Name: Agrobacterium Tumefaciens und Agrobacterium Rhizogenes-vermittelte Umwandlung der Kartoffel und die Promotoraktivität eines Suberin-Gens durch GUS Staining (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-29T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Lernen Sie die Agrobacterium-vermittelte Transformation von Kartoffelpflanzen mit A. tumefaciens und A. rhizogenes. Diese Methode ermöglicht die schnelle Bewertung von Genfunktionen und Promotoraktivität durch GUS-Färbung in transgenen Wurzeln.

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Diese Arbeit wurde von dem Ministerio de Innovación y Ciencia (AGL2009-13745, FPI Grant, PB), Ministerio de Economía y Competitividad und FEDER Mittel (AGL2012-36725, AGL2015-67495-C2-1-R) und der Universität Girona (Promotionsstipendium an SF und Grant unterstützt. SING11/1). Die Autoren sind dankbar, dass Dr. Inge Broer (Institut für Landnutzung, Universität Rostock, Rostock, Deutschland) und Dr. Salomé Prat (Centro Nacional de Biotecnología, Madrid, Spanien) für die Bereitstellung der A. Rhizogenes und A. Tumefaciens Belastung, bzw., und Dr. Marçal Soler und Dr. Anna Plasencia für die Hilfe und Unterstützung bei der Einleitung von A. Rhizogenes Transformation Experimente (Toulouse III Universität Paul Sabatier-CNRS, Plant Research Laboratory (LRSV), Kastagnetten eine (Frankreich). Die Autoren danken Sara Gómez (Departament de Biologia, UdG, Girona) für ihre wertvolle Unterstützung bei der Durchführung der Laborarbeit und die Betreuung der Pflanzen, und Ferran Fontdecaba und Carla Sánchez, die unterstützt mit einige der Experimente, während sie dabei waren Ihre endgültige Diplomarbeiten.

