is+mediated+by+tumor+necrosis+factor+via+its+P55+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investestigation%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide-stimulated osteoclastogenesis is mediated by tumor necrosis factor via its P55 receptor.</a> Journal of Clinical Investestigation. 100 (6), 1557-1565 (1997).</li>
<li>Zha, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF-alpha+contributes+to+postmenopausal+osteoporosis+by+synergistically+promoting+RANKL-induced+osteoclast+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicine+%26+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">TNF-alpha contributes to postmenopausal osteoporosis by synergistically promoting RANKL-induced osteoclast formation.</a> Biomedicine & Pharmacotherapy. 102, 369-374 (2018).</li>
<li>Kitaura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M-CSF+mediates+TNF-induced+inflammatory+osteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">M-CSF mediates TNF-induced inflammatory osteolysis.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3418-3427 (2005).</li>
<li>Kimura, K., Kitaura, H., Fujii, T., Hakami, Z. W., Takano-Yamamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-c-Fms+antibody+inhibits+lipopolysaccharide-induced+osteoclastogenesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunology+and+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Anti-c-Fms antibody inhibits lipopolysaccharide-induced osteoclastogenesis in vivo.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 64 (2), 219-227 (2012).</li>
<li>Kimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+anti-c-Fms+antibody+inhibits+osteoclastogenesis+in+a+mouse+periodontitis+model%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Diseases%22%5BJournal%5D)">An anti-c-Fms antibody inhibits osteoclastogenesis in a mouse periodontitis model.</a> Oral Diseases. 20 (3), 319-324 (2014).</li>
<li>Kitaura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+M-CSF+receptor+c-Fms+antibody+inhibits+mechanical+stress-induced+root+resorption+during+orthodontic+tooth+movement+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Angle+Orthodontist%22%5BJournal%5D)">An M-CSF receptor c-Fms antibody inhibits mechanical stress-induced root resorption during orthodontic tooth movement in mice.</a> Angle Orthodontist. 79 (5), 835-841 (2009).</li>
<li>Kitaura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+anti-c-Fms+antibody+inhibits+orthodontic+tooth+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">An anti-c-Fms antibody inhibits orthodontic tooth movement.</a> Journal of Dental Research. 87 (4), 396-400 (2008).</li>
<li>Bettina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M-CSF+Mediates+Host+Defense+during+Bacterial+Pneumonia+by+Promoting+the+Survival+of+Lung+and+Liver+Mononuclear+Phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">M-CSF Mediates Host Defense during Bacterial Pneumonia by Promoting the Survival of Lung and Liver Mononuclear Phagocytes.</a> Journal of Immunology. 196 (12), 5047-5055 (2016).</li>
<li>Dougall, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RANK+is+essential+for+osteoclast+and+lymph+node+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Develpoment%22%5BJournal%5D)">RANK is essential for osteoclast and lymph node development.</a> Genes & Develpoment. 13 (18), 2412-2424 (1999).</li>
<li>Wiktor-Jedrzejczak, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+absence+of+colony-stimulating+factor+1+in+the+macrophage-deficient+osteopetrotic+%28op%2Fop%29+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Total absence of colony-stimulating factor 1 in the macrophage-deficient osteopetrotic (op/op) mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (12), 4828-4832 (1990).</li>
<li>Yang, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+expression+of+macrophage+colony-stimulating+factor+in+ankylosing+spondylitis+and+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+Rheumatic+Diseases%22%5BJournal%5D)">Increased expression of macrophage colony-stimulating factor in ankylosing spondylitis and rheumatoid arthritis.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 65 (12), 1671-1672 (2006).</li>
<li>Takei, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+macrophage-colony+stimulating+factor+levels+in+synovial+fluid+of+loose+artificial+hip+joints%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">High macrophage-colony stimulating factor levels in synovial fluid of loose artificial hip joints.</a> The Journal of Rheumatology. 27 (4), 894-899 (2000).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

In dieser Studie untersuchten wir die Wirkung des Antikörpers Anti-c-Fms auf Osteoklasten RANKL-induzierte Bildung, Bildung von TNF-α-induzierte Osteoklasten und M-CSF-induzierte Osteoklasten Vorläufer Verbreitung. Wir fanden, dass die wirksame Menge des Antikörpers Anti-c-Fms für die Hemmung des Osteoclastogenesis zwischen Osteoklasten RANKL-induzierte Bildung, TNF-α induzierte Osteoklasten Bildung und M-CSF-induzierte Proliferation von Osteoklasten-Vorläufer unterscheidet.
RANKL vermittelt O...

