Name: Langfristige sensorischen Konflikt in Mäusen frei Verhalten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie einen dauerhaften sensorischen Konflikt bei frei beweglichen Mäusen erzeugen, um Langzeitlernen zu untersuchen. Diese Methode kombiniert in vivo- und in vitro-Experimente zur Analyse vestibulärer Reflexe.

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Wir danken Patrice Jegouzo für den Kopf-Geräte, Headpost Entwicklung und Produktion. Wir danken auch P. Calvo, A. Mialot und E. Idoux für ihre Hilfe bei der Entwicklung von früheren Versionen des Gerätes und VVM Protokoll.
Diese Arbeit wurde durch das Centre National des Etudes Spatiales, CNRS und der Université Paris Descartes finanziert. J. C. und M. B. erhalten Unterstützung von der französischen ANR-13-CESA-0005-02. F. F. B. und M. B. erhalten Unterstützung von der französischen ANR-15-CE32-0007.

Alle Verfahren tierischen der Universität Paris Descartes Tieren Vorschriften.
(1) Gerätemontage
Hinweis: Das Gerät in diesem Protokoll ist ein Helm-artige Struktur mittels eines implantierten Headpost auf Mäusen Schädel fixiert.
<ol><li>Mit einem 3D Drucker und weiße undurchsichtige Poly (Milchsäure) (PLA) Kunststoff, print Design und Spezifikation der Dateien zur Verfügung gestellt hier verwenden (siehe Tabelle der Materialien) für das Gerät und Headpost. Hinweis: Die Abmessungen des Geräts sind in Abbildung 1 und Abmessungen des Headpost, die in Abbildung 2dargestellte dargestellt.</li>
	<li>Ein gestreiftes sowie Schein Gerät getestet (Abbildung 2A11) sein sollen. Um das gestreifte Modell mit schwarzen Nagellack zu erhalten zeichnen Sie 3 mm große vertikale Streifen auf der äußeren Oberfläche des Gerätes. Die Schein-Bedingung erfordert keine Änderungen an der gedruckten Gerät.</li>
</ol>2. Headpost Implantation Operation
Alle in diesem Protokoll verwendeten Materialien sind in der Liste der Materialien in den Zusatzinformationen aufgeführt. Schritte 2,7-2,9 Verwendung der Biomaterialien in der Implantation vorgesehen kit (siehe Tabelle der Materialien). Sorgen für die Verwendung von sterilen Instrumenten und Operation und Genesung in den verschiedenen Zonen zu arrangieren. Sobald Sie beherrscht, dauert der Implantation ca. 30 min.
<ol><li>Für Analgesie, 30 min vor Beginn der Operation subkutan injizieren Sie Buprenorphin (0,05 mg/kg) und setzen Sie das Tier in seinem Hause Käfig wieder. Hinweis: Buprenorphin analgetische Effekte dauern ca. 12 h, lange nach dem Ende des Verfahrens. Nach unserer Erfahrung Mäuse zeigen keine Anzeichen von Stress im Zusammenhang mit dieser Intervention, sondern eine weitere Dosis von 0,05 mg/kg Buprenorphin ist 24 h nach der Operation empfohlen.</li>
	<li>Betäuben Sie das Tier in einer Kammer mit 2,5-3 % Isofluran Gas. Warten Sie 3 min und überprüfen Sie, ob die Maus richtig betäubt ist, durch die Beobachtung der Atmung und Mangel an Bewegung in der Kammer. Eine OP-Tisch mit einem Heizkissen Maus zu einem Prüfkopf weitergeben und durch interdigital kneifen, stellen Sie sicher, dass es keinen Rückzug Reflex und Isofluran auf 1,5 % zu senken.</li>
	<li>Rasieren Sie den Kopf der Maus über einen elektrischen Rasierapparat. Um eine sterile Umgebung zu erhalten, den rasierten Bereich mit Jod-Lösung und nach dem Reiben mit 70 % Alkohol. Wiederholen Sie diesen Vorgang noch zweimal.</li>
	<li>Injizieren Sie Lidocain Hydrochlorid (2 %, 2 mg/kg) unter die Haut des Kopfes für örtliche Betäubung zu und warten Sie 5 min für die Effekte zu beginnen. Zur Vermeidung von Schädigungen des Auges durch Trockenheit decken Sie die Maus Augen mit aktuellen ophthalmologischen Tierarzt Salbe.</li>
	<li>Mit einer stumpfen Pinzette greifen die Haut am Hinterkopf und mit einer stumpfen Schere (oder Skalpell), machen einen längs-Schnitt von ca. 1,5 cm des Schädels aussetzen.</li>
