Name: Wholemount In Situ Hybridisierung für Astyanax Embryonen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Lernen Sie die Wholemount-In-Situ-Hybridisierung für Astyanax mexicanus Embryonen. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung von Genexpressionsmustern mit minimalem Hintergrundsignal und vereinfacht komplexe Protokolle für die Entwicklungsbiologie.

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Die Autoren möchte Mitglieder des Brutto-Labors für die hilfreichen Kommentare auf diesem Manuskript danken. Wir wollen vier Schülerinnen und Schüler zu würdigen, die dieses Protokoll während Sommerpraktika in 2017 und 2018, darunter Christine Cao, Michael Warden, Aki Li und David Nwankwo genutzt. HL wurde im Sommer 2017 durch ein UC-Biologie-STEM-Stipendium unterstützt. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse von der National Science Foundation (DEB-1457630, JBG), National Institute of Dental und Craniofacial Forschung (NIH; DE025033, JBG).

Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) von der University of Cincinnati (Protokoll Nr. 10-01-21-01) genehmigt.
1. Fixierung
<ol><li>Isolieren Sie gewünschte Anzahl von Astyanax Mexicanus Embryonen aus einem Zucht-Tank zu und beheben Sie ~ 50 Embryonen zu einem Zeitpunkt. Wenn Embryonen groß und alt sind, kann es 25 gleichzeitig auch Fixierung darauf festzulegen sein.</li>
	<li>Je nach Alter des Embryos nutzen Sie die IACUC erprobte Methode der Anästhesie. Für ältere Embryonen mit ein funktionierendes Nervensystem Embryonen über Narkose Überdosierung zu opfern. Entsprechend legen Sie Embryonen in einer Lösung von ~ 1 % Tricaine (gepuffert pH 7.4) zur Minimierung von Schmerzen und Beschwerden für den Organismus.</li>
	<li>Sobald die Embryonen nicht zu berühren reagieren, ersetzen Sie System wasserhaltigen Tricaine zu, und ~ 1 mL 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS, pH 7.4).</li>
	<li>Entfernen Sie die PBS-Lösung, und fügen Sie 1 mL 4 % Paraformaldehyd (PFA). Beheben von Embryonen über Nacht bei 4 ° C. Achtung: PFA ist gefährlich (d. h. es ist brennbar und ist ein Haut- und Lungenkrebs Reizstoffe), pfleglich zu behandeln.</li>
</ol>(2) Dehydratation
<ol><li>Um die Embryonen zu entwässern, die Fixativ Lösung entfernen und Spülen mit 1 mL PBS. Legen Sie bei Spülen Embryo-haltigen Fläschchen in einem Winkel (zwischen 30° und 45°), auf einem Plattform-Shaker. Weiterhin die Embryonen zweimal, 5 min pro Waschgang waschen.</li>
	<li>Wenn Embryonen noch ein Chorion haben, setzen Sie alle 50 Embryonen in einem 100 mm x 25 mm Petrischale und isolieren Sie sorgfältig von den Chorions mit zwei Sätzen von Uhrmacher Pinzette (z. B. #5 Zangen) unter dem Mikroskop zu. Hinweis: Während die Schritte unten, und für den Rest des Protokolls, entfernen Sie vorsichtig alle Flüssigkeit aus dem vorherigen Schritt mit sauberen, Glas Pasteur Pipetten, bevor Sie die nächste Lösung hinzufügen</li>
	<li>Pausiert die Embryonen in einer Reihe von zunehmend konzentrierte wäscht von Methanol (MeOH) beschrieben. Die Verdünnungen basieren auf einem 1 mL Gesamtvolumen mit 500 µL Lösung in jedem 4 mL Glasflasche. Führen Sie alle Schritte der Dehydrierung bei Raumtemperatur (RT) auf Plattform Shaker.<ol>
<li>Entfernen Sie vorsichtig die PBS-Lösung. Fügen Sie eine 25 % ige MeOH Lösung (250 µL MeOH) + 750 µL PBS. Auf einer Plattform Shaker für 5 min schütteln.</li>
		<li>Entfernen Sie vorsichtig die 25 % MeOH Lösung. Fügen Sie eine 50 % ige MeOH Lösung (500 µL MeOH) + 500 µL PBS. Auf einer Plattform Shaker für 5 min schütteln.</li>
		<li>Entfernen Sie vorsichtig die 50 % MeOH Lösung. Fügen Sie eine 75 % ige MeOH Lösung (750 µL MeOH) + 250 µL PBS. Für 5 Minuten auf einer Plattform Shaker schütteln.</li>
		<li>Entfernen Sie vorsichtig die 75 % MeOH Lösung. Fügen Sie eine 100 % MeOH Lösung (1 mL MeOH). Auf einer Plattform Shaker für 5 min. Wiederholen Sie diese Schritt 3 Mal schütteln Sie vorsichtig.</li>
	</ol>
</li>
	<li>An diesem Punkt speichern Sie dehydrierte Embryonen Bedarf in ihre Glasfläschchen bei-20 ° C (langfristig). Alternativ gehen Sie direkt zu Tag 1 des Protokolls.</li>
</ol>3. Tag 1: Rehydratation
<ol><li>Erhalten Sie dehydrierte Embryonen von-20 ° C Gefrierschrank zu (oder gehen Sie direkt von Schritt 2.5).</li>
	<li>Sortieren Sie die Embryonen mit einer Pasteurpipette. Man kann anhand Morphotyp (d.h., Höhle und/oder Oberfläche) sortieren, und die Anzahl der Gene beurteilt jedes Experiment. Es gibt in der Regel nicht mehr als 12 Embryonen pro Fläschchen einmal sortiert. Um die Organisation zu erhalten, verwenden Sie farbige Lab Band, um Fläschchen und Pipetten für jedes Gen zu benennen. Embryonen bleiben in der gleichen Flasche in das gesamte Protokoll. Hinweis: Statt der Pasteur Pipettenspitze in 100 % verwendet EtOH zwischen sterilisieren.</li>
	<li>Stellen Sie schütteln Wasserbad auf 70 ° C in einem späteren Schritt verwendet werden. Vorsichtig, MeOH in Fläschchen von sortierten Embryonen herauszuziehen und ersetzen mit 500 µL des neuen 100 % MeOH. Waschen Sie kurz (~ 1 min) auf Plattform Shaker.</li>
	<li>Rehydrieren Sie Embryonen in eine zunehmende Konzentration von 1 X PBS mit Tween 20 (PBT, siehe unten) auf Plattform Shaker. Die Verdünnungen basieren auf einem Volume 1 mL Endverdünnung mit 500 µL gehen in jedes Fläschchen.<ol>
<li>Fügen Sie eine 25 % PBT Lösung (250 µL PBT, 750 µL MeOH). Auf einer Plattform Shaker für 5 min schütteln.</li>
		<li>Entfernen Sie vorsichtig die 25 % PBT-Lösung. Fügen Sie eine 50 % PBT Lösung (500 µL PBT, 500 µL MeOH). Auf einer Plattform Shaker für 5 min schütteln.</li>
		<li>Entfernen Sie vorsichtig die 50 % PBT-Lösung. Fügen Sie eine 75 % PBT Lösung (750 µL PBT, 250 µL MeOH). Auf einer Plattform Shaker für 5 min schütteln.</li>