A. Rhizogenes Umwandlung Protokoll wurde angepasst und modifiziert von Horn Et Al.7 und der Genotyp getestet wurde S. Tuberosum Ssp. Tuberosum (CV Désirée). A. Tumefaciens Umwandlung Protokoll wurde angepasst und geändert von Banerjee Et Al.22 und die Genotypen getestet wurden S. Tuberosum Ssp. Tuberosum (CV Désirée) und S. Tuberosum SSP. Andigena. Die wichtigsten Schritte der beiden Verfahren sind in Abbildung 1 und Abbildung 2, bzw. zusammengefasst.
Hinweis: In allen Phasen des Verfahrens, die Durchführung von in-vitro- Transfers schnell zu tun, und wenn möglich, beibehalten der Teller oder Töpfe geschlossen, somit minimieren Anlage in die Luft, welken und Kontamination zu vermeiden. Anders angegeben, wurden alle Pflanze Inkubationen in Schränken unter den Bedingungen des 12 h von 24 ° C Licht/12 h 20 ° C dunkel und 67 µmol m-1 s-1durchgeführt. Führen Sie anders angegeben, alle Bakterien Manipulation und in-vitro- Pflanzen Transfers unter aseptischen Bedingungen in einer Laminar-Flow-Haube. Die Medien-Rezepte für Agrobacterium und in-vitro- Pflanzen-Kulturen sind in Tabelle S1vorgesehen.
Vorsicht: Hinterlegen Sie alle gentechnisch veränderten Bakterien und Pflanzen, um die entsprechenden Abfallbehälter.
1. Agrobacterium Kulturen für die Transformation verwendet
Hinweis: Der Stamm für A. Rhizogenes Transformation verwendet wurde die C58C1:Pri15837 (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. Inge Broer) und das für die A. Tumefaciens war die GV2260 (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. Salomé Prat). A. Rhizogenes wandelte sich mit der binären Vektor PK7GWIWG2_II-RedRoot (VIB-Abteilung der Pflanze Systembiologie an der Universiteit Gent; http://gateway.psb.ugent.be), die eine T-DNA tragen einen Transformation Marker zur Überwachung der behaarte Wurzel enthält Bildung. Um die transformierten Wurzeln von A. Rhizogenes und A. Tumefacienserzeugt zu vergleichen, wurden beide mit binären Vektor pKGWFS7 transformiert enthält eine T-DNA tragen der FHT-Promoter fahren das Reportergen β-Glucoronidase (GUS) und Kanamycin-Resistenz-Gen wie eine auswählbare Markierung15.
<ol><li>Wählen Sie eine Kolonie von Agrobacterium und wachsen sie über Nacht (O/N) in einem 50 mL Zentrifugenröhrchen bei 28 ° C mit Schütteln bei 200 u/min in 5 mL YEB Medium mit Antibiotika (Tabelle S1) ergänzt.</li>
	<li>Für A. Tumefaciens Transformation, Messung die optische Dichte, die OD600 sein muss = 0,6-1,0.<ol>
<li>Wenn die optische Dichte höher ist, machen eine Subkultur auf OD600 senken = 0,3 mit frischen Medien und warten, bis die Kultur OD600 erreicht = 0,6-1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zentrifugieren Sie 1 mL Agrobacterium Kultur bei 3.000 X g in einer Benchtop-Zentrifuge für 10 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Entfernen des Überstands durch pipettieren und Aufschwemmen Zellen in 1 mL frisches YEB Medium ohne Antibiotika. Wiederholen Sie diesen Schritt, um die vollständige Entfernung von Antibiotika zu gewährleisten.<ol>
<li>A. Tumefaciens Transformation, in der letzten Wiederfreisetzung hinzufügen der entsprechende YEB Volumen um eine endgültige optische Dichte OD600 zu erhalten = 0,8.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Halten Sie Zellen auf Eis, während der Vorbereitung der Pflanzen infiziert werden.</li>
</ol>(2) Pflanzenmaterial für transformation
<ol><li>Machen Sie ein oder zwei Knoten Stamm Stecklinge entweder mit der apikalen oder die Hilfs Knospen von sterilen in Vitro Kartoffelpflanzen (Spenderpflanzen); für 3 bis 4 Wochen (Abbildung 1A und Abbildung 2A) in festen 2MS Medium in Töpfen wachsen.</li>
</ol>3. Pflanzen Sie Transformation mit A. Rhizogenes (Abbildung 1)
Hinweis: Dieses Verfahren ermöglicht die Erlangung der transformierten behaarte Wurzeln. Um die Expression des Transgens zu bewerten, braucht man eine Negativkontrolle. Vorbereiten der Negativkontrolle, folgen den Anweisungen, die mit einer A. Rhizogenes Sorte entweder untransformierten oder mit leerer Vektor transformiert, das Markergen Transformation enthält.
<ol><li>Verwenden Sie frische Medien Platten; Alternativ können die Platten bei 4 ° C mit dem Deckel nach oben, dicht mit Klarsichtfolie um Medien Dehydrierung zu vermeiden gehalten werden. Um den quadratischen Medien Platten vorzubereiten, neigen sie ~ 15°, füllen sich mit 40 mL von MS, und ließ sie erstarren. Dies minimiert den Kontakt der Luft Teil der Pflanze mit dem Medium.</li>
	<li>Sehr sorgfältig eine Spender-Pflanze aus dem 2MS Medium zum Übertragen einer quadratischen Platte 120 mm x 120 mm</li>
	<li>Zu einem Stamm Internodium 3 μL der A. Rhizogenes Kultur mit einer chirurgischen Nadel injiziert, und wiederholen Sie es zweimal pro Pflanze in verschiedenen Internodien wenn möglich. Bitte beachten Sie jeder Injektion als unabhängige Transformationsereignis (Abbildung 1 b).</li>
	<li>Übertragen Sie sofort die gesamte Anlage auf eine quadratische Platte mit festem MS Medium mit 0,1 mM Acetosyringone ergänzt. Platz für 2 Pflanzen pro Platte. Hinweis: Die 1 M Acetosyringone Stammlösung wird in DMSO vorbereitet und kann bei-20 ° c gelagert werden</li>
	<li>Die Dichtplatte mit chirurgischen Klebeband und ordnen sie vertikal im Inneren ein Wachstum Schrank für 4 Tage.</li>
	<li>Übertragen Sie die Pflanze auf eine neue quadratische Platte mit MS Medium ergänzt mit Cefotaxim Natrium [500 µg/mL], A. Rhizogeneszu töten.</li>