	<li>Mit Hilfe eines Skalpells Kratzen der Knochenhaut. Achten Sie darauf, nicht zu hart, zu kratzen, da die Fixierung der Headpost kompromittiert werden kann, wenn der Schädel, leicht zu bluten beginnt.</li>
	<li>Geben Sie einen Tropfen der grünen Aktivator in der Mitte des Schädels. Dadurch wird die Fixierung des Zements durch wachsende Knochen Durchlässigkeit verbessert.</li>
	<li>Bereiten Sie den Zement: Mischen Sie einen Löffel (mitgelieferte Implantation) des Polymers mit fünf Tropfen Monomer und einen Tropfen der Katalysator. Tragen Sie mit Hilfe eines Pinsels eine großzügige Menge an die Zementmischung zwischen Lambda und Bregma Schädel Wahrzeichen;</li>
	<li>Legen Sie schnell die Headpost auf den Zement mit einer swiping Bewegung von Lambda gonna Bregma. Nachdem die Headpost platziert wurde, erneut mehr Zement um den unteren Teil, um sicherzustellen, dass die Headpost richtig an den Schädel hält. Um die ordnungsgemäße Fixierung zu gewährleisten, stellen Sie sicher der Zement reichlich angewendet wird und dass es trocknet, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren. Hinweis: Mit diesem Verfahren Fixierung der Headpost nicht abgehen und ermöglichen langfristige und wiederholte Tests; in unseren Händen, Headpost Entfernung ist < 10 %.</li>
	<li>Bereiten Sie die Harz-Mischung durch die Anwendung der Pulver-Flüssigkeits-Verhältnis, die eine glatte Konsistenz der Mischung ermöglicht. Wenden Sie das Harz, wo der Zement appliziert wurde, als auch um die Headpost um die Oberfläche zu schützen.</li>
	<li>Warten Sie 3 min für das Harz trocken und die Haut auf der Rückseite der Ohren mit monofilen Nahtmaterials schließen. Wenden Sie mit einem Wattestäbchen verdünnt (10-20 % an) Jod-Lösung auf das Operationsgebiet. Hinweis: Stellen Sie sicher, dass die Haut nicht in das Harz stecken.</li>
	<li>Schalten Sie die Narkose und setzen Sie das Tier unter einem roten warmes Licht um Unterkühlung zu vermeiden. Ort befeuchtet, Essen und Hydrogel oder eine andere Wasserquelle mit Sitz in Gel in den Käfig Etage. Nicht unbeaufsichtigt lassen die Maus bis er das Bewusstsein wiedererlangt. Sobald das Tier erholt sich vollständig von dem Verfahren (in der Regel 30 min bis 1 h nach), legen Sie sie in einem Käfig mit Gruppen von drei oder vier, soziale Interaktionen zu stimulieren.</li>
</ol>3. Gerät Fixierung
<ol><li>48 h nach der Operation sichern maßgeschneiderte Kopf Gerät auf die Headpost.<ol>
<li>Mit einem Paar von 1,2 mm Schrauben und Schraubendreher (1,3 mm Hex), richten Sie die Löcher im gestreiften Gerät mit den Löchern in der Headpost, setzen Sie die Schrauben und befestigen Sie diese. Um die Schein-Bedingung zu beheben, schalten Sie das Gerät auf den Kopf gestellt und mit dem hinteren Teil (Abb. 1A) des Geräts die rostral in Fahrtrichtung, richten Sie die Löcher in das Gerät mit den Löchern in der Headpost. Hinweis: Es wird empfohlen, dass dieser Schritt von zwei Betreibern, ein Betrieb der Maus eine einhändige Maus Fixierung, während die andere Sicherung das Gerät die Headpost durchgeführt werden. Erfolgt die Fixierung von einem einzigen Betreiber, kann das Gerät aufgestellt werden, während die Maus Gas Narkose ist.</li>
		<li>Überprüfen Sie, dass das Gerät gut gesichert ist und nicht durch das Tier entfernt werden und dass das Gerät nicht Druck direkt auf die Maus Nase, gilt die potenziell verursachen Schmerzen, Schwierigkeiten zu atmen, oder Verletzungen der Haut. Hinweis: Es ist auch wichtig, um sicherzustellen, dass das Gerät auf die Maus Gesicht symmetrisch eingefügt wird, so dass die Augen vom Kopf Gerät vollständig bedeckt sind. Überprüfen Sie, dass das Tier keine von abnormen Schmerzen oder Ängste Anzeichen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lassen Sie das Gerät auf die Maus, für 14 Tage.</li>
</ol>4. Pflege und Überwachung
