Spore-Adsorption als ein Nonrecombinant Display-System für Enzyme und Antigene
19. März 2019
Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Verwendung von Bakteriensporen als "live" nanobiotechnologische Werkzeug zu adsorbieren, heterologe Moleküle mit verschiedenen biologischen Aktivitäten. Die Methoden zur Messung der Effizienz der Adsorption werden ebenfalls angezeigt.
Lebende bakterielle Sporen mit Antigen oder Enzymen sind funktionell aktive Nanopartikel, die als Schleimhautimpfstoffe oder Biokatalysatoren verwendet werden können. Grundsätzlich kann jedes Protein effizient auf Sporen adsorbiert werden. Diese Technik ist einfach und erfordert keine genetische Manipulation.
Daher ist keine Freisetzung rekombinanter Organismen in die Umwelt beteiligt. Neben der Schleimhautimpfung für Mensch und Tier können Sporen mit Enzymen als wiederverwendbare Biokatalysatoren entwickelt werden. Beginnen Sie mit der Kennzeichnung von zwei mal 10 bis zum neunten B.subtilis Wildtyp gereinigten Sporen mit zwei-fünf- oder 10-Mikrogramm-Konzentrationen des Modells RFP in 200 Mikroliter Bindungspuffer, ergänzt mit 50-Millimolar-Natriumcitrat für eine Stunde bei 25 Grad Celsius auf einem Schaukelschüttler.
Am Ende der Inkubation die Bindungsmischungen durch Zentrifugation pellet und die Überräube in neue konische Rohre für die anschließende Adsorptionseffizienzanalyse übertragen. Dann die Sporenpellets zweimal mit 200 Mikroliter Bindungspuffer pro Wäsche waschen und die Pellets nach der zweiten Wäsche in 100 Mikroliter frischer Bindungspuffer wieder aufhängen. Für die Oberflächenproteinextraktion 50 Mikroliter jeder adsorbierten Sporenresuspension zu 50 Mikrolitern 2X Natriumdodecylsulfat-Dithiothreitol hinzufügen, um die Oberflächensporenproteine zu saugen.
Nach 45 Minuten bei 65 Grad Celsius, sammeln Sie die Mischungen durch Zentrifugation, und laufen 10 Mikroliter jedes Volumens von extrahierten Proteinen übereinem westlichen Fleck, wobei ein monoklonaler Anti-His-Antikörper den His-Tag erkennt, der am N-Terminus von mRFP vorhanden ist, um die markierten Oberflächenproteine zu identifizieren. Um die adsorbierten Moleküle durch Fluoreszenzmikroskopie zu lokalisieren und zu quantifizieren, fügen Sie fünf Mikroliter der adsorbierten Sporenresuspension zu 95 Mikroliter PBS hinzu und fügen Sie fünf Mikroliter jeder resultierenden Suspension auf einzelne Mikroskopschlitten hinzu. Legen Sie einen mit Poly-L-Lysin behandelten Deckelauf auf jedes Dia und legen Sie ein Dia auf eine Fluoreszenzmikroskopstufe.
Speichern Sie dann für jedes Feld die Phasenkontrast- und Fluoreszenzmikroskopiebilder. Öffnen Sie für die Bildanalyse die Fluoreszenzmikroskopiebilder in ImageJ, und wählen Sie Bild und Typ aus, um zu bestätigen, dass alle Bilder im Acht-Bit-Format vorliegen. Wählen Sie im Menü Analysieren die Option Messungen festlegen aus, und bestätigen Sie, dass Fläche, integrierte Dichte und mittlerer Grauwert ausgewählt sind.
Verwenden Sie ein Zeichnungs- oder Auswahlwerkzeug, um eine Linie um den Interessenssporen zu zeichnen, und wählen Sie Im Menü Analysieren die Option Messen aus. Es wird ein Popupfeld mit einem Stapel von Werten für die ausgewählte Sporen angezeigt. Nachdem mindestens 50 Sporen ausgewählt wurden, wählen Sie mehrere Regionen ohne Sporen aus, und wiederholen Sie die Messung, um einen Messwert für die Hintergrundfluoreszenz zu erhalten.
Nachdem Sie mehrere Hintergrundmessungen erhalten haben, kopieren Sie alle Daten im Ergebnisfenster in eine Kalkulationstabelle, und berechnen Sie den Mittelwert der integrierten Dichte im Bereich der ausgewählten Sporen und die Hintergrundfluoreszenzwerte, um die korrigierte Gesamtfluoreszenz pro Zelle zu erhalten. Für die indirekte Adsorptionseffizienzbewertung Sechs zweifache serielle Verdünnungen von gereinigtem mRFP bei einer Konzentration von 0,5 Nanogramm pro Mikroliter auf ein Endvolumen von 250 Mikrolitern pro Verdünnung im Bindungspuffer und eine entsprechende experimentelle Anzahl von zweifachen seriellen Verdünnungen von 100 Mikrolitern jeder reservierten Überstandprobe, die den ungebundenen mRFP-Anteil der Adsorptionsreaktion mit 100 Mikrolitern bindungspuffern. Als nächstes schneiden Sie eine Nitrocellulosemembran mit einem 0,45-Mikrometer-Cutoff auf eine Größe von neun mal zehn Zentimetern, um einen Fünf-Mal-mit-sechs-Punkte-der-Verdünnungsbereich abzudecken, ohne sich über den Rand der Dichtung des Punktfleckapparats hinaus auszudehnen.