	<li>Nach 10-12 Tagen startet behaarte Wurzeln (Abbildung 1,1D) angezeigt werden. Dann, Verbrauchsteuern Sie die native Wurzeln der Pflanze, und übertragen Sie die Anlage auf eine neue quadratische Platte mit MS Medium ergänzt mit Cefotaxim Natrium [500 µg/mL]. Hinweis: Transformierte behaarte Wurzeln können durch rote Fluoreszenz überprüft werden, wenn Sie einen DsRed Transformation Marker (Abbildung 3D) zu verwenden.</li>
	<li>Um ein zusammengesetztes Werk (Abbildung 1E) zu erhalten, lassen Sie die transgenen behaarte Wurzeln wachsen seit ca. 3-4 Wochen in MS Medium ergänzt mit Cefotaxim Natrium [500 μg/mL] (das Medium wechseln jede Woche).</li>
	<li>Je nach Verwendungszweck propagieren Sie die transgenen behaarte Wurzeln und den Negativkontrollen wie folgt.<ol>
<li>Übertragen Sie die ganze zusammengesetzte Pflanze auf eine Hydrokultur (Tabelle S2) oder Boden-Medium für massive Entwicklung ermöglichen.</li>
		<li>Um individuell die transformierten behaarte Wurzeln ausbreiten, mit einem Skalpell schneiden Sie die Wurzeln mit dem Ausdruck des Markers rot fluoreszierende Transformation (DsRed Protein) Wenn sie 4 bis 8 cm lang (Abb. 1E) und übertragen Sie sie in eine Petrischale mit festem Medium Gamborg B5 mit 2 % Saccharose und Cefotaxim Natrium [500 μg/mL] ergänzt. Versiegeln Sie die Platten mit Kunststofflabor Film zu und wachsen sie im Dunkeln bei 20 ° C. Hinweis: Die Wurzeln können manipuliert werden, unter einem Stereomikroskop ausgestattet, um die Fluoreszenz unter sterilen Bedingungen erkennen (siehe Tabelle der Materialien).</li>
		<li>Für die Erzeugung von Biomasse (z.B. gen Expressionsanalyse) eine 5 cm langen behaarten Wurzel schneiden und in einer 150 mL Erlenmeyerkolben mit 20 mL des flüssigen Mediums Gamborg B5 ergänzt mit 2 % Saccharose und Cefotaxim Natrium [500 µg/mL] zu verbreiten. Für 6 Wochen im Dunkeln bei 20 ° C und 60 u/min wachsen.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59119/59119fig1v3.jpg"> Abbildung 1: Timeline zu Kartoffel transgenen behaarte Wurzeln mit A. Rhizogenes. Die kumulative Wochen zu jeder Phase des Transformationsprozesses und die nachfolgenden Schritte, die haarigen Wurzeln wachsen werden angezeigt. Repräsentative Bilder von verschiedenen Phasen dargestellt: die Einleitung des Prozesses mit 3 Wochen altes Baby in-vitro- Pflanzen (A), dann Infektion der Pflanzen durch die Injektion von A. Rhizogenes (B), die Bildung von der proliferativen Gewebe (C, Pfeile) mit aufstrebenden behaarte Wurzeln (D), und die entwickelten behaarte Wurzeln rot fluoreszierende Transformation Marker DsRed (E) zum Ausdruck zu bringen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59119/59119fig1v3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
4. Pflanzen Sie Transformation mit A. Tumefaciens (Abbildung 2)
Hinweis: Dieses Verfahren ermöglicht die Erlangung der transformierten Pflanzen. Um das Transgen Effekt zu bewerten, braucht man eine Negativkontrolle. Eine Möglichkeit ist, das Verfahren mit einer A. Tumefaciens mit leerer Vektor transformiert zu folgen. Alternativ können die Wildtyp-Pflanzen verwendet werden.
<ol><li>Schneiden Sie und legen Sie ein Blatt aus den 3-4 Wochen alten Pflanzen (Abbildung 2A) in einer Petrischale. Mit einem Skalpell schließen Sie der Blattstiel aus und kürzen Sie quer (1-3 je nach Blattgröße) von der Mitte des Blattes auf die Kanten vermeiden sie abzuschneiden (Abb. 2 b).</li>
	<li>Sofort legen Sie das Blatt schwimmt auf 10 mL frisches 2MS flüssige Medien in einer Petrischale mit der abaxial Seite oben und schließen Sie die Platte. Wiederholen Sie der Schritt, die Platz für bis zu 15 Blätter für CV Désirée und 25 Blätter für SSP einNdigena (abhängig von der Blattgröße).</li>
	<li>Fügen Sie sofort 80 µL A. Tumefaciens Kultur am OD600 = 0,8 in flüssigen Medien und homogenisieren die Platte manuell für 1 min um die bakterielle Lösung zu verteilen.</li>
	<li>Sorgfältig mit Film Abdichtung dichten Sie ab, mit Alufolie decken Sie ab und inkubieren Sie für 2 Tage in einer Kammer bei 24 ° C, die Transformation auftreten zu lassen.</li>
	<li>Übertragen Sie die Blätter halten abaxial Seite bis zum CIM Medium (Abb. 2 b) und inkubieren sie für eine Woche im Kabinett ein Wachstum.<ol>
<li>Kratzen Sie das CIM-Medium mit der Pinzette, so dass die Blätter auf dem Medium besser untergebracht werden können.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Übertragen Sie die Blätter halten abaxial Seite bis zum SIM-Medium (Abbildung 2) und inkubieren sie in einem Schrank, erfrischend das Medium alle 7-10 Tage, bis die Triebe sind ca. 2 cm hoch Wachstum.<ol>
<li>Kratzen Sie SIM-Medium mit der Pinzette, so dass die Blätter vollständig von den Medien umgeben sein können. Wenn die entstandenen Triebe den Deckel erreichen, arbeiten mit hohen Petrischalen (100 x 20 mm, Höhe x Durchmesser). Hinweis: Die Hornhaut wird nach 2-3 Wochen in SIM-Medium (Abb. 2D) und die Triebe nach 6-7 Wochen (Abbildung 2E) bilden. Die Triebe gelten als unabhängige Transformation Ereignisse aus, wenn sie von Kallus gebildet aus unabhängigen Wunden entstehen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Schnitt drei schießt aus jeder Kallus (als das gleiche Transformationsereignis) entstanden (Abb. 2E), Transfer, Kulturflaschen mit MG Medium ergänzt mit Cefotaxim Natrium [250 mg/L] erlauben, Verwurzelung, beschriften Sie die Teilmenge mit einer Reihe und inkubieren Sie in einen Schrank für 3-4 Wochen oder bis die Triebe kräftig (Abb. 2F) Wachstum. Hinweis: Wenn die Triebe schneiden, entfernen Sie auch die Hornhaut sonst die Wurzel nicht bilden.<ol>