<ol><li>Sobald wieder in ihren Käfigen Mäusen bestimmte Auffälligkeiten im Verhalten ausstellen werden. Auf den ersten das Tier kann bleiben ausgestreckt und versuchen, das Gerät mit seinen Vorderpfoten zu entfernen, aber dies sollte nach der ersten Stunde zu stoppen. Den nächsten folgenden Zeiten zeigt das Tier in der Regel Schwierigkeiten orientieren sich in den Käfig und für Futter und Wasser zu erreichen. Daher während der 48 h nach der Implantation, überwachen Sie die Mäuse zu und einen Sie einfachen Zugang zu Wasser und Nahrung, indem man beide direkt auf den Boden, zum Beispiel.</li>
	<li>Behalten Sie den Überblick der Mäuse Gewichte während der Dauer des Protokolls. Wiegen die Mäuse direkt nach der Implantation und wieder alle 24 h. besondere Aufmerksamkeit geschenkt werden Tiere tragen das gestreifte Gerät erleben sie normalerweise Körper Gewichtsverlust (1-2 g) während der ersten 48 Std., aber starten Gewichtszunahme wieder in normalem Tempo folgende Diese erste Periode (siehe Abbildung 2B11).</li>
	<li>Nach 2 Tagen sollen Mäuse zu ihren regelmäßigen Fakultäten zurückzukehren. Je nach System in Tierhaltungen verwendet möglicherweise das Gerät Zugang zu Nahrungsmitteln und Trinkwasser verhindert. Sicherzustellen Sie, dass das Tier sich wohl beim Essen und trinken oder passen Sie die Dosieranlage entsprechend an. Hinweis: Das Spektrum der Kopfbewegungen, die durch die Tiere nach wenigen Tagen mit dem Gerät auf produziert wird nicht vom Gerät geändert (siehe Abbildung 2-11) (dh., Bereich von Kopfbewegungen produziert bleibt ähnlich wie natürliche Kopfbewegungen).</li>
	<li>Um die Mäuse Wohlbefinden sicherzustellen, tägliche Überwachung zu gewährleisten und die qualitativen Skala (Tabelle 1) Wohlbefinden während der gesamten Dauer des Protokolls gelten.</li>
	<li>Entfernen Sie eine Maus aus dem laufenden Protokoll, wenn eine oder mehrere der folgenden Kriterien zutreffen:<ol>
<li>Mäuse, die insgesamt haben Gäste höher als 4 Punkte auf der oben genannten qualitativen Skala sofort aus dem Experiment ausgeschlossen werden müssen (siehe Tabelle 1). Unabhängig von der Partitur wenn die Maus nicht seinen ursprünglichen Gewichts nach 6 Tagen wieder muss das Verfahren beendet werden.</li>
		<li>Das Gerät ist nicht richtig an der Headpost befestigt, wenn zum Beispiel die Headpost schüttelt bei Berührung oder ein Teil beginnt, kommen aus. Dies bewirkt, dass die Headpost kommen aus der Maus Kopf und folglich unterbricht das lernen, das was erklärt, warum die tägliche Absatzeinbußen notwendig sind.</li>
		<li>Wenn eine Maus hat seine Headpost während eines Teils des Protokolls abgerissen. Durch den Schädel Blutungen, diese Abteilung zugeordnet, die Reimplantation Chirurgie hat eine geringe Erfolgsquote und der Versuch lohnt sich nicht.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Entfernen des Geräts
<ol><li>Entfernen Sie nach der Lernphase (in diesem Protokoll 14 Tage) das Gerät nach den gleichen Anweisungen wie bei der Fixierung (Abschnitt 3). Sobald das Gerät entfernt wird, testen Sie die Mäuse mit Experimenten wie Video-Oculography-Tests oder zum Beispiel mit in-vitro- Elektrophysiologie wie oben beschrieben11. Hinweis: Sobald das Gerät abgenommen ist, sind Mäuse zurück standard, visuell unverbauten Umwelt ausgesetzt. Daher führen Sie Experimente, die darauf abzielen, die Lerneffekte dieses Gerätes direkt nach der Entnahme zu testen.</li>
</ol>(6) Video-Oculography-Sitzungen
Hinweis: Video-Oculography-Experimente durchgeführt, um die generierten Augenbewegungen aufnehmen, während das Tier in der Dunkelheit (Vestibulo-Okular Reflex, VOR) gedreht wird wird oder durch Drehen des Tieres Umgebung, während das Tier ist noch (optokinetischen Reflex, OKR). Jede Maus wurde für beide diese Reflexe vor und nach der Anpassungsprotokolls getestet. Für weitere Informationen über das Video-Oculography-Set-up siehe zuvor veröffentlichten Berichten12,13. Um die Mäuse, die zurückhaltende Aufnahme gewöhnen stellen Bedingungen, am Tag vor Beginn der Aufnahme, das Tier auf dem Rohr in der Mitte des Drehtellers für 10 Minuten ohne irgendwelche Test durchzuführen.