		<li>Entfernen Sie vorsichtig die 75 % PBT-Lösung. Fügen Sie eine 100 % PBT-Lösung (1 mL PBT). Auf einer Plattform Shaker für 5 min. Wiederholen Sie diese Schritt 3 Mal schütteln Sie vorsichtig.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Tag 1: Verdauung und Fixierung
<ol><li>Bereiten Sie eine Proteinase K (PK) Lösung durch Zugabe von 1 µL PK (20 mg/mL), 2 mL PBT.</li>
	<li>Erhalten Sie im Vorgriff auf spätere Schritte eingefrorenen aliquoten Hybridisierung Puffer (Hyb- und Hyb +; zusätzliche Datei 2 und zusätzliche Datei 3zu sehen) und PFA von-20 ° C Lagerung.<ol>
<li>Lassen Sie PFA bei RT Auftauen</li>
		<li>Legen Sie Aliquote Hyb - und Hyb + in einem rotierenden 70 ° C-Wasserbad. Legen Sie alle Reagenzien und Fläschchen in einem kleinen "Dichtung" mit einem Netz-Boden im Inneren der schwimmenden Wasser Bad Apparat. Dies ermöglicht einfaches hinzufügen und Entfernen von Röhren und Fläschchen aus dem rotierenden 70 ° C-Wasserbad.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fügen Sie sanft PK-Lösung für die Durchstechflasche(n) Embryonen gewährleisten allen Geweben sind komplett mit Lösung bedeckt. Embryonen für ~ 12 min in PK funktionierende Lösung auf der Plattform-Shaker zu verdauen. Hinweis: Die Länge der Verdauung kann variiert werden, vom Prüfer um optimale Ergebnisse zu gewährleisten.</li>
	<li>Die PK-Lösung ziehen Sie vorsichtig ab und kurz überschwemmen Sie das Fläschchen mit PBT, alle übrigen PK zu verdünnen</li>
	<li>Die PBT-Lösung ziehen Sie ab und ersetzen Sie durch neue PBT 500 µL. Lassen Sie die Lösung auf der Plattform Shaker für 5 min spülen.</li>
	<li>PBT abziehen und ersetzen mit 500 µL aufgetauten 4 % PFA. Ermöglichen Sie die Embryonen für 20 min auf der Plattform Shaker bei RT inkubieren</li>
	<li>Beziehen Sie die 4 % PFA, und kurz überschwemmen das Fläschchen mit PBT, alle übrigen PFA zu verdünnen. Die PBT abziehen und mit 500 µL frische PBT ersetzen. Lassen Sie Embryonen für 5 min auf der Plattform Shaker ausspülen. Wiederholen Sie diesen Schritt 4 weitere Male.</li>
</ol>5. Tag 1: Prehybridization
<ol><li>Platz 500 µL vorgewärmten Hyb-Lösung in die Flasche. Legen Sie vorsichtig das Fläschchen in der 70 ° C Wasser Bad (in Dichtungen) ohne schütteln, für 5 Minuten.</li>
	<li>Die Hyb-Lösung abziehen und das Fläschchen mit 500 µL vorgewärmten Hyb + Lösung zu überfluten. Platzieren Sie das Fläschchen zurück in die 70 ° C-Wasserbad mit schütteln (40 u/min). Inkubieren entweder 4 Stunden oder über Nacht. Hinweis: Eine 4 h Inkubation erbringt ein komplettes in-situ-Protokoll, das für insgesamt 4 Tage dauern wird. Hier präsentiert sich dieser Schritt als eine Übernachtung Inkubation, die eine Dauer von 5 Tagen insgesamt Protokoll Ausbeute wird.</li>
</ol>6. Tag 2: Hybridisierung
<ol><li>Legen Sie eine Aliquote von Hyb + aus dem Tiefkühler-20 ° C in dem Schütteln heißen Wasserbad für 5 min.</li>
	<li>Ziehen Sie der Hyb ab + aus dem Fläschchen und mit 500 µL vorgewärmten Hyb + zu ersetzen. Diese Lösung fügen Sie vorsichtig 2 µL RNA-Sonde für jedes Fläschchen hinzu. Vorsichtig schwenken das Fläschchen um gleichmäßige Verteilung der Sonde zu gewährleisten.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Hyb + (mit zusätzlichen Sonde) Lösung in der 70 ° C heißen Wasserbad über Nacht unter Schütteln bei 40 u/min. Hinweis: Man kann Hyb + (mit Sonde) Lösung erneut verwenden. Dafür nehmen Sie Hyb + mit Sonde aus dem ersten Lauf aus dem Gefrierschrank-20 ° C und es in ein heißes Wasserbad für 5 min. ersetzen Hyb + ab dem Tag 1 Protokoll mit Hyb + mit Sonde und Inkubation über Nacht im heißen Wasserbad zu ermöglichen.</li>
</ol>7. Tag 3: Vorbereitung der Lösung
<ol><li>Bereiten Sie Mikrozentrifugenröhrchen beschriftet Hyb + mit der "gen-of-Interest" RNA-Sonde vor. Bereiten Sie die Serie von Verdünnungen, die tagsüber 3 verwendet werden.<ol>
<li>Mit 6 separaten Röhren, bereiten Sie die folgende Reihe von Verdünnungen von Hyb und Kochsalzlösung Natriumcitrat (SSC, 0 bis 100 %) in einer 1 mL Volumen und Stelle sie in den 70 ° C schütteln Wasserbad: Rohr 1 = 100 % Hyb-(1 mL Hyb-): 2 = 25 % Tube 2 X SSC (250 µL 2 X SSC, 750 µL Hyb-); 3 = 50 % 2 X SSC Rohr (2 X SSC, 500 µL Hyb - 500 µL); 4 = 75 % 2 X SSC Rohr (2 X SSC, 250 µL Hyb - 750 µL); Schlauch 5 = 100 % 2 X SSC (1 mL 2 X SSC); Rohr 6 = 100 % 0,2 X SSC (2 mL 0,2 X SSC). Hinweis: Der Konzentration von SSC, wachsam sein, wie es ändert sich von 2 X 0,2 X.</li>
		<li>Mit 4 Rohre zu trennen, die folgende Reihe von Verdünnungen von PBT und SSC in einem Volumen von 1 mL vorbereitet und legen Sie bei RT: Rohr 1 = 25 % PBT (250 µL PBT, 750 µL 0,2 X SSC); Rohr 2 = 50 % PBT (500 µL PBT, 500 µL 0,2 X SSC); Rohr 3 = 75 % PBT (750 µL PBT, 250 µL 0,2 X SSC); Rohr 4 = 100 % PBT (1mL PBT).</li>
		<li>Bereiten Sie ein Röhrchen mit 2 mL Maleic Acid-Puffer mit Tween 20 (MABT) funktionierende Lösung.</li>
		<li>Bereiten Sie zwei 15 mL konische Röhrchen Lösung zu blockieren. In jedem Röhrchen 0,2 g blocking Reagenz zu 10 mL MABT hinzufügen (siehe ergänzende Datei 4). Legen Sie beide Röhren auf ein Nutating Mixer (oder Plattform Shaker) bis vollständig in Lösung (max. 3 h) aufgelöst.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. Tag 3: Sonde entfernen
<ol><li>Hyb + (mit Sonde) Lösung mit einem Glas Pasteurpipette ziehen Sie ab und in eine sterile, mit der Bezeichnung Microcentrifuge Schlauch. Behalten Sie diese Röhre in den Gefrierschrank-20 ° C für eine spätere Verwendung (wenn Sonde Kennzeichnung erfolgreich ist).</li>
	<li>Fügen Sie sorgfältig 500 µL warmen SSC/Hyb-Verdünnungen (unten angegeben). In jedem der folgenden Lösungen für 10 min bei 70 ° C schütteln Wasserbad inkubieren.<ol>