<li>Wiederholen Sie den Schritt so oft wie unabhängige Linien benötigt werden. Bis zu 5 verschiedenen Transformation können Veranstaltungen platziert werden, in einem Kultur-Kolben mit einem Durchmesser von 8 cm, vertrauensvoll zu arbeiten, die die Pflanzen aus verschiedenen Veranstaltungen nicht gemischt werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wählen Sie die kräftigste Pflanze jedes Ereignisses, schneiden Sie die apikale Segment des Shootings mit 3-4 Internodien und legen Sie sie in eine neue Kultur-Kolben mit 2MS Medium mit Cefotaxim Natrium [250 mg/L] ergänzt. Hinweis: In 3-6 Wochen wachsen die Pflanzen effizient entwickeln, ein kräftiges Shooting und Wurzeln.<ol>
<li>Zurückbringen der Kammer die nicht ausgewählten Triebe bis die ausgewählte Pflanze voll entwickelt hat.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Geschnitten Sie Stamm Segmente aus der Pflanze mit mindestens einem Internodium oder mit der apikalen Knospe und übertragen Sie sie auf neue 2MS Medium mit Cefotaxim [250 mg/L] ergänzt. Inkubieren sie im Kabinett Wachstum.<ol>
<li>Replizieren Sie alle 3-4 Wochen um die in-vitro- umgewandelt-Linien zu etablieren. Hinweis: Das Cefotaxim Natrium wird in mindestens drei nachfolgenden Überweisungen auf 2MS Medium um sicher zu sein benötigt, A. Tumefacienszu töten; Danach, wenn A. Tumefaciens Überwucherung zu beobachten ist, übertragen Sie die Pflanzen wieder auf 2MS Medien ergänzt mit Cefotaxim Natrium.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Um die Pflanze Phänotyp zu charakterisieren, übertragen Sie Pflanzen in Erde für ihre vollständige Charakterisierung oder Hydrokultur Kultur zur Wurzel Inspektion.<ol>
<li>Halten Sie die Knollen im Boden zu propagieren und behalten die etablierten Linien produziert.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59119/59119fig2.jpg"> Abbildung 2: Timeline zu Kartoffel verwandelt Pflanzen mit A. Tumefaciens. Die kumulative Wochen, jede Phase des Transformationsprozesses und die nachfolgenden Schritte, die Pflanzen wachsen zu erreichen sind gezeigt. Repräsentative Bilder von verschiedenen Phasen dargestellt: die Einleitung des Prozesses mit Blätter aus 3 - Wochen alten in-vitro- Pflanzen (A), die Übertragung der Verwundeten und infizierten Blätter an die CIM-Medien (B), die Blätter bei der Übertragung auf SIM-Medien (C), die Visualisierung der Kallus um die verwundeten Bereiche nach 2-3 Wochen in SIM-Medien (D), die schießen-Bildung nach 9-11 Wochen in SIM-Medien (E) und die Triebe nach MG Medien (F) übertragen werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59119/59119fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
5. Hydrokultur
<ol><li>Bereiten Sie die Hoagland Lösung um eine halbe Stärke (0,5 X) (Tabelle S2) in einen 10 L Eimer.</li>
	<li>Tauchen Sie eine Aquariumpumpe um Homogenität und ordnungsgemäße Sauerstoffbedingungen beizubehalten.</li>
	<li>Bedecken Sie die Wände des Eimers mit Alu-Folie, Wurzeln im Dunkeln wachsen.</li>
	<li>Übertragen Sie Vermeidung von Wurzelschäden, in-vitro- Pflanzen auf Hydrokultur. Hinweis: Entfernen Sie alle verbleibenden in-vitro- Medium aus Wurzeln, Mikroorganismus Verbreitung während der Inkubation durch Schütteln sorgfältig die Wurzeln in Wasser getaucht zu vermeiden.</li>
	<li>Decken Sie die Pflanzen mit transparenter Folie wie ein Gewächshaus, damit ausreichende Akklimatisierung und in der wachsenden Kammer inkubieren.</li>
	<li>Machen Sie Löcher in die Folie nach 3 Tagen und entfernen Sie es komplett eine Woche nach.</li>
	<li>Ersetzen Sie durch neue Medien alle 10 Tage.</li>
</ol>6. GUS histochemische Reporter-gen-Test
Hinweis: In unserem Fall die GUS erfolgte Analyse mit Wurzeln von 2-3 Wochen in Hydrokultur oder in Vitrogewachsen.
<ol><li>Befestigen Sie die Wurzeln mit 90 % gekühlt Aceton (V/V) und inkubieren Sie es 20 Minuten lang auf Eis.</li>
	<li>Führen Sie zwei Wäschen mit destilliertem Wasser.</li>
	<li>Fügen Sie frische GUS Färbelösung (Tabelle 1) und gelten Vakuum (-70 Pa) für 20 Minuten.</li>
	<li>Inkubation bei 37 ° C im Dunkeln zum Schutz der lichtempfindlichen GUS für 4 h oder bis eine blaue Farbe sichtbar ist. Hinweis: Das Vorhandensein von Ferri und Ferrocyanid in GUS Lösung minimieren die Diffusion von Reaktionsprodukten und liefern genauere Lokalisierung. Achtung: Verwenden Sie eine Abzugshaube und Schutzkleidung beim Umgang mit der giftige Zyanid-Derivate in GUS-Lösung (Kalium Ferricyanid und Kaliumferrocyanid). Das GUS-Substrat und die Entsorgung Material sollte sicher entsorgt werden.</li>
	<li>GUS Färbelösung zu entfernen und in entsprechenden Behältern entsorgen.</li>
	<li>Führen Sie zwei Wäschen mit Ethanol 70 % (V/V).</li>
	<li>Unter dem Hellfeld-Mikroskop beobachten. Hinweis: GUS Färbung bleibt für ein paar Wochen relativ stabil. jedoch während der ersten Woche der GUS-Signal ist klar und weniger ins benachbarte Zellen diffundiert. Bei längerer Lagerung das Rohr zu versiegeln und bei 4 ° c lagern</li>
</ol><img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/59119/59119tbl1.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 14px;"> Tabelle 1: GUS Färbung Lösung Rezept.