<ol><li>Sichern Sie die Maus auf der Drehscheibe durch Kopf-Befestigung mit Hilfe von Schrauben in die Headpost eingefügt. Legen Sie eine Bildschirm-Kuppel rund um das Tier und schalten Sie das Licht in den Raum mit Ausnahme des optokinetischen-Projektors. Hinweis: Video-Oculography-Aufnahmen benötigen das Tier immer noch und mit seinen Augen geöffnet sein. Unterbrechen Sie die Aufnahme-Session und setzen Sie das Tier wieder auf seinem Käfig für den Fall, dass die Maus nicht freiwillig seine Augen offen hält, oder wenn das Aussehen des Auges verschlechtert sich während der Aufnahme-Session. Nach einer Ruhezeit von mindestens 12h kann ein weiterer Versuch unternommen werden.</li>
	<li>Starten Sie den OKR Vollfeld Stimulation (weißer Punkt Muster Projektion) und Datensatz mit mehreren unterschiedlichen Geschwindigkeiten im Uhrzeigersinn und gegen den Uhrzeigersinn Richtungen. Sobald die Aufnahmen über sind, entfernen Sie die Kuppel.</li>
	<li>Um die VOR im stockdunkel aufnehmen zu können, geben Sie einen Tropfen von 2 % Pilocarpin Augen14. Warten Sie mindestens 5 min dafür zu handeln und entfernen es vorsichtig mit einem Wattestäbchen. Die Pilocarpin wird die Pupille verengt mit einer konstanten Größe während der Messungen ermöglicht korrekte Quantifizierung der Bewegungen im Dunkeln halten.</li>
	<li>Schalten Sie das Licht in den Raum, und fügen Sie ein Feld auf der Drehscheibe, das Tier in der Tonhöhe dunkel zu halten. Starten Sie die horizontale VOR mit sinusförmigen eckige Rotationen um eine vertikale Achse mit unterschiedlichen Frequenzen und/oder verschiedenen Geschwindigkeiten.</li>
	<li>Nach Abschluss die Aufnahme-Session zurück die Maus in einen Käfig mit einer Infrarotlampe richtig beleuchtet. Die Wärme verhindert Unterkühlung verursacht durch die sekundäre gefäßerweiternde Wirkungen von Pilocarpin auf den Körper der Maus. Hinweis: Aufgrund des Tieres eingeschränkt wird, kann nicht Aufnahme-Sessions mehr als 90 Minuten dauern. Wenn zusätzliche Tests erforderlich sind, lassen Sie das Tier 24h zwischen den Sitzungen.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Die langfristige sensorischen Störung hier beschriebenen besteht Visuo-vestibulärer Mismatch in Mäusen frei Verhalten produziert. Um das Gerät implantieren, das Mäuse für 14 Tage zu tragen, ist eine einfache und kurze mit einem handelsüblichen chirurgische Kit operiert. Mäuse erholen Sie sich in weniger als 1 Stunde von diesem Headpost Implantationsverfahren und zeigen keine damit verbundenen Zeichen der Bedrängnisses daraus. Anschließend werden im angegebenen Beispiel der Anwendung dieses Protokolls VOR und OKR gemessen mit der Video-Oculography-Technik. Dennoch konnte dieses Gerät-induzierte langfristige lernen Protokoll in einer Vielzahl von Experimenten wie in-vitro- Elektrophysiologie1, neuronale Bildgebung und verschiedene Verhaltensstörungen Assays verwendet werden. Die Beweggründe für die Entwicklung dieser Technik war inspiriert von Prism basierende Methodik bei Menschen und Affen. Diese Technik unterscheidet sich jedoch, weil es beeinträchtigt, anstatt Vision ändert. (In seiner jetzigen Form) stellt es somit, einen extremen Fall von Visuo-vestibulärer Mismatch. Die Autoren sind der Meinung, dass die zur Verfügung gestellten technische Informationen für eine prismenähnliche Version des Geräts oder Weiterentwicklung der spezifischen Funktion beschränken Geräte16nützlich sein kann.