Legen Sie die vornasse Membran in das Punktblot-Gerät. Überprüfen Sie die richtige Größe der Membran, und entfernen Sie alle Luftblasen, die zwischen der Membran und der Dichtung eingeschlossen sind. Montieren Sie das Vom Hersteller beschriebene Punktblot-Gerät und decken Sie den unbenutzten Teil des Geräts ab, um zu verhindern, dass sich Luft durch diese Brunnen bewegt.
Wenn das Gerät fertig ist, laden Sie die Norm in den beiden äußeren Bahnen und die Proben in den mittleren Bahnen mit 100 Mikroliter jeder geeigneten Verdünnung pro Brunnen. Wenn alle Proben geladen sind, schalten Sie die Vakuumpumpe für zwei Minuten ein, bevor Sie das Vakuum anhalten und die Proben durch die Membran durch die Schwerkraft filtern können. Nach 10 Minuten jeden Brunnen mit 100 Mikroliter PBS waschen.
Führen Sie die Vakuumpumpe weitere fünf Minuten aus. Wenn der Waschpuffer vollständig aus dem Gerät abgelassen ist, während das Vakuum eingeschaltet ist, lösen Sie die Schrauben und öffnen Sie vorsichtig das Punktblot-Gerät. Verarbeiten Sie dann die Membran nach den üblichen Western Blot-Protokollen.
Öffnen Sie für die densitometrische Analyse des Filters ImageJ, und skizzieren Sie jeden Punkt, um die integrierte Dichte mithilfe des Befehls Analysieren, Messen zu messen, wie gezeigt. Um eine Hintergrundkorrektur des Bildes vorzunehmen, zeichnen Sie einen Kreis in einem leeren Bereich, und messen Sie seine integrierte Dichte, wie gezeigt. Korrelieren Sie die integrierte Dichte der Standardpunkte mit der Menge des geladenen Proteins, um eine Kalibrierlinie zu erhalten, und verwenden Sie die Kalibrierkurve, um die Konzentration von mRFP jedes Probenpunkts zu extrapolieren.
Die Konzentration des in den ungebundenen Fraktionen verbleibenden mRFP kann dann berechnet werden. Das Vorhandensein von Proteinen der erwarteten Größe nur in den Bahnen, die mit einem Extrakt der adsorbierten Sporen beladen sind, ist ein Indiz für eine erfolgreiche Adsorptionsreaktion. Die direkte Bewertung der Adsorptionseffizienz hängt vom verwendeten heterologen Protein ab und kann durch Fluoreszenzmikroskopie und Zytofluorimemetrie der Pelletfraktion nach der Fraktionierung der Adsorptionsreaktion durchgeführt werden.
Die Quantifizierung der auf Sporen vorhandenen Fluoreszenzsignale kann dann mit ImageJ durchgeführt werden, wie gezeigt. Eine indirekte Analyse der Adsorptionseffizienz kann durch eine Punktblotting-Analyse der Überstandfraktion durchgeführt werden, die das ungebundene Protein enthält, und eine nachfolgende densitometrische Analyse des ungebundenen Proteins ermöglicht die indirekte Berechnung der Menge des auf die Sporen adsorbierten Proteins. Obwohl grundsätzlich jedes Protein für die Verwendung als Schleimhautimpfstoffe oder Biokatalysatoren adsorbiert werden kann, hängt die Wirksamkeit der Adsorption in der Praxis von den Proteinstandorten und den chemischen Eigenschaften ab.
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Übersicht
Dieses Protokoll demonstriert die Verwendung bakterieller Sporen als funktionelle Nanopartikel zur Adsorption heterologer Moleküle. Diese Sporen können als Mukosaimpfstoffe oder Biokatalysatoren dienen und stellen eine einfache Methode dar, die auf genetische Manipulation verzichtet.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Nanobiotechnologie
- Immunologie
- Biokatalyse
Hintergrund
- Bakteriensporen können Antigene oder Enzyme darstellen.
- Sie fungieren als aktive Nanopartikel.
- Die Technik beinhaltet nicht die Freisetzung rekombinanter Organismen in die Umwelt.
- Anwendungen umfassen die Schleimhautvaccinologie und enzymbasierte Biokatalyse.
Zweck der Studie
- Untersuchung der Verwendung bakterieller Sporen zum Adsorbieren von Proteinen.
- Entwicklung einer Methode zur Herstellung von Schleimhautimpfstoffen.
- Untersuchung des Potenzials von Sporen als wiederverwendbare Biokatalysatoren.
Verwendete Methoden
- Markierung von gereinigten Sporen des B.subtilis-Wildtyps mit modellhaftem RFP.
- Verwendung unterschiedlicher Konzentrationen von RFP in einem Bindungspuffer.
- Durchführung des Experiments bei 25 Grad Celsius auf einem Schüttelinkubator.