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<li>Ishida, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+transformation+of+maize+%28Zea+mays+L.%29+mediated+by+Agrobacteriumtumefaciens%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">High efficiency transformation of maize (Zea mays L.) mediated by Agrobacteriumtumefaciens.</a> Nature Biotechnology. 14 (6), 745-750 (1996).</li>
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</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenlegen.

In Kartoffel benutzt die häufigste System stabilere komplette transgene Pflanzen erhalten die Transformation durch Agrobacterium Tumefaciens Stämme, die Organogenese mit exogenen Phytohormone erfordern. Obwohl die Agrobacterium basierte Protokolle hat das Potenzial, T-DNA-Vektor Sequenz25zu integrieren, steht diese Methode immer noch die einfachste und weniger teuer Kartoffelpflanzen zu verwandeln. In letzten Jahren das Interesse an A. Rhizogenes-vermittelten Transformat...

Abgesehen von wirtschaftlichem Interesse hat die Erzeugung transgener Pflanzen eine eigene Bedeutung in der Forschung, um die ultimative Funktion von Genen zu demonstrieren und Pflanzenphysiologie und Entwicklung besser zu verstehen. Die am weitesten verbreitete Methode, denn Pflanze DNA-Aufnahme Agrobakterium-vermittelten Transformation. Agrobacterium Tumefaciens ist Krone Galls in das infizierte Gewebe viele Pflanzenarten durch die Einwirkung von seiner Tumor-Induktion (Ti) Plasmid zu generieren. Das Plasmid enthält eine T-DNA Region mit einer Reihe von Genen, die in das pflanzliche Genom integriert werden und induzieren Gewebe Entdifferenzierung1,2. Der Austausch dieser Gene innerhalb der T-DNA durch das Transgen ermöglichte die Generation werksbezogen Modifikationen phänotypische Effekte3zu vermeiden. Um das Transgen in die T-DNA Klonen zu erleichtern, hat die T-DNA Region in eine unabhängige Plasmid bezeichnet eine binäre Plasmid, während der Rest der Gene der Ti-Plasmid herausgeschnitten worden gewesen sein (die Virulenz-Gene, die die T-DNA-Transfer und Einfügung Mechanismen erlauben) in einem Plasmid Helfer platziert. Für Pflanzenbiotechnologieforschung, Transformation von A. Tumefaciens hat mehrere Vorteile: es braucht keine teuren Geräte, erzeugen sowohl stabil und transiente Pflanzentransformation und niedrige Zahlen des Gens Kopien integriert sind die Chromosom4. Die Generation der stabile Transformanten erfordert jedoch für die meisten Pflanzen, aber nicht, Arabidopsis Pflanze Regeneration von einem oder wenigen Zellen mit exogenen Phytohormone, macht diesen Prozess mühsam und zeitaufwendig. A. Rhizogenes ist auch in der Lage, das Pflanzengenom ändern Herstellung behaarte Wurzeln oder zufällige Wurzeln an den Standorten der Infektion durch die Expression von Rol (Wurzel Loci) Genen kodiert in den Wurzel-induzierende (Ri) Plasmid5. Obwohl weniger als A. Tumefaciensstudiert, wird A. Rhizogenes auch verwendet, für den Erhalt der transgenen Wurzeln. In diesem Fall enthält die A. Rhizogenes die original T-DNA in das Plasmid Ri und eine binäre Plasmid mit einer zweiten T-DNA tragen das Transgen. Wenn der Infektionsstelle Stängel oder Hypocotyle ist, kann ein zusammengesetztes Werk mit neuen behaarte transgenen Wurzeln aus Wildtyp-Shootings erhalten. Alternativ können behaarte transformierte Wurzeln autonom in Vitro in Medien mit Kohlenstoff Quelle Eingänge wachsen. Die Verwendung von A. Rhizogenes anstelle von A. Tumefaciens , transgene Gewebe zu produzieren ist Relevanz gewinnt, wenn die Wurzel das Zielorgan, ist weil Pflanze Regeneration nicht erforderlich ist und daher es schneller und weniger kostspielig ist. Frühere Studien zeigten diese Methodik für die phänotypische Charakterisierung der Wurzel bestimmter Gene6,7,8,9angeeignet.
Die Kartoffel (Solanum Tuberosum) ist die viertwichtigste Kulturpflanze der Welt laut der Ernährungs- und Landwirtschaftsorganisation der Vereinten Nationen (FAO) seit die Knolle ernährungsphysiologische Bedeutung für den menschlichen Verzehr als eine gute Quelle für Vitamine und Mineralien. Aus diesem Grund Kartoffel im Rampenlicht der landwirtschaftlichen Biotechnologie gelegt und gilt auch als ein gutes biologisches Modell für genetische und Entwicklungsbiologie10,11Studien. Kartoffel-Transformation trug wesentlich zum Verständnis der molekularen Mechanismen zugrunde liegenden suberized Gewebe durch die Charakterisierung von Genen beteiligt Suberin und Wachs Biosynthese12,13,14 ,15,16,17, Suberin Monomer Transport18 und Transkription Verordnung19. Das Suberin-Feruloyl-Transferase-gen, FHT, ist eines dieser charakterisiert biosynthetischen Gene; die Herunterregulierung gibt Anlass zu einer starken Beeinträchtigung des Schutzes Periderm, die mit einem starken Rückgang der ferulate Ester von Suberin und Wachse in Kartoffel Knollen14korreliert ist. Begleitend in Wurzeln und Samen von Arabidopsis zeigte der Ko von seiner vermeintlichen orthologs (ASFT/RWP1) auch seine Rolle in der Herstellung von Alkyl Ferulates Suberin20,21. In der Kartoffel zeigte die FHT transkriptionelle Reporter-Linie und der FHT-Antikörper bzw., dass die Promotoraktivität und das Protein in der Exodermis, die Endodermis der Phellogen-Derivate und verletzte Gewebe15befinden.
In dieser Arbeit zeigen wir ein Protokoll mit A. Rhizogenes transgenen behaarte Wurzeln produzieren, die in einem Wild-Typ-Shooting gepflegt sind, generiert composite Kartoffelpflanzen oder herausgeschnitten, um autonom in Vitrowachsen. Wir bieten auch das Protokoll mit A. Tumefaciens , um komplette transgenen Kartoffelpflanzen zu erhalten. Als Fallstudie werden A. Rhizogenes und A. Tumefaciens verwandelt mit der gleichen binären Vektor verwendet, um die Wurzeln mit dem FHT -Promotor fahren GUS -Reporter-gen-Expression zu erhalten. Die Ergebnisse sind gemeldet und verglichen.