Gemacht von einem Licht (0,9 g) Poly (Milchsäure) Kunststoff, der Kopf Gerät wurde entwickelt, um den Kopf einer jungen Erwachsenen Maus, so dass Schutz des Mauls und lässt genügend Raum seitlich um den tierischen Bräutigam lassen passen. Der vordere Teil des Gerätes stellt das Ende der Schnauze, Fütterung und Pflege Verhaltensweisen zu ermöglichen. Das Gerät ist etwas undurchsichtig, so dass das Tier noch Leuchtdichte Stimulation erhält aber präzise Vorstellung von der Umgebung beraubt wird. Die gestreiften und Sham Implantationen sind getestet, um sicherzustellen, dass die gemessenen Wirkungen vor allem auf das Visuo-vestibulärer Mismatch verursacht durch die kontrastreiche optisches Signal bei selbst erzeugten Bewegungen des gestreiften Gerätes und nicht durch propriozeptive Änderung (d. h., das Gewicht des Gerätes in der Mouse´s Kopf und Hals angewendet).
Mäuse, die das gestreifte Gerät zeigte eine signifikante VOR trug gewinnen experimentell, Abnahme von 50 % nach der Lehrzeit; Dennoch kann eine interindividuelle Variabilität für absolute Gewinn Werte sein. Sham Mäuse zeigten keine signifikanten VOR gewinnen Veränderungen, so demonstriert, dass die VOR-Reduzierung durch den sensorischen Konflikt und nicht von motorischen Beeinträchtigungen verursacht wird. Darüber hinaus jungen Mäusen (< P26) zeigte VOR und OKR gewinnen Werte niedriger als ältere Tiere17. Aus diesem Grund hat tierischen Alter berücksichtigt werden, während der Planung des Experiments. Schließlich sind die oben genannten Mäuse Ausschlusskriterien (Abschnitt 4.5) ein entscheidender Schritt, der befolgt werden sollten, um Wohlbefinden zu gewährleisten sowie die zuverlässige Ergebnisse zu etablieren.
Einer der Vorteile dieses Protokolls ist die Zeit, die es während der Lernphase Experimentatoren im Vergleich zu anderen Arten von VOR/OKR Anpassung Protokolle spart. Bisher wurde VOR Anpassung bei Mäusen untersucht, Kopf-Befestigung und das Tier auf einer rotierenden Drehscheibe6,8,18,19, die zeitaufwendig, ist vor allem, wenn viele Tiere müssen ausgebildet. Die vorgestellte Protokoll ermöglicht die Ausbildung von mehreren Tieren gleichzeitig und spart Zeit. Darüber hinaus sind in diesen klassischen Experimenten die Trainings in der Regel beschränkt auf 1 h pro Tag, längere Zeit der vermeintlichen verlernen, die Anpassung zu einem iterierten Wechsel von lernen/verlernen mit unterschiedlicher Dynamik20verursachen verlassen. Hier kann die Kopf-Fixierung des Gerätes für ununterbrochene lernen. Ein weiterer Vorteil ist, dass da die Lernphase in einer frei Verhalten Kopf frei Situation erzeugt wird, Mäuse sind in der Lage, durch eine Reihe von natürlichen Kopfbewegungen zu lernen, die aktiv generiert werden. In den klassischen Protokollen ist das Tier Kopf fixiert während passiv auf der Drehscheibe gedreht werden, so dass das Lernen bei einem entschlossenen Stimulation (eine Frequenz, eine Geschwindigkeit)21 auftritt, die nicht zum natürlichen Verbreitungsgebiet der Kopfbewegungen widerspiegelt. Es ist wichtig um zu beachten, dass das vestibuläre System Bewegungen anders kodiert angewendet wenn sie aktiv durch den Gegenstand oder extern erzeugt werden,10; Daher können die zellulären Mechanismen ausgelöst, in beiden Fällen auch abweichen.
