Fluoreszierende Visualisierung von Mango-markierter RNA in Polyacrylamidgelen über eine Poststaining-Methode

Die hier gezeigte Mango-getaggte Gel-Bildgebungsmethodik ist robust und soll in Bezug auf Empfindlichkeit und Spezifität einfach erweitert werden können. Dies würde die routinemäßige Reinigung biologisch wichtiger RNAs und RNA-Komplexe durch den einfachen Zweck, der RNA von Interesse ein Mango-Tag hinzuzufügen, weiter vereinfachen. RNAs sind in immer mehr Krankheiten verwickelt, daher ist diese Post-Datierung-Methode eine einfache und schnelle Möglichkeit, RNA zu verfolgen und zu visualisieren.

Bei der Übertragung des Gels von einem Ort auf einen anderen ist zusätzliche Sorgfalt erforderlich, da die Gele zerbrechlich und bruchanfällig sind. Um ein 30-Milliliter-Denaturierungsgel herzustellen, wählen Sie zunächst den Polyacrylamid-Prozentsatz mit den entsprechenden Bromphenolblau- und Xylolcyanolfarbstoffen im Vergleich zu einer RNA von Interesse aus, um eine hohe Bandtrennung zu versichern. Mischen Sie dann die Lösungen A, B und C gemäß Tabelle 1 und fügen Sie APS und timud hinzu.

Gießen Sie die Gellösung sofort in ein geeignetes Gelgießgerät. Den gewünschten Kegel einsetzen und das Gel ca. 30 Minuten an polymerase lassen. Machen Sie den Geltank mit 1 XTBE-Lösung und entfernen Sie den Kegel sorgfältig.

Heben Sie das Gel vorsichtig an und montieren Sie es am Gelgerät und sichern Sie es mit Bindemittelclips. Mit einer Spritze die Brunnen unmittelbar vor der Probenbelastung aussaugen. Bereiten Sie 1X RNA-Proben vor, indem Sie den von Interesse sindden RNA-Proben eine 2X-Denaturierungs-Gel-Ladelösung hinzufügen.

Verwenden Sie einen Thermocycler, um die Proben bei 95 Grad Celsius für fünf Minuten zu erhitzen. Dann laden Sie gekühlte Proben mit Gel-Ladespitzen auf den Boden jedes Brunnens. Und nun, das Gel bei Raumtemperatur, das die Leistung effektiv niedrig gewährleistet, um die Glasplatte des Gelgeräts nicht zu knacken.

Bereiten Sie 1X Gel Färbung Lösung nach dem Manuskript in einem sauberen Glasbehälter, der breit genug ist, um bequem das Gel passen. Fügen Sie genügend 1X Gel-Färbung Lösung in den Behälter, so dass das Gel vollständig mit der Lösung bedeckt ist, wenn es auf einem Orbitalrotator platziert wird. Sobald das Gel fertig ist, entfernen Sie das Gel aus dem Gerät, schneiden Sie seine Brunnen und eine Ecke des Gels ab, um die Orientierung zu bestimmen.

Dann das Gel vorsichtig in die 1X Gel-Färbungslösung geben. Um die Bildgebung durchzuführen, dekantieren Sie sorgfältig die Färbelösung und spülen Sie das Gel schnell mit Wasser ab. Übertragen Sie schließlich das Gel vorsichtig auf das Tablett, das in den Imager gelegt werden soll.

Rollen Sie eine Glaspipette über das Gel, um eingeschlossene Blasen und überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. Und fahren Sie mit der Aufnahme eines Gelbildes fort. Mango-Aptamer eins, zwei, drei, vier waren im Wesentlichen gegen Denaturierung bis zu etwa einer molaren Harnstoffkonzentration.

20 bis 40 Minuten Färbezeit reichten für maximale Gelblüten. Längere Zeit war nicht geeignet für kleine RNAs in dieser Studie verwendet, wie sie begannen, aus dem Gel zu diffundieren. Die Fluorometeranalyse zeigte, dass mango aptamers eins, zwei und drei in Gegenwart von Harnstoff schneller falten konnte als Aptamer vier.

In Ermangelung von Harnstoff war das Falten viel schneller als erwartet. Die Empfindlichkeit der Post-Färbungsmethode wurde durch einzelne Bänder gezeigt, die gut gefalteten RNAs für jede der Mango-Varianten in nativen und denaturierenden Gelen mit einer etwas geringeren Empfindlichkeit für die spätere entsprechen. Die Quantifizierung der nativen Gele war über eine Größenordnung hinweg mit Mango eins, zwei und vier, die sich linearer als Mango drei verhalten.

Die Quantifizierung von denaturierenden Gelen war linearer, was darauf hindeutet, dass das Vorhandensein von Harnstoff im denaturierenden Gel eine homogenere Möglichkeit bieten könnte, die Aptamer zu falten, sobald sie in die TO1-Biotin-Färbungslösung gelegt werden. Mango-getaggte RNAs können in Gegenwart von Gesamt-RNA mit TO1-Biotinfärbung im Vergleich zu SG-Färbung nachgewiesen werden. Denken Sie daran, sicherzustellen, dass der Gel-Färbungsbehälter groß genug ist, um das Gel zu passen, sonst kann das Gel auf sich selbst falten.

Die RNA-Proben werden von einem Ort zum anderen übertragen. Ähnlich wie bei den denaturierenden Gelen kann diese Methode für ein natives Gel durchgeführt werden. Führen Sie das Gel in einem kalten Raum mit einer niedrigeren Wattleistung, um die nativen Bedingungen zu erhalten.