Osteoklasten sind hoch spezialisierte Zellen, und sie unterscheiden von hämatopoetischen Stammzellen durch die Verschmelzung von mehreren Osteoklasten-Vorläufer. Sie sind unerlässlich für gesunden Knochenaufbau und tragen zur pathologischen Knochenabbau osteolytischen Entzündungskrankheiten wie rheumatoide Arthritis und Parodontitis1zugeordnet.
Osteoclastogenesis und Osteoklasten Funktion sind durch zwei Schlüsselfaktoren vermittelt; Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (M-CSF) und Rezeptor Aktivator des nuklearen Faktor Kappa B Ligand (RANKL). M-CSF und RANKL sind wichtig für die Osteoklasten Differenzierung2. Ein weiterer Faktor, das gezeigt worden ist, induzieren Osteoklasten-Formation von in-vitro-Knochenmark Makrophagen ist Tumor-Nekrose-Faktor alpha (TNF-α)3,4,5. TNF-α vermittelten Osteoklasten Bildung kritisch für Osteolyse in destruktiver Knochenerkrankungen wie rheumatoider Arthritis6, Parodontitis7und postmenopausalen Osteoporose8gezeigt wurde.
C-Fms ist die Membran-Rezeptor von M-CSF und vermittelt seine Wirkung. Die Rolle des c-Fms ist in der Literatur gut dokumentiert, wie nachgewiesen wurde, dass die Verwaltung eines Antikörpers gegen c-Fms (Antikörper Anti-c-Fms) komplett verhaftet Osteoclastogenesis in einem Modell Arthritis sowie in TNF-α induzierte Knochen Erosionen während Osteoclastogenesis entfernte aus dem entzündeten Gelenk war noch robuste9. Verwaltung von Anti-c-Fms Antikörper gehemmt Osteoklasten Bildung und Knochen Resorption induziert durch Lipopolysaccharid (LPS) in Maus Calvariae10 ebenso wie LPS-induzierte Parodontitis Modell11. Darüber hinaus gehemmt Antikörper Anti-c-Fms mechanische stressinduzierte Wurzelresorption während der kieferorthopädischen Zahn Bewegung12sowie kieferorthopädische Zahnbewegungen und Knochenabbau kieferorthopädischen Zahn Bewegung13zugeordnet.
M-CSF wurde berichtet, um andere Funktionen haben, die für die Host-Immunantwort unabdingbar sind. Das Fehlen von M-CSF bei Op/Op-Mäusen mit bakterieller Lungenentzündung führen zur Steigerung der bakteriellen Belastung und bakterielle Verbreitung in der Leber mit hepatischen Nekrose14. M-CSF ist daher wichtig für immunologische Reaktion beim Schutz vor Infektionen.
Diese Studie zeigt die Wirkung der Antikörper Anti-c-Fms auf M-CSF und RANKL oder TNF-α induzierte Osteoklasten Bildung in-vitro- und M-CSF induzierte Proliferation von Osteoklasten-Vorläufer. Dieses Protokoll zeigt die Isolation der murinen Knochenmarkzellen von Röhrenknochen, und die Schritte des Knochenmarks Makrophagen (BMM) generiert, die als Osteoklasten-Vorläufer gelten und induzieren die Differenzierung der BMM in Multikern Osteoklasten durch zwei Methoden; RANKL oder TNF-α. Das Protokoll wird auch die Verhaftung von Osteoclastogenesis bei beiden Methoden mit Anti-c-Fms Antikörper verglichen.
Der Prozess mit dem Knochenmark extrahiert und anschließend zur Erzeugung von Osteoklasten-Vorläufer ist zuverlässig in der Herstellung von großen Mengen des reinen Osteoklasten-Kulturen, die in mehrere downstream-Anwendungen wie Drogentests verwendet werden können. Die Verwendung von RANKL oder TNF-α induzieren Osteoclastogenesis in diesem Protokoll unterscheidet Osteoclastogenesis als physiologische Prozess (RANKL) von Osteoclastogenesis als pathologische Prozess (TNF-α), was wiederum zwei alternative Verfahren führen die Entscheidung ist eine überlegene in Bezug auf die Reagenzien in downstream-Anwendungen verwendet werden. Dieses Protokoll bietet auch eine Methode, mit der wir eine geeignete Konzentration des Antikörpers Anti-c-Fms feststellen können, die für das spätere Studium Knochenabbau und osteolytischen Krankheiten beteiligt sicher verwendet werden kann.

