Induktion und Bewertung der Graft-Versus-Host-Krankheit in einem xenogenen Murine-Modell und Quantifizierung menschlicher T-Zellen in Mausgeweben mit digitaler PCR

Dieses Protokoll beschreibt, wie Xenograft-versus-Host-Krankheit oder XenoGVHD induzieren kann, und wie man blind ist und klinische Saat standardisiert, um konsistente Ergebnisse zu gewährleisten. Das xenoGVHD-Modell bietet eine In-vivo-Methode zum Testen immunsuppressiver Therapien gegen menschliche statt murine T-Zellen, wodurch die Übersetzung dieser Studien in die Klinik verbessert wird. Demonstriert wird das Verfahren von Amara Seng, einer Doktorandin aus meinem Labor.

Einen Tag vor der Injektion acht bis zwölf Wochen alte, nicht fettleibige diabetische Sziden-Gamma- oder NSG-Mäuse in einen sterilisierten Tortenkäfig legen und die Mäuse in einer Cäsium-137-Quelle mit einer Gesamtdosis von 150 Centigrays bestrahlen, mit einer langsamen Rotation, um eine gleichmäßige Bestrahlung zu gewährleisten. Dann legen Sie die Mäuse über Nacht in saubere Käfige in einem sterilen Biosicherheitsschrank. Am nächsten Morgen sammeln Sie genügend gesundes menschliches Blut, um 1,1 mal 10 zu den sieben peripheren mononukleären Blutzellen oder PBMCs pro Maus zu isolieren und das heparinisierte Blut in einem gleichen Volumen von 2% fetalem Rinderserum oder FBS in PBS zu verdünnen.

Überlagern Sie bis zu 25 Milliliter des verdünnten Blutes vorsichtig auf 15 Milliliter Lymphozytentrennungsdichtegradientenmedium in einem 50-Milliliter konischen Rohr für die Dichtegradientenzentrifugation. Am Ende der Trennung ernten Sie die PBMC an der Schnittstelle und waschen Sie die Zellen in 10 Milliliter PBS in einem neuen 50-Milliliter-Konikonrohr. Aspirieren Sie den Überstand, und flicken Sie das Rohr, um das Pellet zu lösen.

Setzen Sie die PBMCs in 10 Milliliter frischer PBS für eine weitere Zentrifugation wieder auf, gefolgt von einer Resuspension in fünf Millilitern frischer PBS zum Zählen. Dann sammeln Sie die Zellen mit einer abschließenden Zentrifugation, und setzen Sie das Pellet mit einem Mal 10 bis zu den acht PBMCs pro Milliliter PBS-Konzentration wieder aus. Für die retroorbitale Lieferung des isolierten menschlichen PBMC in das Mausauge laden Sie eine Ein-Milliliter-Spritze mit einer 28-Spur-Nadel mit 100 Mikroliter Zellen.

Bestätigen Sie einen Mangel an Reaktion auf Zehenkneifen, und halten Sie die Maus vorsichtig mit dem Daumen und Mittelfinger zurück. Setzen Sie die Nadel abschrägend seitlich nach unten, seitlich in den medialen Canthus, durch die Bindehautmembran, bis die Rückseite des Auges erreicht ist. Ziehen Sie die Nadel leicht zurück, und injizieren Sie langsam das gesamte Volumen der Zellen.

Ziehen Sie dann die Nadel für die ordnungsgemäße Entsorgung der Spritze und Der Nadel vollständig zurück. Schließen Sie das Augenlid und nehmen Sie leichten Druck auf die Injektionsstelle mit einem Gazeschwamm. Dann untersuchen Sie die Injektionsstelle auf Schwellungen oder andere sichtbare Traumata, und lassen Sie die Maus das Bewusstsein in einem sterilen Käfig mit Papiertüchern ausgekleidet und Überwachung, bevor Sie das Tier in seinen Hauskäfig zu bewegen.

Um den GVHD-Score zu messen, legen Sie den Käfig in eine laminare Fließhaube und entfernen Sie das Futter und Wasser aus dem Käfig. Um die Aktivität zu bewerten, beobachten Sie das Verhalten der Mäuse für fünf Minuten. Um eine Gewichtsabnahme Punktzahl zu erhalten, wiegen Sie jede Maus in einem Glasbecher.

Während sich die Maus noch im Becher befindet, überprüfen Sie das Tier auf Haltung, Felltextur und Hautintegrität. Nach der Ernte der Gewebe von Interesse, schneiden Sie ein etwa drei mal 0,5-Millimeter-Stück Gewebe aus dem Organ, und wiegen Sie die Probe auf einem Gleichgewicht. Übertragen Sie das gewichtete Gewebe in ein steriles 1,5-Milliliter-Rohr und frieren Sie die Probe in flüssigem Stickstoff für die Nächtliche Lagerung bei minus 80 Grad Celsius ein.

Am nächsten Morgen, tauen Sie die Proben vor der Lyse, nach den Anweisungen aus einem genomischen DNA-Isolationskit. Für die menschliche T-Zell-Quantifizierung durch digitale Polymerase-Kettenreaktion(PCR) bereiten Sie digitale PCR-Reaktionen gemäß dem Protokoll für DNA-Bindungsfarbstoffe für die verwendete digitale PCR-Maschine vor und verwenden die entsprechenden Primer für die genomische DNA des menschlichen CD3-Epsilons. Führen Sie dann die digitale PCR-Reaktion unter den entsprechenden Reaktionsbedingungen aus.

Sublethal bestrahlte acht- bis zwölf Wochen alte NSG-Mäuse beiderlei Geschlechts, die menschliches PBMC erhalten, beginnen mit der Anzeige klinischer Anzeichen von GVHD um Tag 10 nach der Injektion im Vergleich zu Negativkontrollmäusen, die nur mit PBS behandelt wurden. XenoGVHD-Mäuse haben ein medianes Überleben von 23,5 Tagen. Mit Hilfe digitaler PCR können CD3-Epsilon-positive menschliche T-Zellen in der Lunge und Leberproben von Mäusen nachgewiesen werden, die menschliche PBMCs erhalten.

Es ist entscheidend, dass die Bewertung konsequent durchgeführt wird und dass der Forscher, der die Mäuse bewertet, für ihre Behandlung geblendet ist. Nach diesem Verfahren kann Serum von eingeschläferten Mäusen zur peripheren Zytokinexpressionsanalyse und Immunzellen aus der Milz zur Analyse mittels Durchflusszytometrie gesammelt werden.