ATAC-Seq-Assay mit niedrigen mitochondriale DNA Kontamination von primären menschlichen CD4 + T-Lymphozyten

Dieses modifizierte ATAC-seq-Protokoll führt einen neuen Lysepuffer ein, der die kontaminierenden mitochondrialen Lesevorgänge von 50% auf weniger als 3% verringert. Die verringerte mitochondriale Kontamination wird es Forschern ermöglichen, effizientere ATAC-Seq mit einer 50%igen Senkung der Sequenzierungskosten durchzuführen. Wir haben dieses neue ATAC-seq-Protokoll in menschlichen primären PBMCs, menschlichen primären Monozyten, dendritischen Mauszellen und Melanomzelllinien validiert. Wir glauben, dass es in einer Vielzahl von Zelltypen wirksam sein wird.

Die Minimierung des Probenverlusts während des Zellaktivierungs- und Auswahlprozesses ist entscheidend für die Erzielung hochwertiger Ergebnisse mit ATAC-seq. Wir zeigen, wie man mit einer kleinen Anzahl von Zellen aus wertvollen Proben mit grundlegenden Laborgeräten umgeht. Zunächst eine Durchstechflasche mit zuvor isolierten CD4+T-Zellen in einem 37-Grad-Celsius-Wasserbad auftauen, bis das Eis gerade geschmolzen ist.

Dann übertragen Sie die Zellen vorsichtig in eine 15-Milliliter konische Röhre mit neun Millilitern vorgewärmter kompletter RPMI. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 1, 500 mal G und vier Grad Celsius, für sechs Minuten. Dann entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet vorsichtig in zwei Millilitern kompletten RPMI aus.

Nach der Wiederholung der Zentrifugation, entsorgen Sie den Überstand, und setzen Sie die Zellen vorsichtig in 0,5 Milliliter n. Chr. Verwenden Sie ein Hämozytometer, um die Zellen zu zählen. Passen Sie mit vollständigem RPMI die Zellsuspensionsdichte auf Platte 50 000 CD4+Zellen in 200 Mikroliter pro Bohrung einer 96-Well-Rundbodenplatte an.

Um dann magnetische Perlen zuzubereiten, aliquot 12,5 Mikroliter Human T-Activator CD3/CD28 Perlen pro ATAC-seq Probe zu einem 1,5 Milliliter Tube. Fügen Sie einen Milliliter 1x PBS in das Rohr, und legen Sie es auf einen Magneten für eine Minute, um die Perlen zu waschen. Entfernen und entsorgen Sie den klaren Überstand vorsichtig, und entfernen Sie das Rohr vom Magneten.

Setzen Sie die Perlen in 13 Mikrolitern vollständiger RPMI pro ATAC-seq Probe aus. Um die CD4+T-Zellen mit der eingestellten Konzentration zu aktivieren, sammeln Sie 500.000 Zellen in 2,1 Milliliter komplettem RPMI-Medium in einem 15-Milliliter-Konusrohr. Fügen Sie 12,5 Mikroliter menschliche T-Activator Perlen, vorbereitet und gewaschen in früheren Schritten, und sanft mischen, indem Sie das Rohr.

Dann übertragen Sie die Zellen vorsichtig, mit Perlen, auf ein steriles Reservoir. Mit einer Mehrkanalpipette, Platte 200 Mikroliter Zellen mit Perlen pro Brunnen einer runden Boden 96-Well-Platte, und inkubieren in einem 37-Grad-Celsius, 5%CO2-Inkubator für 48 Stunden. Zentrifugieren Sie die Platte nach vollständiger Inkubation acht Minuten lang bei 423 mal G und Raumtemperatur.

Entfernen Sie 100 Mikroliter Medium aus jedem Brunnen, und sammeln Sie es in einem konischen Rohr vor dem Entsorgen, um keinen Perlenverlust zu bestätigen. Dann das Zellpellet in den restlichen 100 Mikrolitern Medium wieder aufhängen und alles in einem 1,5-Milliliter-Rohr sammeln. Um CD4+Zellen zu isolieren, fügen Sie 50 Mikroliter vorgewaschener CD4-konjugierter Perlen zu 500. 000 Zellen in einem Milliliter kompletten RPMI hinzu und invertieren, um sie zu mischen.

20 Minuten bei vier Grad Celsius inkubieren, während sie alle sechs Minuten zum Mischen von Hand flicken. Legen Sie das Rohr für zwei Minuten auf den Magneten, bis der Überstand klar ist, und entfernen und entsorgen Sie es. Entfernen Sie das Rohr vom Magneten.

Waschen Sie die perlengebundenen Zellen, indem Sie sie in einem Milliliter PBS plus 2%FCS wieder aufsetzen, und legen Sie das Rohr für eine Minute wieder auf den Magneten. Verwerfen Sie den klaren Überstand, und wiederholen Sie diesen Vorgang für insgesamt drei Wähbe. Nach der letzten Wäsche das Rohr für eine Minute auf den Magneten legen.