- Bestimmung der Adsorptions-Effizienz.
Hauptergebnisse
- Die Methode ermöglicht eine effiziente Adsorption von Proteinen an Sporen.
- Zeigte das Potenzial für die Entwicklung von Schleimhautimpfstoffen.
- Belegte die Durchführbarkeit zur Herstellung wiederverwendbarer Biokatalysatoren.
- Bietet einen einfachen, nicht-genetischen Ansatz für die Proteinadsorption.
Schlussfolgerungen
- Bakteriensporen sind effektive Werkzeuge für die Proteinadsorption.
- Sie können in Impfstoffen und bei Biokatalysator-Anwendungen eingesetzt werden.
- Die Methode ist einfach und umweltverträglich.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Sporenadsorption bietet eine nicht-rekombinante Plattform zur Darstellung von Enzymen und Antigenen und ermöglicht die schnelle Entwicklung von Mukosaimpfstoffen und wiederverwendbaren Biokatalysatoren ohne genetische Manipulation. Dieser Ansatz verringert das Umweltrisiko und vereinfacht die Proteinstabilisierung unter ungünstigen Bedingungen. Die Methode unterstützt die Validierung von Zielstrukturen in frühen Entwicklungsstadien sowie die Assay-Entwicklung, indem sie ein stabiles, quantifizierbares Darstellungssystem für funktionelle Tests bereitstellt.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung der Proteinfunktion durch Oberflächendarstellung auf stabilen Sporen und unterstützt so die Überprüfung von Hypothesen zu Zielstrukturen.
- Operativer Wert: Vermeidet den Aufbau rekombinanter Stämme und reduziert dadurch den zeitlichen Aufwand sowie die biosicherheitstechnische Komplexität in der frühen Entdeckungsphase.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bietet quantitative Metriken zur Adsorptionseffizienz mittels Fluoreszenzmikroskopie und Dot-Blotting für die Standardisierung von Assays.
- Operativer Wert: Ermöglicht die Wiederverwendung von sporengebundenen Enzymen über mehrere Reaktionsdurchgänge hinweg, wodurch die Durchsatzleistung bei der Screening-Analyse und die Reagenzwirtschaft verbessert werden.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die Entwicklung von Schleimhautimpfstoffen, indem adsorbierte Antigene vor dem Abbau stabilisiert werden und die immunologische Relevanz erhöht wird.
- Operativer Wert: Erleichtert die skalierbare Herstellung von sporenbasierenden Biokatalysatoren für die präklinische Untersuchung der Enzymaktivität.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in frühe Entdeckungsworkflows als Darstellungssystem zur Target-Validierung, geht mittels quantifizierbarer Adsorptionsmessungen in das Screening über und unterstützt die präklinische Kontinuität durch wiederverwendbare Antigen-/Enzympräsentation.
- Entdeckungsbasierte Biologie: Ermöglicht die funktionelle Untersuchung von Protein-Kandidaten mittels Oberflächendarstellung ohne genetische Modifikation.
- Screening: Erzeugt quantitative Fluoreszenz- und Densitometrie-Daten, um die Adsorptionseffizienz unter verschiedenen Bedingungen zu vergleichen.
- Analytik: Nutzt integrierte Dichtemessungen basierend auf ImageJ und Kalibrierung mittels Dot-Blot für eine präzise Quantifizierung gebundener und ungebundener Anteile.
- Translationale Forschung: Erschließt Anwendungen in der Entwicklung von Impfstoffen und Biokatalysatoren durch stabilisierte, oberflächenpräsentierte funktionelle Proteine.
- Unternehmerische Wiederverwendung: Stellt Sporen als regenerierbare Plattform für wiederholte Adsorptionszyklen dar und reduziert so die langfristigen Reagenzkosten.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit, indem die Proteintätigkeit und -struktur durch Sporenstabilisierung erhalten bleibt.
- Operationaler Wert: Standardisiert die Proteindarstellung mittels reproduzierbarer Adsorptionsprotokolle und Waschschritte.
- Strategischer Wert: Verringert biologische Risiken in fortgeschrittenen Entwicklungsstadien, indem rekombinante Organismen vermieden und eine umweltverträgliche Anwendung ermöglicht wird.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Weiterentwicklung von Impfstoff- und Enzymkandidaten durch wiederverwendbare, nicht GMP-konforme Darstellungssysteme.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Proteinkennzeichnung, Fluoreszenzmikroskopie und Dot-Blot-Analyse.
- Hängt vom Zugang zu Zentrifugen, Rüttelschüttlern, Fluoreszenzmikroskopen und ImageJ für die Quantifizierung ab.
- Erfordert die Standardisierung der Bindungspufferbedingungen und Sporenreinigung über verschiedene Arbeitsgruppen hinweg.
- Die Adsorptionseffizienz variiert je nach Proteinoberflächenchemie und erfordert eine empirische Optimierung pro Zielstruktur.
- Das Wiederverwenden von Sporen ist durch einen schrittweisen Aktivitätsverlust über mehrere Zyklen hinweg begrenzt, was regelmäßige Qualitätskontrollen notwendig macht.