Insgesamt eignet sich die beschriebene Methodik für kombinierte/in-vivo/in-vitro- Studien über langfristige sensorische Anpassungen nach einer visuellen Konflikts und/oder Visuo-vestibulärer Mismatch in Mäusen frei Verhalten auftritt. Sensorischen Konflikte sind eine anerkannte Ursache der Reisekrankheit, die ein Feld, das vor kurzem Einsatz von Mäusen22,23angezogen hat. Es wurde kürzlich gezeigt, dass die Gain-Anpassung verursacht durch den Einsatz dieses Gerätes bietet Schutz gegen Reisekrankheit bei Mäusen eine provokative Anregung15ausgesetzt sind. Daher kann dieses Protokoll verwendet werden, zu identifizieren, die zellulären Mechanismen, die Anpassung zu einem sensorischen Konflikt sowie Anti-Reisekrankheit Behandlungen zu entwickeln.

Sensorischen Konflikte, wie visuelle, befinden sich im täglichen Leben, zum Beispiel, wenn eine Brille trägt, oder während einer gesamten Lebensdauer (developmental Wachstum, Veränderungen in der sensorischen Schärfe, etc..). Durch eine gut beschriebene Schaltung präzise Quantifizierung Methoden1, Anatomie, leichtführig Sinneseindrücke und quantifizierbare Motorausgängen Blick habe Stabilisierung Reflexe als Modelle des motorischen Lernens in vielen Arten. In Menschen und Affen ist die Vestibulo-Okular Reflexe (VOR) Anpassung durch den Einsatz von Prismen studiert, die das Thema für mehrere Tage2,3,4,5trägt. Da das Nagetiere-Modell die Kombination von Verhaltens- und zellulären Experimenten erlaubt, entwickelten wir eine neue Methode zur langfristigen sensorischen Konflikt in frei verhält sich Mäuse mit einem Helm-ähnlichen Gerät erstellen. Inspiriert durch die Methodik bei Menschen und Affen, generiert das Protokoll ein Missverhältnis zwischen der vestibulären und visuellen Eingänge (z.B. Visuo-vestibulärer Mismatch, VVM), die zu einem Rückgang VOR Gewinn führt.
Klassische Protokolle Auslösen einer VOR Gewinn-Down Anpassung bei Nagetieren besteht aus drehen das Kopf fixiert Tier auf einer Drehscheibe beim Drehen des Gesichtsfeldes in Phase. Dieses Paradigma entsteht ein Visuo-vestibulären Konflikt, wodurch die VOR kontraproduktiv. Langfristige Anpassung Protokolle bestehen aus einer Iteration dieses Verfahrens im Laufe von mehreren aufeinander folgenden Tagen6,7,8. Infolgedessen wenn eine große Gruppe von Tieren werden getestet muss, erfordert klassische Methodik eine große Menge an Zeit. Darüber hinaus da das Tier Kopf fixiert ist, das Lernen beschränkt sich meist auf eine diskrete Frequenz/Geschwindigkeit und bestehen aus diskontinuierlichen Schulungen durch intertrial Abständen von unterschiedlicher Dauer6unterbrochen. Zu guter Letzt verwenden klassische Protokolle passives lernen, wie die vestibuläre Stimulation nicht aktiv durch freiwillige Bewegungen des Tieres, eine Situation entsteht, die vestibuläre Verarbeitung9,10stark prägt.
Die oben genannten experimentellen Einschränkungen werden durch die präsentierten innovative Methodik übertroffen. Das erforderliche chirurgische Vorgehen ist unkompliziert, und die verwendeten Materialien sind im Handel leicht erhältlich. Das einzige Teil, das stützt sich auf mehr teures Material ist die Quantifizierung des Verhaltens; Dennoch können die Grundlagen des Protokolls für jedes Experiment von in-vitro- Untersuchungen zu anderen Verhaltensstudien des Lernens verwendet werden. Insgesamt kann generieren eine vorübergehende Sehstörungen und Visuo-vestibulären Konflikt über mehrere Tage, diese Methode leicht zu jeder Studie mit sensorischen Störung oder motorischen Lernens umgesetzt werden.