<table><tbody><tr><td> Aceton </td><td> Panreac </td><td> 1.310.071.21 </td><td></td></tr><tr><td> Acetosyringon </td><td> Acros </td><td> 115540050 </td><td></td></tr><tr><td> Aquarienpumpe </td><td> Prodac </td><td> MP350 </td><td></td></tr><tr><td> Autoklav </td><td> Ragpa Strelimatic </td><td> </td><td></td></tr><tr><td> Bakteriologischer Agar </td><td> Lab Conda </td><td> 1800 </td><td></td></tr><tr><td> BAP </td><td> Duchefa < </td><td> p>B0904 </td><td></td></tr><tr><td> Rinderextrakt </td><td> Lab Conda </td><td> 1700 </td><td></td></tr><tr><td> Pflanzenzuchtschrank </td><td> Nuaire </td><td> </td><td></td></tr><tr><td> Carbenicillin </td><td> Duchefa </td><td> C0109 </td><td></td></tr><tr><td> Cefotaxim-Natrium </td><td> Duchefa </td><td> C0111 </td><td></td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Merck </td><td> 1029310161 </td><td></td></tr><tr><td> Ecotron infors </td><td> HT </td><td> 29378 </td><td></td></tr><tr><td> Ethanol </td><td> Merck </td><td> 1.009.831.011 </td><td></td></tr><tr><td> Falcon tube </td><td> Steuerungstechnik </td><td> CFT011500 </td><td></td></tr><tr><td> Ferricyanat </td><td> Sigma </td><td> 101001081 </td><td></td></tr><tr><td> Ferrocyanat </td><td> Sigma </td><td> 100979088 </td><td></td></tr><tr><td> Kolben (8,06 cm Durchmesser und 11,3 cm Höhe) und Kunststoffdeckel für in vitroKultur </td><td> Apiglass </td><td> ref16 </td><td></td></tr><tr><td> GA3 </td><td> Sigma </td><td> G7645 </td><td></td></tr><tr><td> Gamborg B5 media </td><td> Duchefa < </td><td> p>G0210 </td><td></td></tr><tr><td> Gelrite </td><td> Duchefa </td><td> G1101 </td><td></td></tr><tr><td> Glucosa </td><td> Sigma </td><td> G5767 </td><td></td></tr><tr><td> Kanamycin </td><td> Sigma </td><td> K1377 </td><td></td></tr><tr><td> Leukoporband </td><td> BSN Leukopor<td> > BDF47467 </td><td></td></tr><tr><td> Lupe </td><td> Wild-Heerbrugg </td><td> M420 </td><td></td></tr><tr><td> Magnetschüttler </td><td> Agimatic </td><td> 7000243 </td><td></td></tr><tr><td> MES hydrate </td><td> Sigma </td><td> M2933-25G </td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td> Panreac </td><td> 131404 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop </td><td> Olympus </td><td> </td><td></td></tr><tr><td> Minufugenzentrifugue 5415R<td> > Eppendorf </td><td> </td><td></td></tr><tr><td> Murashige and Skoog media </td><td> Duchefa </td><td> M0254.0050 </td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td> Panreac </td><td> 131679 </td><td></td></tr><tr><td> NAA </td><td> Duchefa </td><td> N0903 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Panreac </td><td> 131659 </td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td> Sigma </td><td> 58282 </td><td></td></tr><tr><td> NightSea Stereo </td><td> SFA Moonting Adapter </td><td> </td><td></td></tr><tr><td> Parafilm </td><td> Anorsa </td><td> PRFL-001-001 </td><td></td></tr><tr><td> Pepton </td><td> Lab Conda </td><td> 1616 </td><td></td></tr><tr><td> Petrischalen (90 x 14) </td><td> Anorsa </td><td> 200200 </td><td></td></tr><tr><td> pHmeter </td><td> Crison < </td><td> p> </td><td></td></tr><tr><td> Phytotron </td><td> Inkoa </td><td> RFTI-R5485 </td><td></td></tr><tr><td> Pflanzen-Agar </td><td> Duchefa </td><td> P1001 </td><td></td></tr><tr><td> Refrigeratot </td><td> Liebherr Medline </td><td> </td><td></td></tr><tr><td> Rifampicin </td><td> Duchefa </td><td> R0146 </td><td></td></tr><tr><td> Spectinomycin </td><td> Sigma </td><td> 59007 </td><td></td></tr><tr><td> Spektralphotometer </td><td> Shimadzu </td><td> </td><td></td></tr><tr><td> Quadratische Platten (120 x 120) </td><td> Deltalab </td><td> 200204 </td><td></td></tr><tr><td> Streptomycin </td><td> Sigma </td><td> S6501 </td><td></td></tr><tr><td> Saccharose </td><td> Panreac</ </td><td> p> 131621 </td><td></td></tr><tr><td> Chirurgische Klingen </td><td> Swann-Morton </td><td> 201</p</td>> <td></td></tr><tr><td> Chirurgische Nadel </td><td> NIPRO </td><td> 015/0204 < </td><td></td></tr><tr><td> p>Triptone </td><td> Lab Conda </td><td> 1612 </td><td></td></tr><tr><td> Triton </td><td> Serva </td><td> 37240 </td><td></td></tr><tr><td> Unimax 1010 Shaker </td><td> Heidolph </td><td> </td><td></td></tr><tr><td> Vakuum </td><td> Dinko </td><td> </td><td></td></tr><tr><td> x-GlcA (5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-beta-D-glucuronsäure, Natriumsalz wasserfrei) </td><td> Biosynth </td><td> B-7398 </td><td></td></tr><tr><td> Hefeextrakt </td><td> Lab Conda </td><td> 1702.00 </td><td></td></tr><tr><td> Zeatin-Ribosid </td><td> Sigma < </td><td> p>1001042850 </td><td></td></tr></tbody></table>

agrobacterium tumefaciens und agrobacterium rhizogenes-vermittelte umwandlung der kartoffel und die promotoraktivität eines suberin-gens durch gus staining

Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining

Agrobakterium SP. gehört zu den am häufigsten verwendeten Methoden zu transgene Pflanzen zu erhalten, da es die Fähigkeit hat, zu übertragen und eine eigene T-DNA in das pflanzliche Genom zu integrieren. Hier präsentieren wir Ihnen zwei Transformationssysteme zur (Solanum Tuberosum) Kartoffelpflanzen gentechnisch zu verändern. A. Tumefaciens Transformation Blätter sind infiziert, die transformierten Zellen ausgewählt sind und eine neue komplette transformierte Pflanze regeneriert mit Phytohormonen in 18 Wochen. In A. Rhizogenes Verwandlung Stiele sind durch die Injektion von Bakterien mit einer Nadel infiziert, die neue entstandenen transformierten behaarte Wurzeln werden mit einem roten fluoreszierenden Marker erkannt und die nicht-transformierten Wurzeln entfernt werden. In ca. 5-6 Wochen ist die resultierende Anlage eines Verbundes aus einem Wildtyp-Shooting mit voll entwickelten transformierten behaarte Wurzeln. Um die Biomasse zu erhöhen, können die transformierten behaarte Wurzeln herausgeschnitten und selbst propagiert werden. Wir angewendet beide Agrobakterium -vermittelten Umwandlung Methoden um Wurzeln mit dem Ausdruck der GUS Reportergens angetrieben von einem Suberin biosynthetischen gen Förderer zu erhalten. Die GUS-Färbeverfahren wird zur Verfügung gestellt und ermöglicht es die Zelle Lokalisierung der Projektträger Induktion. Bei beiden Methoden zeigten die transformierten Kartoffel Wurzeln GUS Färbung im suberized Endodermis und Exodermis, und darüber hinaus in A. Rhizogenes verwandelt Wurzeln der GUS-Aktivität auch bei der Entstehung von Seitenwurzeln erkannt wurde. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass A. Rhizogenes ist ein schnell alternative Werkzeug, um die Gene zu studieren, die in Wurzeln zum Ausdruck kommen.

Agrobacterium rhizogenes -vermittelte Umwandlung der Kartoffel
In diesem Manuskript präsentiert das Schritt für Schritt Verfahren eingerichtet, um transformierte Wurzel mit A. Rhizogenes zu erhalten. Abbildung 1 zeigt eine Übersicht über das Verfahren, das insgesamt rund 5 bis 6 Wochen (von Injektion von A. Rhizogenes dauert , ausgereifte ...

Hier präsentieren wir Ihnen zwei Protokolle, Kartoffelpflanzen zu verwandeln. Die Agrobacterium Tumefaciens Transformation führt zu einer kompletten transgenen Pflanze Agrobacterium Rhizogenes transgenen behaarte Wurzeln in einem Wildtyp-Shooting produziert, die selbst propagiert werden kann. Wir erkennen dann Promotoraktivität von GUS Färbung in den transformierten Wurzeln.

Agrobacterium Tumefaciens und Agrobacterium Rhizogenes-vermittelte Umwandlung der Kartoffel und die Promotoraktivität eines Suberin-Gens durch GUS Staining

Agrobacterium sp. is one of the most widely used methods to obtain transgenic plants as it has the ability to transfer and integrate its own T-DNA into ...