<table><tbody><tr><td>Anti-c-Fms-Antikörper</td><td></td><td></td><td>AFS98, ein monoklonaler, antimuriner c-Fms-Antikörper (IgG2a) an der RatteTNF</td></tr><tr><td>-& alpha;</td><td></td><td></td><td>Rekombinantes murines TNF-&alpha; in unserem Labor hergestellt. TNF-&alpha; cDNA-Fragment, das mittels RT-PCR kloniert und in ein pGEX-6P-I (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) kloniert wurde, um ein GST-Fusionsprotein zu erzeugen. GST-TNF-&alpha; wurde in Escherichia coli BL21-Zellen (Stratagene, La Jolla, CA) exprimiert. Die Zellen wurden unter nichtdenaturierenden Bedingungen lysiert und GST-TNF-&alpha; wurde über eine Glutathion-Sepharose-Säule gereinigt. GST wurde durch PreScission Protease (Amersham Biosciences) vom Hersteller abgespalten." und wurde durch eine Glutathion-Sepharose-Säule entfernt.</td></tr><tr><td>RANKL</td><td>PEPROTECH</td><td>315-11</td><td>Rekombinanter muriner sRANK-Ligand, Quelle: E. coli</td></tr><tr><td>M-CSF</td><td></td><td></td><td>Rekombinantes humanes M-CSF. 1/10 vol von CMG14&ndash; 12 Zelllinien-Kulturüberstände bei 5x106&nbsp; Zellen in einer 10 cm Suspensionskulturschale.</td></tr><tr><td>&alpha;-MEM</td><td>Wako</td><td></td><td>mit L-Glutamin und Phenolrot</td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum</td><td>Biowest</td><td>s1820-500</td><td>Fötales Kälberserum Französische Herkunft</td></tr><tr><td>Kulturschale</td><td>Corning</td><td></td><td>100 mm x 20 mm Style Schale</td></tr><tr><td>96-Well-Platte</td><td>Thermofischer Scientific</td><td></td><td>Nun Clon Delta</td></tr><tr><td>Oberfläche Zellzählkit-8</td><td>Dojindo, Kumamoto, Japan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroplatten-Reader</td><td>Sunrise REMOTE; Tekan Japan, Kawasaki, Japan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zellsieb</td><td>Corning</td><td></td><td>40 &mu; m Nylon</td></tr><tr><td>Zentrifugenröhrchen</td><td>Corning</td><td></td><td>50 mL CentriStar Kappe</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Wako</td><td></td><td>Polyoxyethylen (10) Octyphenylether</td></tr></tbody></table>

wirkung von anti-c-fms-antikörper auf osteoklasten bildung und verbreitung von osteoklasten-vorläufer in-vitro-

Effect of Anti-c-fms Antibody on Osteoclast Formation and Proliferation of Osteoclast Precursor In Vitro