<li>Mit 100 % gegenüber dem Vorquartal inkubieren Hyb-(1 mL Hyb-), 25 % 2 X SSC (250 µL 2 X SSC, 750 µL Hyb-), 50 % 2 X SSC (500 µL 2 X SSC, 500 µL Hyb-), 75 % 2 X SSC (750 µL 2 X SSC, 250 µL Hyb-), 100 % 2 X SSC (1 mL 2 X SSC) , 100 % 0,2 X SSC (2 mL 0,2 X SSC).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nach dem letzten Schritt in jedem der folgenden Lösungen für 10 min inkubieren. Alle der folgenden Inkubationen statt bei RT auf der Plattform-Shaker: 25 % PBT (250 µL PBT, 750 µL 0,2 X SSC), 50 % PBT (500 µL PBT, 500 µL 0,2 X SSC), 75 % PBT (750 µL PBT, 250 µL 0,2 X SSC) , 100 % PBT (1 mL PBT).</li>
	<li>Nach einer Inkubationszeit von 10 min, entfernen Sie die 100 % PBT, und fügen Sie 500 µL MABT in jedes Fläschchen. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal für 5 Minuten.</li>
</ol>9. Tag 3: Sperrung
<ol><li>Entfernen Sie MABT aus jedem Fläschchen und Flut mit vorgemischten blockierende Lösung eines der Rohre (vorbereitet in Schritt 7.1.4). Ort-Fläschchen auf ein Nutating Mixer für ~ 4 h bei RT</li>
	<li>Fügen Sie 2 µL Anti-DIG-AP Fab-Fragmente, das zweite Fläschchen 10 ml Lösung (in Schritt 7.1.4 vorbereitet) und kurz Wirbel blockieren.</li>
	<li>Füllen Sie jedes Fläschchen fast vollständig mit blockiert Lösung (ca. 5 mL) und auf Nutating Mixer über Nacht im Kühlschrank bei 4 ° C.</li>
</ol>10. Tag 4: MABT Spülungen
<ol><li>Bereiten Sie ein Lager Fläschchen mit 10 % normalem Ziegenserum (NGS) in MABT (100 µL NGS 900 µL MABT hinzufügen).</li>
	<li>Zeichnen Sie die blockierenden Lösung in jedes Fläschchen und fügen Sie 500 µL NGS/MABT Mischung in jedes Fläschchen. Lassen Sie die Embryonen für 25 min bei RT auf der Plattform Shaker auszubrüten.</li>
	<li>Ersetzen Sie die NGS/MABT Mischung mit 500 µL 100 % MABT. 30 min bei RT auf der Plattform Shaker inkubieren. Führen Sie diese spülen 11 Mal mehr tagsüber alle 30 Minuten.</li>
	<li>Füllen Sie das Fläschchen mit 100 % MABT und Platz auf einem Nutating Mixer über Nacht im Kühlschrank oder begehbare Kammer bei 4 ° C.</li>
</ol>11. Tag 5: Sonde Visualisierung
<ol><li>Bereiten Sie eine 50 mL Aliquot der alkalischen Phosphatase (AP) Puffer (siehe ergänzende Datei 5). Kombinieren Sie die folgenden in einem 50 mL konische Röhrchen eingewickelt in Alufolie, Belichtung zu begrenzen: 5 mL 1 M Tris (pH 9,5), 5 mL 50 mM MgCl2, 5 mL von 1 % Tween 20, 5 mL 1 M NaCl, 30 mL ddH2O.</li>
	<li>MABT entfernen und ersetzen mit 1 mL AP Puffer (Rohr in Folie gewickelt). Lassen Sie es für 5 min waschen. Tun Sie dies zweimal, um vollständige Entfernung von MABT zu gewährleisten.</li>
	<li>AP-Puffer zu entfernen und ersetzen Sie durch 1 mL der AP-Puffer mit 5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate 3,5 μl (BCIP) und 4.5 μL der Nitro-blau Tetrazoliumsalz (NBT). Ersetzen Sie mit frisch zubereiteten AP Puffer/NBT/BCIP einmal stündlich bis Reaktion abgeschlossen ist. Überwachen Sie, prüfen alle 15 min, damit kann die Färbung Reaktion stattfinden, bis die gewünschte Färbung erreicht ist. Wenn Niederschlag zu bilden beginnt, ersetzen Sie früher die Lösung.</li>
	<li>Hören Sie auf, die Färbung Reaktion durch Spülen der Embryonen in frische 100 % AP Puffer (ohne NBT/BCIP) für 5 min. weiter Spülungen in PBT bis optimale Signal (mit minimalen Mengen an Hintergrundfärbung) erreicht werden. Weiterspülen Exemplare mit zunehmender Verdünnungen von PBT in AP Puffer wie folgt: 25 % PBT (250 μL der PBT, 750 μl des AP-Puffer), Spülen für 5 min; 50 % PBT (500 μL der PBT, 500 μL des AP-Puffer), Spülen für 5 min; 75 % PBT (750 μl des PBT, 250 μL des AP-Puffer), für 5 min spülen.</li>
	<li>Spülen Sie Embryonen in ~ 5 mL 100 % PBT auf Nutating Mixer bis minimale Hintergrundfärbung gewünscht erreicht wird. Wechseln Sie mit frischen PBT mehrmals. Dies kann bis zu mehreren Tagen dauern.</li>
	<li>Beim Spülen vollständig, waschen Embryonen in 500 μl steriler PBS auf einer Plattform-Shaker ist. Durchführen Sie diese Spülung zweimal für 5 min. Nachdem PBS wäscht, Post-fix die Exemplare in 500 μl 4 % PFA für 1 h bei RT auf einer Plattform-Shaker. Alternativ zu beheben über Nacht in 1 mL 4 % PFA im Kühlschrank bei 4 ° C.</li>
	<li>Ersetzen Sie das Fixiermittel mit frischen, sterilen PBS. Führen Sie diese spülen mindestens zweimal für 5 min. Platz die Embryonen in ~ 4 mL 100 % sterile PBS und lagern langfristig bei 4 ° c</li>
</ol>12. Abbildung
<ol><li>Eine Speicherfolie in einer Petrischale mit 3 % Agarose und TAE Puffer bilden. Hinweis: Mengen hängen davon ab, wie viele Platten benötigt werden. Platten können mehrmals wiederverwendet werden. Es empfiehlt sich, eine flache rechteckige Form in der Petrischale gelegt wird, während das Gel abkühlt, um eine Depression zur Eindämmung der Embryonen auf der Platte zu schaffen.</li>
	<li>Legen Sie die Embryonen auf dem Teller in der PBS. Hinweis: Es empfiehlt sich, vorsichtig gießen Embryonen auf den Teller statt pipettieren sie aus, denn es festgestellt wurde, dass sie an der Innenseite der Kunststoff Pipetten haften.</li>
	<li>Verwenden Sie Lichtmikroskopie, um jedem Embryo sichtbar zu machen. Verwenden Sie eine stumpfe Sonde Embryonen in gewünschte Position zu manövrieren.</li>
	<li>Nehmen Sie ein Bild, wenn der Embryo in der gewünschten Position ist. Beachten Sie, dass es wichtig ist, Bilder von Embryonen in ein paar Wochen der abgeschlossenen Färbung zur Vermeidung von möglichen Abbau von Fleck zu nehmen.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Aufgrund der Anfälligkeit der RNA zu einer Verschlechterung betrifft einer der wichtigsten Schritte im Protokoll die sterile Synthese der RNA-Sonde. Jedoch wenn eine Sonde sorgfältig erzeugt wird und gute Ergebnisse liefert, kann es in folgenden befleckenden Reaktionen wiederverwendet werden. Ein zweiter wichtiger Schritt ist die sorgfältige Herstellung der alle Reagenzien im gesamten Protokoll. Da dieses Protokoll mehrere Tage und viele kleine Schritte umfasst, ist es wichtig, dass alle Reagenzien genau produziert und s...