<table><tbody><tr><td>3D-Drucker</td><td>Ulimaker, USA</td><td>S5</td><td></td></tr><tr><td>Stumpfe Schere</td><td>FST</td><td>14079-10</td><td></td></tr><tr><td>Catalyst V</td><td>Sun Medical, Japan</td><td>LX22</td><td>Parkell Biomaterialien, Kit n&deg; S380</td></tr><tr><td>Dentalon Plus</td><td>Heraeus</td><td>37041</td><td></td></tr><tr><td>Eyetracking-System und Software</td><td>Iscan</td><td>ETN200</td><td></td></tr><tr><td>Grüner Aktivator</td><td>Sun Medical, Japan</td><td>VE-1</td><td>Parkell Biomaterialien, Kit n&deg; S380</td></tr><tr><td>Monomer</td><td>Sun Medical, Japan</td><td>MF-1</td><td>Parkell Biomaterialien, Kit n&deg; S380</td></tr><tr><td>Ocrygel</td><td>TvmLab</td><td>10779</td><td>Ophtalmische Tierarztsalbe</td></tr><tr><td>Polymer L-Typ klar (Zement)</td><td>Sun Medical, Japan</td><td>TT12F</td><td>Parkell Biomaterialien, Kit n&deg; S380</td></tr><tr><td>Sketchup</td><td>Trimble</td><td></td><td>3D-Modellierungssoftware, die für die druckfertige Designdatei des Geräts verwendet</td></tr> wird <tr><td>Drehteller</td><td></td><td></td><td>Nicht im Handel erhältlich</td></tr></tbody></table>

langfristige sensorischen konflikt in mäusen frei verhalten

Long-term Sensory Conflict in Freely Behaving Mice

Langfristige sensorischen Konflikt Protokolle sind ein wertvolles Mittel des motorischen Lernens zu studieren. Die vorgestellte Protokoll erzeugt einen anhaltenden sensorischen Konflikt für Experimente zur langfristigen lernen bei Mäusen zu studieren. Durch das permanent tragen ein Gerät auf den Kopf fixiert, sind Mäuse ständig eine sensorische Missverhältnis zwischen visuellen und vestibulären Eingaben während der Fahrt frei im Hause Käfige ausgesetzt. Dieses Protokoll ermöglicht somit, ohne weiteres die Studie des visuellen Systems und multisensorische Interaktionen über einen längeren Zeitraum, die sonst nicht zugänglich wären. Dieser Ansatz beherbergt neben der experimentellen Kostensenkung langfristige sensorische lernen in Mäusen natürlich Verhalten, die Kombination von in Vivo und in Vitro Experimente. Im gemeldeten Beispiel wird Video-Oculography durchgeführt, um die Vestibulo-Okular Reflex (VOR) und optokinetischen Reflex (OKR) vor und nach dem Lernen zu quantifizieren. Mäuse für diesen langfristigen sensorischen Konflikt zwischen visuellen und vestibulären Eingänge präsentiert eine starke VOR Gewinn Abnahme ausgesetzt aber einige OKR Änderungen ausgestellt. Detaillierte Schritte der Gerätemontage, Tierpflege, und Reflexe Messungen werden hiermit gemeldet.