Knochenaufbau ist ein komplexer Prozess, und es handelt sich um Zeiträume von Ablagerung und Resorption. Knochenabbau ist ein Prozess, durch den Knochen durch Osteoklasten in Reaktion auf verschiedene Reize abgebaut wird. Osteoklasten-Vorläufer differenzieren Multikern Osteoklasten in Reaktion auf Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (M-CSF) und Rezeptor Aktivator des nuklearen Faktor Kappa B Ligand (RANKL). Unter pathologischen Bedingungen das Zytokin-Profil ist anders und beinhaltet eine Mischung von inflammatorischen Zytokinen. Tumor-Nekrose-Faktor Alpha (TNF-α) ist eines der wichtigsten Zytokine wie es in großen Mengen in den Bereichen mit entzündlichen Osteolyse gefunden wird. Der Zweck dieses Protokolls ist, ein Verfahren bereitzustellen, mit denen murinen Knochenmark isoliert ist, um Osteoklasten durch Induktion mit M-CSF und RANKL oder TNF-α, anschließend gehemmt wird, durch steigende Dosen des Antikörpers Anti-c-Fms, den Rezeptor, zu generieren für M-CSF. Dieses Experiment zeigt den therapeutischen Wert des Antikörpers Anti-c-Fms bei Erkrankungen des entzündliche Knochenabbau.

Dieses Protokoll dient zur Bewertung der Wirkung der Anti-c-Fms-Antikörper auf Osteoklasten Bildung in Gegenwart von RANKL oder TNF-α und die Wirkung von M-CSF auf Osteoklasten-Vorläufer-Verbreitung zu bestimmen. In diesem Protokoll haben wir einen zuverlässigen Prozess bereitgestellt, mit dem große Mengen von reinem Osteoklasten Kulturen entstehen. Wir haben auch eine Möglichkeit, Anti-c-Fms Antikörperkonzentration geeignet für Hemmung der Osteoklasten Formation unter verschiedenen Kultu...

Dieses Protokoll enthält Dissektion der murinen langen Knochen und Knochenmark isoliert, Knochenmark Makrophagen zu generieren und produzieren Osteoklasten mit Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (M-CSF) und Rezeptor Aktivator des nuklearen Faktor Kappa B Ligand (RANKL) oder Tumor-Nekrose-Faktor Alpha (TNF-α) und ihre Verhaftung durch Anti-c-Fms Antikörper, M-CSF Rezeptor.

Wirkung von Anti-c-Fms-Antikörper auf Osteoklasten Bildung und Verbreitung von Osteoklasten-Vorläufer In-vitro-

Bone remodeling is a complex process and it involves periods of deposition and resorption. Bone resorption is a process by which bone is broken down by ...