In-situ Hybridisierung ist eine gängige Methode zur Färbung von festen Gewebe um gen-Expression-Muster1zu visualisieren. Diese Technik ist seit Jahren in anderen traditionellen2 und nicht-traditionellen3 -Modellsysteme, für eine Vielzahl von biologischen Studien durchgeführt. Allerdings sind mehrere Schritte und Reagenzien notwendig, um dieses Verfahren erfolgreich durchführen. Für Forscher, die diese Technik noch nie durchgeführt haben, kann es aufgrund der vielen Schritte einschüchternd sein, den Prozess zu initiieren. Weiter, die langwierige Natur dieses Verfahren eignet sich für technische Fehler, die schwierig sein können, um zu beheben.
Das übergeordnete Ziel dieses Artikels ist es, eine einfache und unkomplizierte Methode vorstellen, die diese Hybridisierung-Technik für ein breites Publikum zugänglich machen wird. Um die Einführung von Fehlern zu reduzieren, stellen wir eine einfache Lösung, die liefert hochwertige gen Ausdruck Färbung und unspezifische Hintergrundsignal minimiert. Dieses Verfahren ist ähnlich wie andere Ansätze, die in traditionellen Modellsysteme wie Danio Rerio4entwickelt. Wir wollen hier, sorgfältige Umsetzung der einzelnen Schritte anhand einer herunterladbaren Checkliste (ergänzende Datei 1), sorgfältige Durchführung des Protokolls zu fördern. Die Begründung hierfür ist Organisation durch die vielen Schritte in diesem Verfahren zu erleichtern. Dieser Artikel eignet sich für Forscher interessiert bei der Durchführung von in-situ Hybridisierung vollständig-hängen bei der Entwicklung von Embryonen, aber noch nicht das Verfahren durchgeführt. Der Vorteil des gewählten Ansatzes für Astyanax Forscher ist, dass es getestet wurde und in Cavefish und Oberfläche Fisch verwandelt, wodurch vergleichende Expressionsanalysen bewährt. Die vorgestellte Methode kann durch Forscher in Studien über Astyanax und anderen Systemen verwendet werden.