Entfernen Sie es, entsorgen Sie den Überstand, und legen Sie das Pellet auf Eis. Als nächstes, um Kernisolierung durchzuführen, die Perlen und Zellen in 50 Mikroliter kalter Lyse Puffer, und Zentrifuge sofort bei 500 G, vier Grad Celsius, für 10 Minuten. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand.

Um die Transposase-Reaktion durchzuführen, setzen Sie das isolierte Kernpellet mit 50 Mikrolitertin Tn5-Transposase-Mix wieder auf. Inkubieren Sie in einem Thermocycler für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius, mit dem Deckel auf 40 Grad Celsius eingestellt, und halten Sie dann bei vier Grad Celsius, wenn sie abgeschlossen sind. Unmittelbar nach dem Thermocycling eine schnelle Sitzzentrifuge Spin-down durchführen.

Legen Sie das Rohr für eine Minute auf den Magneten, um die Perlen aus dem Produkt zu entfernen. Ohne das Rohr vom Magneten zu entfernen, übertragen Sie den klaren Überstand in eine DNA-Reinigungskolonne. Waschen Sie die Säule einmal mit 250 Mikroliter PB-Puffer und zweimal mit 750 Mikroliter PE-Puffer.

Fügen Sie dann 10 Mikroliter Elutionspuffer hinzu, um die Probe zu löschen. Richten Sie die anfängliche PCR-Verstärkungsreaktion in einem nukleasefreien PCR-Rohr ein. Legen Sie das PCR-Rohr in den Thermocycler und führen Sie das PCR-Verstärkungsprogramm aus.

Dann vervollständigen Sie die endgültige PCR-Verstärkung der verbleibenden 45 Mikroliter PCR-Reaktion, wie im Manuskript beschrieben. Legen Sie das PCR-Rohr in den Thermocycler und führen Sie das Programm aus. Nach vollständiger Verstärkung, reinigen Sie die Bibliotheken mit einem PCR-Bereinigungskit, nach dem Herstellerprotokoll, Eluing in 25 Mikroliter des Elutionspuffers.

Sequenzieren Sie die vorbereiteten Bibliotheken auf einem Sequenzer der nächsten Generation auf eine durchschnittliche Lesetiefe von 42 Millionen Lesevorgängen pro Beispiel. Dieses verbesserte ATAC-seq-Protokoll erzeugte eine endgültige Bibliothek von mehr als einem Nanogramm pro Mikroliter für die Sequenzierung. Die Qualitätskontrolle zeigte DNA-Fragmente zwischen 200 und 1.000 Basenpaaren, und mit diesen hochwertigen Bibliotheken wurde eine weitere Sequenzierung durchgeführt.

Bibliotheken, die nach diesem Protokoll erstellt wurden, zeigten nur 3%mitochondriale Kontamination. Der hohe Prozentsatz der verwendbaren Lesevorgänge ist in allen biologischen Replikaten ausreichend konstant. Dieses Protokoll lieferte hochreproduzierbare Ergebnisse über technische Replikationen hinweg sowie biologische Replikationen.

Darüber hinaus dauerte dieses Protokoll 48 Stunden statt einer Woche oder mehr wie zuvor beschrieben, was zu einer konsistenten und effizienten Aktivierung führte, wie reproduzierbare Sequenzierungsergebnisse zeigen. Darüber hinaus wurden vorhergesagte ATAC-seq-Peaks von der Analysepipeline genau aufgerufen. Die Sequenzierungsergebnisanalyse ergab deutliche Veränderungen des Chromatinzustands während der Aktivierung menschlicher T-Zellen.

Zwischen sechs Proben vor und 48 Stunden nach der Aktivierung wurden unterschiedlich zugängliche Bereiche von offenem Chromatin identifiziert. Stellen Sie sicher, dass die Kernlysereaktion mit gekühlten Reagenzien und Materialien durchgeführt wird, um die Rückgewinnung intakter Kerne zu maximieren. Unser modifizierter Kernlysepuffer ist sanfter für die Zellen und minimiert die Kontaminierung der mitochondrialen DNA.

Wir freuen uns darauf, dass dieser modifizierte Lysepuffer auch auf ATAC-seq mit einem Kern angewendet wird. Wir wissen, dass dieses Protokoll es Forschern ermöglichen wird, qualitativ hochwertigere ATAC-seq-Daten zu geringeren Kosten zu erstellen und so das epigenetische Feld voranzubringen. Das Protokoll ist einfach, schnell und erfordert keine gefährlichen Reagenzien oder Instrumente, so dass es leicht zugänglich für diejenigen, die neu atAC-seq.