Dieses Experiment unterstreicht den therapeutischen Wert von Anti-c-fms Antikörpern bei Erkrankungen entzündlicher Knochenstörungen wie rheumatoider Arthritis und Parodontitis. Das Verfahren, durch das Knochenmark extrahiert und zur Erzeugung von Osteoklastvorläufern verwendet wird, ergibt große Mengen reiner Osteoklasten, die in mehreren nachgelagerten Anwendungen eingesetzt werden können. Dieses Protokoll bietet zwei alternative Methoden der Osteoclastogenese, entweder mit RANKL Ligand oder TNF alpha.Darüber hinaus bietet diese Methode Einblick in die Wirkung von Anti-c-fms-Antikörpern auf die Osteoclastogenese. Die visuelle Demonstration dieses Verfahrens macht den Forscher mit dem Prozess der Zerlegung und der Gewinnung von Knochenmarkzellen in großen Mengen vertraut. Um eine Platte zu füllen, die als Sammelbehälter mit ca. 50 Milliliter alpha MEM dienen wird, abhängig von der Größe des Behälters, und legen Sie sie auf Eis.Verwenden Sie Stifte, um durch die Handflächen und Füße einer eingeschläferten Maus zu durchdringen, um sie in Supine-Position zu fixieren, und sprühen Sie gründlich mit 70% Ethanol. Verwenden Sie sterile chirurgische Schere und Pinzette, um einen Hautschnitt auf der Ebene der Hüfte zu machen und sie bis zu den Füßen zu erweitern, die Muskeln freizulegen. Suchen und schneiden Sie die Sehne, die den Quadrizepsmuskel befestigt.Den Muskel abziehen und auf hüfthöhe schneiden. Dann lokalisieren Sie die Sehne, die den Hamstring-Muskel am Knochen befestigt. Schälen Sie die Muskeln, die den Knochen freisetzen, und befreien Sie die Sehne von ihrer Befestigung, um sicherzustellen, dass sie nicht in den Knochen geschnitten wird.Positionieren Sie die Schere zwischen dem Kopf des Oberschenkelknochens und dem Gelenkraum. Schneiden Sie in sie befreien den Oberschenkelknochen, aber halten Sie den Knochen intakt, die Ablösung der Knochen ermöglicht, ohne das Risiko der Exposition des Knochenmarks. Schneiden Sie die Muskeln an der Tibia in ähnlicher Weise befestigt.Dann schneiden Sie die Tibia frei von seiner Befestigung am Sprunggelenk, während sie den Knochen intakt hält, um eine Kontamination zu vermeiden. Verwenden Sie die Scherenklingen und Labortücher, um das verbleibende Weichgewebe aus dem Oberschenkelknochen und der Tibia zu kratzen und legen Sie es in die vorbereitete Platte mit Alpha MEM auf Eis gelegt. Die Sezierung sollte sorgfältig durchgeführt werden, um die Kontamination zu minimieren.Deshalb sind eine gründliche Weichteilentfernung und Knochenlokalisierung von entscheidender Bedeutung. Füllen Sie eine 30-Spur-Nadelspritze mit alpha MEM. Trennen Sie die Tibia und Oberschenkel von der Kniegelenk, und schneiden Sie die Enden des langen Knochens von beiden Seiten mit einer Schere.Verwenden Sie eine Pinzette, um den Knochen aus der Welle zu halten. Setzen Sie die Nadel in den Knochendesmarkeinraum ein und spülen Sie den Inhalt des Marks langsam in eine sechs Zentimeter große Kulturschale und wiederholen Sie ihn für alle Knochen. Der Knochen wird weiß, was auf die Extraktion des gesamten Knochenmarkgehalts hinweist.Verwenden Sie ein 40 Mikrometer Nylon-Zellsieb, um den Knochenmarkextrakt in ein 50 Milliliter konisches Zentrifugenrohr zu sanieren. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 300 mal G für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand.Zum Waschen fünf Milliliter Alpha MEM in das Pellet geben. Pipette die Zellen, um sie zu lösen, Zentrifuge, und wiederholen Sie die Wäsche für insgesamt zwei Mal. Nach dem Zählen dieser isolierten Zellen, wie im Manuskript beschrieben, säen Sie 10 Millionen Zellen pro 10 Milliliter in einer 10-Zentimeter-Kulturschale aus und fügen M-CSF zu den Zellen hinzu.Inkubieren Sie die Kultur bei 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid für drei Tage. Entfernen Sie das Medium nach drei Tagen, und waschen Sie die Zellen zweimal kräftig mit 10 Milliliter PBS, um nicht haftende Zellen zu entfernen. Fügen Sie fünf Milliliter Raumtemperatur 0,02%Trypsin-EDTA und PBS hinzu und brüten bei 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid für fünf Minuten.Gründlich Pipette die Zellen, um sie zu lösen. Beobachten Sie die Kultur unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Zellen getrennt wurden und gerundet und in den Medien schwebend erscheinen. Wenn die Zellen abgetrennt wurden, inaktivieren Sie die Reaktion, indem Sie fünf Milliliter des Alpha-MEM hinzufügen.Sammeln Sie die Zellen in einem 50 Milliliter konischen Rohr und Zentrifuge bei 300 mal G für fünf Minuten. Nach dem Wegwerfen des Überstandes mit fünf Milliliteralpha MEM waschen und fünf Minuten lang wieder bei 300 mal G zentrieren. Das Pellet in 10 Milliliter Alpha MEM wieder aufhängen.Samen 1 Million Zellen pro 10 Milliliter in einem 10-Zentimeter-Kulturgericht, und fügen Sie M-CSF. Inkubieren Sie die Kultur bei 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid für drei Tage. Ernten Sie die angeschlossenen Zellen, die BMMs als Osteoklast-Vorstufen nach drei Tagen darstellen, wie es zuvor bei der Erzeugung von BMMs geschehen ist.Säen Sie die BMMs bei 50.000 Zellen pro 200 Mikroliter alpha MEM in einer 96-Well-Platte pro Brunnen. Zu jedem Brunnen, fügen Sie gewünschte Reize. Und dann M-CSF für eine endige Konzentration von 100 Nanogramm pro Milliliter hinzufügen.Fügen Sie Anti-c-fms Antikörper zu jedem Brunnen hinzu. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid für vier Tage, während medienwechseln jeden zweiten Tag für vier Tage. Und dann gehen Sie mit Färbung und Assays, wie in der Handschrift beschrieben.Die Osteoklastbildung in m-CSF und RANKL behandelten Kultur, mit Anti-c-fms Antikörper, wurde bewertet. Mit 101.000 Nanogramm pro Milliliter Anti-c-fms-Antikörper wurde im Vergleich zur Kontrolle eine signifikante Abnahme der Anzahl von Osteoklasten beobachtet. Während bei einem von 10 Nanogramm pro Milliliter Anti-c-fms Antikörper, gab es keine signifikante Abnahme.Anschließend wurde die Osteoklastbildung in der Alpha-behandelten M-CSF- und TNF-Alphakultur mit Anti-c-fms-Antikörper bewertet. Mit 10, 100, 1 000 Nanogramm pro Milliliter Anti-c-fms Antikörper wurde eine signifikante Abnahme der Anzahl der Osteoklasten im Vergleich zur Kontrolle beobachtet, ohne signifikante Abnahme bei einem Nanogramm pro Milliliter. Und die M-CSF-Kultur mit 1, 10, 100 Nanogramm pro Milliliter Anti-c-fms Antikörper, gab es keine signifikante Abnahme der Anzahl der Osteoklast-Vorstufen im Vergleich zur Kontrolle.Bei 1 000 Nanogramm pro Milliliter war jedoch eine signifikante Abnahme der Anzahl der Osteoklast-Vorläufer zu verzeichnen, was darauf hindeutet, dass eine Konzentration von bis zu 1.000 Nanogramm pro Milliliter erforderlich ist, um die Proliferation von Osteoklast-Vorstufen signifikant zu hemmen. Achten Sie darauf, die Bindungen zu befreien, während Sie den Knochen intakt halten, was die Wahrscheinlichkeit einer Kontamination minimiert.