<table><tbody><tr><td>10 mL Serologische Pipette</td><td>VWR</td><td>89130-888</td><td></td></tr><tr><td>1000 mL Filtrationseinheit</td><td>VWR</td><td>89220-698</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Konisch</td><td>VWR-Greiner</td><td>82050-278</td><td></td></tr><tr><td>25 mL Serologische Pipette</td><td>VWR</td><td>89130-890</td><td></td></tr><tr><td>250 mL Filtrationseinheit</td><td>VWR</td><td>89220-694</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Serologische Pipette</td><td>VWR</td><td>89130-886</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Konisch</td><td>VWR-Falcon</td><td>21008-940</td><td></td></tr><tr><td>500 mL Filtrationseinheit</td><td>VWR</td><td>89220-696</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Digoxigenin-AP, Fab-Fragmente</td><td>Sigma-Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>BCIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8503-1G</td><td>1 g</td></tr><tr><td>Blockierungslösung</td><td>Sigma-Roche</td><td>11 096 176 001</td><td>50 g</td></tr><tr><td>Zitronensäure</td><td>Fisher Scientific</td><td>A104-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)</td><td>Sigma-Roche</td><td>11175025910</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Tubes</td><td>VWR</td><td>20170-577</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher-Decon</td><td>04-355-223</td><td>1 Gal</td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17899</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Dram-Fläschchen aus Glas</td><td>VWR</td><td>66011-041</td><td>1 Dr</td></tr><tr><td>Glaspipetten</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-8A</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Thermal-ScientificPharmco-AAPER</td><td>284000ACS</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>H3393-25KU</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid-kristallin</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Maleinsäure</td><td>Sigma</td><td>M0375-100g</td><td>100g</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452-4</td><td>4 l</td></tr><tr><td>Wasser in Molekularqualität (RNase-frei)</td><td>VWR</td><td>7732-18-5</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>Scientific S271-3</td><td>3 kg</td></tr><tr><td>NaOH Pellets</td><td>Fisher</td><td>Scientific S318-500 500</td><td>g</td></tr><tr><td>NBT Substratpulver</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>34035</td><td>1 g</td></tr><tr><td>Normales Ziegenserum</td><td>Fisher-Invitrogen</td><td>31873</td><td></td></tr><tr><td>Nutating Mixer</td><td>VWR</td><td>82007-202</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>158127-500g</td><td>500 g</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399-20</td><td>20L</td></tr><tr><td>Proteinase K (200mg/10ml)</td><td>Qiagen</td><td>19133</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>Kunststoffpipetten</td><td>VWR-Samco</td><td>14670-147</td><td></td></tr><tr><td>RNAse</td><td>Sigma</td><td>R2020-250mL</td><td>250 mL</td></tr><tr><td>Schüttelwasserbad 12 l</td><td>VWR</td><td>10128-126</td><td>12 l</td></tr><tr><td>Standard Analog Shaker</td><td>VWR</td><td>89032-092</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma Millipore-OmniPur</td><td>9210-500GM</td><td>500 g</td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Hefe Fisher-Invitrogen</td><td>15401011</td><td>25 mg</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P9416-50mL</td><td>50 mL</td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>Fisher Scientific-Scientific Industries, Inc</td><td>50-728-002</td><td></td></tr><tr><td>Lithiumchlorid (LiCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>203637-10G</td><td>10 g</td></tr></tbody></table>