Die agrobacterium-vermittelte Transformation ist eine einfache Methode zur Herstellung gentechnisch veränderter Kartoffelpflanzen. Um bestimmte Genfunktionen und ihren Beitrag zur Organphysiologie zu verstehen. Die Transformation durch Agrobacterium rhizogenes ist ein robustes Werkzeug zur schnellen Beurteilung der Genfunktionswurzeln, da ähnliche Ergebnisse durch Agrobacterium tumefaciens Transformation erzielt werden können.Demonstriert wird dieses Verfahren von Sandra Fernandez-Pinan, einer Post-Doc, und Jennifer Lopez, einer Studentin von maste5r aus unserem Labor. Beginnen Sie mit dem Anbau einer einzigen Agrobacterium-Kolonie über Nacht in fünf Milliliter Hefe-Extrakt-Brühe, oder YEB-Medium, ergänzt mit Antibiotika in einem 50 Milliliter Zentrifugenrohr bei 28 Grad Celsius, bei 200 Rotationen pro Minute. Für die A-tumefaciens-Transformation, messen Sie die optische Dichte am nächsten Morgen.Wenn die optische Dichte bei 600 Nanometern oder OD 600 0,6 bis eins erreicht, zentrifugieren Sie einen Milliliter der Agrobacterium-Kultur und setzen Sie das Pellet in einem Milliliter frischem YEB-Medium ohne Antibiotika wieder auf. Nach der zweiten Wäsche das Pellet in frischem YEB-Medium ohne Antibiotika auf die entsprechende Konzentration aussetzen, um eine endgültige OD 600 von 0,8 zu erhalten, und die Bakterienzellen auf Eis legen. Für die Pflanzentransformation mit A.rhizogenes, übertragen Sie sorgfältig eine Spenderpflanze von einer 2MS-Mittelkultur auf eine 120 mal 120 Millimeter quadratische Platte und verwenden Sie eine chirurgische Nadel, um drei Mikroliter aus einer A.rhyzogenes-Kultur in verschiedene Stamminternodien wie möglich zu injizieren.Dann die gesamte Pflanze sofort auf eine neue quadratische Platte mit festem MS-Medium übertragen, ergänzt durch 0,1 Millimolar Acetosyringon. Nachdem Sie eine zweite Pflanze auf dieselbe Platte platziert haben, die auf die gleiche Weise umgewandelt wurde, versiegeln Sie die Platte mit chirurgischem Klebeband und legen Sie die Platte vier Tage lang vertikal in einen Wachstumsschrank. Übertragen Sie die Pflanze auf eine quadratische Platte mit MS-Medium mit Cefotaxim-Natrium ergänzt, um die A.rhizogenes zu töten und legen Sie die versiegelte Platte vertikal in einem Wachstumsschrank für vier Tage.Nach 10 bis 12 Tagen erscheinen neue haarige Wurzeln. Ihre Transformation kann durch fluoreszierendes Stereomikroskop bestätigt werden. Zu diesem Zeitpunkt verbrauchen Sie die einheimischen Wurzeln jeder Pflanze, und übertragen Sie die Pflanzen auf eine neue quadratische Platte mit MS-Medium, ergänzt mit Cefotaxim-Natrium, um die A.rhizogenes zu töten.Um eine Verbundpflanze zu erhalten, lassen Sie die transgenen haarigen Wurzeln für weitere drei bis vier Wochen im MS-Medium wachsen, ergänzt mit Cefotaxim-Natrium. Für die Pflanzentransformation mit A.tumefaciens. Schneiden und legen Sie ein Blatt von einer drei bis vier Wochen alten Pflanze in einer Petrischale, und verwenden Sie ein Skalpell, um ein bis drei Querschnitte von der Mitte des Blattes zu den Rändern zu machen, ohne die Stücke vom Blatt zu schneiden.und die Petiole auszuschließen. Legen Sie das Blatt sofort in eine Petrischale mit 10 Milliliterfrischem 2MS flüssigem Medium, abaxialer Seite nach oben, und bedecken Sie die Platte. 80 Mikroliter der A.tumefaciens-Kultur schnell in das flüssige Medium geben und das Medium eine Minute lang vorsichtig umrühren, um die bakterielle Lösung homogen zu verteilen.Dann die Platte sorgfältig versiegeln und mit Aluminiumfolie bedecken, um eine zweitägige Inkubation in einer 24-Grad-Celsius-Kammer zu erhalten. Am Ende der Transformationsphase die Blätter abaxial-seite nach oben übertragen, auf das kalden-induzierende Medium, mit Einer Pinzette für eine einwöchige Inkubation im Wachstumskabinett abgekratzt. Am Ende der Inkubation die Blätter, abaxial-Seite nach oben, auf eine Tweezerzerzerinduzierendes Medium übertragen und die Blätter in einem Wachstumsschrank bebrüten.Wenn die entstandenen Rutschen etwa zwei Zentimeter hoch sind, schneiden Sie aus jedem Callous drei auftauchende Rutschen. Legen Sie bis zu fünf verschiedene Rutsche Transformation Ereignisse in einzelne Kulturkolben mit MG-Medium mit Cefotaxim-Natrium ergänzt, um Verwurzelung zu ermöglichen, und beschriften Sie die Teilmenge als geeignet für eine drei bis vier Wochen Inkubation im Wachstumsschrank, bis die Rutschen kräftig sind. Wählen Sie am Ende der Inkubation die kräftigste Pflanze jedes Ereignisses aus und schneiden Sie die apikalen Segmente der Rutsche mit drei bis vier Internoden aus jeder Pflanze.Legen Sie die Segmente in einen Kulturkolben mit 2MS Medium, ergänzt mit Cefotaxim-Natrium und wachsen Sie die Pflanzen, bis sie kräftige Rutschen und Wurzeln entwickeln. Um einen Beta-Glucuronidase- oder GUS-Histochemikalien-Reporter-Gentest durchzuführen, fixieren Sie die Wurzeln aus einer zwei- bis dreiwöchigen In-vitro-Pflanzenkultur mit 90% gekühltem Aceton für 20 Minuten auf Eis. Am Ende der Fixierung die Wurzeln zweimal in destilliertem Wasser waschen und die Wurzeln 20 Minuten lang mit frischer GUS-Färbelösung unter Vakuum behandeln.Am Ende der Vakuumbehandlung die Wurzeln bei 37 Grad Celsius für etwa vier Stunden im Dunkeln stellen. Wenn eine blaue Farbe sichtbar ist, waschen Sie die Wurzeln zweimal mit 70% Ethanol und visualisieren Sie die Färbung unter einem hellen Feldmikroskop. Transformierte haarige Wurzeln zeigen einen roten Blütenstand, wenn sie mit grünem Licht beleuchtet werden, während negative Kontrolle untransformierte agrobacterium zeigen keine solche Blütenstand, was die Eignung der DS roten Transformation Marker für die Identifizierung transgene behaarte Wurzeln.Hierbei werden GUS-Färbungen in Wurzeln transgener Pflanzen, die durch A.tumefaciens und transgene behaarte Wurzeln von A.rhizogenes erhalten wurden, gezeigt. Wie beobachtet, zeigen Wurzeln, die mit A, Tumefaciens transformiert und in-vitro angebaut werden, blaue Färbung in der Endodermis, einer Zellschicht zwischen Kortex und Stele. Bei weiter entwickelten Wurzeln ist die blaue Beschriftung in der äußeren Schicht fleckig, entsprechend der Exodermis.Bei transformierten haarigen Wurzeln, die von A.rhizogenes erhalten und in Hydroponik angebaut werden, befindet sich der GUS-Marker speziell innerhalb der Endodermis in der Entstehung von Lateralwurzeln in den verwundeten Bereichen und in der Exodermis. Die mit Agrobacterium rhizogenes erhaltenen transgenen Wurzeln waren nicht nur eine schnelle Methode, sondern trugen auch die DNA aus dem wurzelinduzierenden Plasmid, das einige direkt kontrollierte Prozesse deregulieren kann. Die transgenen haarigen Wurzeln, die mit Agrobacterium-Rhizogenen gewonnen werden, können während des Schießens erhalten werden, können aber alternativ vor Ort sein, bis sie in-vitro für eine massive Transitproduktion vermehrt werden.Die Kartoffelumwandlung ist ein gutes Werkzeug, um die Genfunktion und die Promotoraktivierung zu überprüfen und auch methodische Regeln bei einer Art von hohem agronomischem Interesse zu produzieren. Der genetisch veränderte Organismus sollte nach Gebrauch sicher entsorgt werden, um eine Umweltkontamination zu vermeiden. Außerdem enthält die Gaslösung giftige Zyanidderivate, so dass Sie schutzsicher sind und die Lösung sicher entsorgen.

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