effect-anti-c-fms-antibody-on-osteoclast-formation-proliferation

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

In diesem Video demonstrieren wir die Wirkung verschiedener Anti-c-fms-Antikörperkonzentrationen auf die Osteoklastogenese, d.h. den Prozess der Osteoklastenbildung aus Osteoklastenvorläuferzellen.

Wirkung des Anti-C-fms-Antikörpers auf die Osteoklastogenese in Knochenmarkzellen der Maus in vitro

Die Differenzierung von Vorläuferzellen in Osteoklasten wird durch Zytokine und Wachstumsfaktoren reguliert. Hier werden eine neuartige Gentransfertechnik zur Differenzierung von Osteoklasten in vivo und Zellkulturprotokolle zur Differenzierung von Vorläuferzellen in Osteoklasten in vitro als Methode zur Untersuchung der Auswirkungen von Zytokinen auf die Osteoklastogenese beschrieben.

A Novel In vivo Gentransfer-Technik und In-vitro- Zellbasierte Assays für das Studium der Knochenverlust in Skeletterkrankungen

Osteoklasten sind die Haupt knochenresorbierenden Zellen im Körper. Eine Fähigkeit, die Osteoklasten in großer Zahl zu isolieren hat erhebliche Fortschritte im Verständnis der Osteoklasten Biologie geführt. In diesem Protokoll beschreiben wir ein Verfahren zur Isolierung, Kultivierung und Quantifizierung der Osteoklastenaktivität in vitro.

Osteoklasten Ableitung aus Knochenmark der Maus

Notch-Signalisierung ist eine Form der zellulären Kommunikation, die auf direktem Kontakt zwischen Zellen beruht. Um den Notch-Signalweg in vitro korrekt zu induzieren, müssen Notch-Liganden den Zellen in einem immobilisierten Zustand präsentiert werden. Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur in vitro Stimulation des Notch-Signalwegs in Maus-Osteoklasten-Vorläufern.

Die Stimulation der Notch-Signalweg in Maus-Osteoklasten Precursors

Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll zum isolieren und Kultur Osteoklasten in Vitro aus Maus Knochenmark und zur Untersuchung der Rolle von Säugetieren/mechanistischen Ziel von Rapamycin Komplex 1 in Osteoklasten-Formation.

Ein RANKL-basierte Osteoklasten Kultur Assay der Maus Knochenmark zu untersuchen, die Rolle von mTORC1 in Osteoklasten Bildung

Osteoklasten sind gewebespezifische Makrophage-Polykaryonen, die aus der monozytenmakrophären Linie hämatopoietischer Stammzellen abgeleitet werden. In diesem Protokoll wird beschrieben, wie Knochenmarkzellen isoliert werden können, so dass große Mengen an Osteoklasten gewonnen werden, während gleichzeitig das Unfallrisiko in traditionellen Methoden reduziert wird.

Isolierung, Reinigung und Differenzierung von Osteoclast-Laufläufern aus der Rattenmarkierung

Hier stellen wir ein einfaches und effektives Assay-Verfahren für Resorptionsgruben-Assays mit Calciumphosphat-beschichteten Zellkulturplatten vor.

Ein einfaches Pit-Assay-Protokoll zur Visualisierung und Quantifizierung der osteoklastischen Resorption in vitro

Osteoklasten sind wichtige knochenresorbierende Zellen im Körper. Dieses Protokoll beschreibt eine zuverlässige Methode zur in vitro Differenzierung von Osteoklasten aus humanen Monozyten im peripheren Blut. Diese Methode kann als wichtiges Werkzeug verwendet werden, um die Osteoklastenbiologie in der Homöostase und bei Krankheiten besser zu verstehen.

Abgrenzung funktioneller Osteoklasten von CD14+ Monozyten aus humanem peripherem Blut

Dieser Artikel beschreibt das Verfahren für die Bildung und Visualisierung eines bakteriellen Biofilms in einem 8-well Kammer schieben...

In-vitro-Bildung von Biofilmen in einem 8-well Chamber Slide

Die vorgestellte Methode bietet eine Möglichkeit, funktionelle wirksame kardiotropen Autoantikörpern im Plasma von Patienten mit dilatativer Kardiomyopathie erfassen, unabhängig von dem spezifischen Antigen, durch Analyse der Auswirkung der isolierten Immunglobulin Patienten auf zelluläre Backfett und intrazellulärem Calcium in isolierter Transienten Rattenkardiomyozyten.

Die Messung der Antikörper Auswirkungen auf zelluläre Funktion von isolierten Kardiomyozyten

Erfahren Sie die Osteoklastengenerierung aus Knochenmark von Mäusen mit M-CSF und RANKL oder TNF-alpha. Dieses Protokoll zeigt die therapeutische Wirkung von Anti-c-Fms-Antikörpern bei entzündlichen Knochenerkrankungen.

Wirkung von Anti-c-Fms-Antikörper auf Osteoklasten Bildung und Verbreitung von Osteoklasten-Vorläufer In-vitro-

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