wholemount in situ hybridisierung für astyanax embryonen

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

In den letzten Jahren wurde eine Entwurf Genom für die blinde mexikanischen Cavefish (Astyanax Mexicanus) freigegeben, enthüllt die Sequenz Identitäten für Tausende von Genen. Frühere Forschung in diesem aufstrebenden Modellsystem aktiviert auf umfassende genomweite Untersuchungen, die zahlreiche quantitative Trait Loci (QTL) verbunden mit verschiedenen Höhle verbundenen Phänotypen identifiziert haben. Die Möglichkeit, Gene von Interesse, die erbliche Grundlage für phänotypische Veränderung verbinden bleibt jedoch eine große Herausforderung dar. Eine Technik, die tieferes Verständnis für die Rolle der Entwicklung in der Troglomorphic Evolution erleichtern kann, ist vollständig-hängen in-situ-Hybridisierung. Diese Technik kann implementiert werden, um direkt vergleichen Genexpression zwischen Höhle und Oberfläche Wohnformen, Anwärter Gene zugrunde liegenden etablierten QTL, Gene Interesse von Next Generation Sequencing Studien zu identifizieren oder entwickeln andere Entdeckung-basierte Ansätze. In diesem Bericht stellen wir ein einfaches Protokoll, unterstützt durch eine flexible Checkliste, die für den Einsatz auch außerhalb des Studiensystems der vorgestellten weit angepasst werden kann. Es ist zu hoffen, dass dieses Protokoll für die Astyanax Gemeinschaft und darüber hinaus als eine umfassende Ressource dienen kann.

In diesem Bericht stellen wir einen einfachen und unkomplizierten Ansatz zur Kennzeichnung von embryonalen Astyanax Exemplare für qualitativ hochwertige gen Expressionsanalyse durchführen. Diese Technik kann in vier oder fünf Tagen durchgeführt werden, und jeder wesentlichen Schritt im Verfahren ist in eine farbcodierte Flussdiagramm (Abbildung 1) vertreten. Einmal abgeschlossen, sollte gebeizt Embryonen ein dunkles Lila chromatische Label in Geweben...

Dieses Protokoll ermöglicht die Visualisierung der Genexpression in embryonalen Astyanax Cavefish. Dieser Ansatz wurde mit dem Ziel der Maximierung der gen-Expression-Signal, bei gleichzeitiger Minimierung der unspezifischen Hintergrundfärbung entwickelt.

Wholemount In Situ Hybridisierung für Astyanax Embryonen

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

Unser In-situ-Protokoll ist wichtig, weil es eine einfache Möglichkeit bietet, Genexpressionsmuster mit minimaler Hintergrundfärbung zu visualisieren. Diese Technik macht ein kompliziertes und langwieriges Protokoll relativ einfach durchzuführen. Benchtop richtet Vorschläge und Checklisten ein, die dieses Protokoll noch einfacher machen, um richtig zu arbeiten und zu reproduzieren.Während die hier gezeigten Techniken spezifisch für Astyanax mexicanus sind, könnte es wahrscheinlich an andere Systeme vergleichbar großer Individuen mit kleinen Anpassungen des Protokolls angepasst werden. Verwenden Sie zunächst farbiges Laborband, um Fläschchen und Pipetten für jedes Gen zu bestimmen. Sortieren Sie die Embryonen mit einer Pasteur-Pipette.Es gibt in der Regel nicht mehr als 12 Embryonen pro Durchstechflasche, einmal sortiert. Als nächstes stellen Sie ein schüttelendes Wasserbad auf 70 Grad Celsius. Ziehen Sie das Methanol sorgfältig in die Fläschchen sortierter Embryonen und ersetzen Sie es durch 500 Mikroliter frisches 100%Methanol.Waschen Sie die Embryonen kurz für etwa eine Minute auf einem Plattform-Shaker. Danach rehydrieren Sie die Embryonen in einer zunehmenden Konzentration von 1x PBS mit Tween 20 auf einem Plattform-Shaker, wie im Textprotokoll beschrieben. Um zu beginnen, legen Sie eine kleine Dichtung mit einem Netzboden in das rotierende Wasserbad, das auf 70 Grad Celsius vorgewärmt wurde.Setzen Sie Aliquots von Hybridisierungspuffer minus und Hybridisierungspuffer plus in die Dichtung. Fügen Sie den Durchstechflaschen von Embryonen vorsichtig eine vorbereitete PK-Lösung hinzu, um sicherzustellen, dass alle Gewebe vollständig in Lösung abgedeckt sind. Übertragen Sie die Fläschchen auf einen Plattform-Shaker und lassen Sie sie in der Proteinase K Arbeitslösung für ca. 12 Minuten verdauen.Danach die PK-Lösung vorsichtig abziehen und die Durchstechflasche kurz mit PBT überfluten, um die restliche PK zu verdünnen. Ersetzen Sie die PBT-Lösung durch 500 Mikroliter frisches PBT und lassen Sie die Lösung fünf Minuten lang auf dem Plattform-Shaker abspülen. Dann ersetzen Sie die PBT-Lösung durch 500 Mikroliter aufgetaut4%PFA. Lassen Sie die Embryonen auf der Plattform schütteln bei Raumtemperatur für 20 Minuten.Um mit der Vorhybridisierung zu beginnen, fügen Sie den embryonalen Fläschchen 500 Mikroliter vorgewärmten Hybridisierungspuffer minus Lösung hinzu. Die Fläschchen vorsichtig in die Dichtung im Wasserbad bei 70 Grad Celsius legen, ohne fünf Minuten zu zittern. Als nächstes ziehen Sie den Hybridisierungspuffer minus Lösung ab und überfluten Sie die Fläschchen mit 500 Mikrolitervorwärmungspuffer plus Lösung.Legen Sie die Fläschchen wieder in die Dichtung im Wasserbad und bebrüten Sie vier Stunden oder über Nacht mit Schütteln. Um mit der Hybridisierung zu beginnen, ziehen Sie den Hybridisierungspuffer plus aus den Durchstechflaschen und ersetzen Sie ihn durch 500 Mikroliter frisch vorgewärmten Hybridisierungspuffer plus. Fügen Sie vorsichtig zwei Mikroliter RNA-Sonde zu jeder Durchstechflasche hinzu und wirbeln Sie vorsichtig, um eine gleichmäßige Verteilung der Sonde zu gewährleisten.Inkubieren Sie im Wasserbad bei 70 Grad Celsius über Nacht, während sie bei 40 Umdrehungen um 40 Umdrehungen abschütteln. Zu Beginn bereiten Sie Mikrozentrifugenröhren mit der Bezeichnung Hybridisierungspuffer plus mit dem Gen von Interesse RNA-Sonde, wie im Textprotokoll beschrieben. Legen Sie zwei 15-Milliliter konische Schläuche und fügen Sie 0,2 Gramm blockierendes Reagenz und 10 Milliliter MABT hinzu.Legen Sie beide Schläuche auf einen Nutatmischer, bis das Reagenz vollständig in der Lösung gelöst ist. Mit einer gläsernen Pasteurpipette ziehen Sie den Hybridisierungspuffer plus und die Sondenlösung ab und legen Sie ihn in ein steriles, beschriftetes Mikrozentrifugenrohr. Bewahren Sie diese Röhre bei minus 20 Grad Celsius für die zukünftige Verwendung im Gefrierschrank auf.500 Mikroliter des warmen saline Natriumcitrats und Hybridisierungspuffers minus Verdünnungen vorsichtig hinzufügen. Insekubieren Sie in sequenziellen Lösungen für jeweils 10 Minuten im schüttenden Wasserbad und dann bei Raumtemperatur auf einem Plattform-Shaker, wie im Textprotokoll beschrieben. Ersetzen Sie nach der letzten Inkubation die 100%PBT aus jeder Durchstechflasche durch 500 Mikroliter MABT.Wiederholen Sie diesen Vorgang zweimal für jeweils fünf Minuten. Entfernen Sie zunächst den MABT aus jeder Durchstechflasche und überfluten Sie ihn mit einer vorgemischten Blockierlösung aus einem der 15-Milliliter-Konusrohre. Legen Sie beide Fläschchen vier Stunden bei Raumtemperatur auf den Nutmischer.Fügen Sie zwei Mikroliter der Antikörperfragmente in die zweite Röhre der vorbereiteten Blockierlösung und kurz Wirbel. Dann jede Durchstechflasche fast vollständig mit Sperrlösung füllen und bei vier Grad Celsius über Nacht auf einen Nussmischer im Kühlschrank legen. Zu Beginn bereiten Sie eine Durchstechflasche mit 10%NGS in MABT vor.Ersetzen Sie die Blockierlösung in jeder Durchstechflasche durch 500 Mikroliter dieser NGS-Lösung. 25 Minuten bei Raumtemperatur auf dem Plattform-Shaker inkubieren. Danach die NGS-Mischung durch 500 Mikroliter 100%MABT ersetzen.Inkubieren Sie auf dem Plattform-Shaker bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Wiederholen Sie diese Spüle 11 weitere Male im Laufe des Tages, alle 30 Minuten. Dann jede Durchstechflasche mit 100%MABT füllen und bei vier Grad Celsius über Nacht auf einen Nussmischer im Kühlschrank stellen.Ersetzen Sie zunächst den MABT in jeder Durchstechflasche durch einen Milliliter AP-Puffer und lassen Sie ihn fünf Minuten waschen. Wiederholen Sie diese Wäsche zweimal, um den MABT vollständig zu entfernen. Ersetzen Sie dann den AP-Puffer durch einen Milliliter frischen AP-Puffer, der 3,5 Mikroliter BCIP und 4,5 Mikroliter MBT enthält.Ersetzen Sie dies durch eine frische Mischung aus AP-Puffer, der den BCIP und MBT jede Stunde enthält, bis die Reaktion abgeschlossen ist, und stellen Sie sicher, dass die Reaktion genau überwacht wird und alle 15 Minuten überprüft wird, bis der gewünschte Färbegrad erreicht ist. Beenden Sie die Färbungsreaktion, indem Sie die Embryonen in einer zunehmenden Konzentration von 1X PBT im AP-Puffer, wie im Protokoll beschrieben, spülen. Spülen Sie die Embryonen in etwa fünf Milliliter n.A. 100%PBT auf einem Nutatmischer, bis die gewünschte minimale Hintergrundfärbung erreicht ist.Wenn die Spülung abgeschlossen ist, waschen Sie die Embryonen in 500 Mikroliter sterilen PBS auf einem Plattform-Shaker und postfixieren Sie die Proben, wie im Textprotokoll beschrieben. Nach dem Spülen der Embryonen in vier Milliliter 100% sterile PBS legen und bei Bedarf langfristig bei vier Grad Celsius lagern. In dieser Studie werden embryonale Astyanax-Proben für eine hochwertige Genexpressionsanalyse gekennzeichnet.Dieser Prozess wurde sowohl in Pachon-Höhlenfischen als auch in Oberflächenfischen erfolgreich umgesetzt. Höhlenfisch-Embryonen, die für den Sox9-Ausdruck gekennzeichnet sind, zeigen eine klare Kennzeichnung in den sich entwickelnden Zweigbögen und der Brustflosse. Beachten Sie, dass Färbung praktisch fehlt im Dottersack oder die sich entwickelnden Soden an der Flanke.In ähnlicher Weise ist die Tfap2a-Expression in den Teilen des sich entwickelnden Kopfes als frühe Migration neuronaler Kammzellen entlang der dorsalen Flankenregion des Embryos zu erkennen. Das dritte Gen, das für Höhlenfische embryonal präsentiert wird, Phf20a, ist in den Teilen des somatischen Mesoderms und des hinteren Kopfes zu sehen, die dazu bestimmt sind, knöchernes Gewebe hervorzurufen. Oberflächenfischembryonen, die für CXCR gekennzeichnet sind, zeigen eine positive Kennzeichnung in isolierten Bereichen des Kopfes und der Flanke sowie einige einzelne Zellen, die den Dottersack überlagern.Das Gen Adcyap1a wird in Regionen des zentralen Nervensystems einschließlich Hypophysenzellen exprimiert. Beachten Sie die hochspezifische Expression in gepaarten bilateralen Zellclustern auf den dorsalen Aspekt des Embryos sowie einen größeren Bereich der Mittellinienexpression. Das letzte Gen, das auf Höhlenfisch-Embryonen untersucht wurde, Sox10, ist als früher Marker des neuralen Kamms auf der linken und rechten Seite des dorsalen Embryos offensichtlich.Nach Abschluss in situ stellen wir uns unsere Ergebnisse in der Regel mit Hilfe der Lichtmikroskopie ab. Es ist am besten, dies innerhalb von zwei Wochen nach Abschluss zu tun, um eine Verschlechterung der Färbung zu vermeiden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Dieses Video zeigt 2-Farben-whole mount in situ Hybridisierung, eine Methode, durch die die räumliche und zeitliche Expressionsmuster von 2 unterschiedlichen Genen visualisiert werden bei jungen Hühnerembryonen kann. Diese Methode wurde ursprünglich von David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham und David Ish-Horowicz eingeführt.

Doppel Whole Mount in situ Hybridisierung von Anfang Hühnerembryonen

Dieses Video zeigt whole mount Immunhistochemie, eine Methode, durch die die räumliche und zeitliche Expressionsmuster eines Antigens visualisiert werden bei jungen Hühnerembryonen kann. Diese Methode wurde ursprünglich von Jane Dodd und Tom Jessell eingeführt.

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Der Xenopus laevis Embryo ist aufgrund seiner Größe und Leichtigkeit der Manipulation weiterhin außerordentlich nützlich bei der Erforschung der frühen Entwicklung.   Es wird ein vereinfachtes Protokoll für das Whole Mount in situ Hybridisierungsprotokoll zur Verfügung gestellt, das bei der Identifizierung spezifischer Organe in diesem Modellsystem verwendet werden kann.

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Die Zebrafischembryo ist ein hervorragendes Modell für Entwicklungsbiologie Forschung. Während der Embryogenese entwickeln Zebrafisch mit einem Dottermasse, die dreidimensionale Herausforderungen für die Proben Beobachtung und Analyse präsentiert. Dieses Protokoll beschreibt, wie man zweidimensionale Flachmontage Zubereitungen der ganze Berg in situ (WISH) gefärbt Zebrafischembryo Proben erstellen.

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Wir präsentieren hier ein optimiertes Protokoll zur Genotypisierung, Färbung und Vorbereitung fötaler Mäuse für die Bildgebung von peripheren Nozizeptoren-Axonprojektionen im gesamten Tier, als effektive Methode zur Beurteilung sensorischer Axonwachstumsphänotypen bei der Entwicklung gentechnisch veränderter Mäuse.

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Die Knoten und notochordal Platte sind vergänglich Signalisierung Organisatoren bei der Entwicklung von Mäuseembryonen, die mit mehreren Techniken visualisiert werden können. Hier beschreiben wir im Detail wie Sie zwei Techniken ihre Struktur und Morphogenese durchführen: 1) Rasterelektronenmikroskopie (SEM); und 2) ganze Berg Immunfluoreszenz (WMIF).

Visualisierung der Knoten und Notochordal Platte In Gastrulating Maus-Embryonen mittels Rasterelektronenmikroskopie und ganze Mount Immunfluoreszenz

Hier wird ein Protokoll zur Ganzmontage-IN-situ-RNA-Hybridisierungsanalyse in Zebrafischen und Rohrbildungs-Assay in patientenabgeleiteten induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Endothelzellen vorgestellt, um die Rolle von Endoglin bei der Gefäßbildung zu untersuchen.

Ganz-Mount-In-Situ-Hybridisierung in Zebrafisch-Embryonen und Tube-Formations-Assay in iPSC-ECs zur Untersuchung der Rolle von Endoglin in der Gefäßentwicklung

Lernen Sie die Wholemount-In-Situ-Hybridisierung für Astyanax mexicanus Embryonen. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung von Genexpressionsmustern mit minimalem Hintergrundsignal und vereinfacht komplexe Protokolle für die Entwicklungsbiologie.

Wholemount In Situ Hybridisierung für Astyanax Embryonen

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