Die folgenden Abbildungen zeigen die Ergebnisse, die mit Mäusen, die die 2 Woche Anpassungsprotokolls tragen entweder unterzog sich eine gestreifte oder Schein-Gerät. Abbildung 3 zeigt ein Beispiel der rohen Spuren gesehen während der Aufnahme-Sessions. Wie gezeigt durch den Vergleich der Spuren, die VOR Antwort sinkt nach der VVM-Protokoll (Abbildung 3A, vor vs. nach gestreift). Die VOR der Schein Mäuse unverändert nach der Anpassung (Abb. 3A, vor vs. nach Schein). Die OKR Mäuse tragen die gestreifte Gerät (Abb. 3B) ist vergleichbar mit der Zeit vor dem VVM-Protokoll und Mäuse sham. Abbildung 4 zeigt ein Beispiel der Quantifizierung der mittleren VOR Gewinne mit einer festen Frequenz von 0,5 Hz und bei 40 Grad pro Sekunde, vor und nach dem VVM-Protokoll für Streifen- und Schein-Geräte. Gibt es eine starke Verstärkung Abnahme nach Mäusen das gestreifte Gerät trug, während die Schein-Mäuse keine wesentlichen Änderungen hätten. Auswirkungen der VOR Abnahme bei verschiedenen Geschwindigkeiten/Frequenzen getestet wurden von Carcaud Et Al.11 und Idoux Et Al.15gemeldet.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59135/59135fig1.jpg"> Abbildung 1 : Kopf Gerät mit Abmessungen in Millimeter dargestellt. Aufrufe: (A)-Rückseite, (B)-Seite unten (C) und (D) Antenne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59135/59135fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59135/59135fig2.jpg"> Abbildung 2 : Headpost mit Abmessungen in Millimeter dargestellt. Fest in der Implantation Chirurgie, dieses Licht (0,2 g) Poly (Milchsäure) Kunststoff Headpost ermöglicht das Sperren von der Adaptionseinrichtung, Maus und Kopf-Fixierung des Tieres auf dem Plattenteller während der Video-Oculography-Sessions. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59135/59135fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59135/59135fig3v2.jpg"> Abbildung 3 : Beispiel rohen Spuren von Augenbewegungen während VOR und OKR Stimulationen. (, Links) Links: VOR bei 0,5 Hz auf 40 ° / s und durchgeführt (B, rechts) optokinetischen Stimulation mit einer konstanten Geschwindigkeit von 10 ° / s (schwarze Linie), im Uhrzeigersinn, bevor (grüne Linien) und nach (gelb) tragen die gestreifte oder Schein (lila) Gerät. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59135/59135fig3v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59135/59135fig4v2.jpg"> Abbildung 4 : Beispiel bedeuten VOR und OKR Gewinn Werte nach Anpassung an die gestreiften oder Schein Gerät. Gewinne wurden geplottet Zeit (Tage) für die gestreiften (n = 10) und Sham (n = 6) Geräte auf Stimulationen von 40 ° / s und 0,5 Hz vor (links) und 10 ° / s Uhrzeigersinn für die OKR (rechts). Auf der Zeitskala, "vor dem" Tag der Tag unmittelbar vor der Anpassung darstellt und "Tag 0" steht für den Tag, wenn das Gerät entfernt. Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung *** p &lt; 0,001, nicht signifikant. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59135/59135fig4v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Punkte</td>
			<td>Körper-Gewicht-Änderungen</td>
			<td>Physische Erscheinung</td>
			<td>Verhalten</td>
		</tr>
<tr>
<td>0</td>
			<td>keiner oder Gewichtszunahme</td>
			<td>Standard</td>
			<td>keine Anzeichen von Stress und normale Fortbewegung</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>Gewicht-Verlust-&lt; 10 %</td>
			<td>kein Körperpflege</td>
			<td>beeinträchtigt Fortbewegung oder Käfig Orientierung</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>Gewichtsverlust zwischen 10-20 %</td>
			<td>Dehydrierung</td>
			<td>--</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>Gewicht-Verlust-&gt; 20 %</td>
			<td>Wunden</td>
			<td>nervöse Ticks (z. B. kratzen, beißen)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: qualitativer Maßstab für die Beurteilung des Wohlbefindens. Aufgeführt sind die qualitativen Parameter, die während der Dauer des Protokolls zu beurteilen. Die Summe Gewicht Veränderungen, körperliche Erscheinung und Verhalten Partituren sollten nicht größer als vier Punkte sein.
Ergänzende Datei 1. Device.STL. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59135/Device.stl" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>
Ergänzende Datei 2. Headpost.STL. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59135/Headpost.stl" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>

Die vorgestellte Protokoll erzeugt einen anhaltenden sensorischen Konflikt für Experimente zur langfristigen lernen zu studieren. Durch das dauerhaft eine feste Vorrichtung tragen auf dem Kopf, sind Mäuse ständig eine sensorische Missverhältnis zwischen visuellen und vestibulären Eingaben während der Fahrt frei im Hause Käfige ausgesetzt.

Langfristige sensorischen Konflikt in Mäusen frei Verhalten

Long-term sensory conflict protocols are a valuable means of studying motor learning. The presented protocol produces a persistent sensory conflict for ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, einen anhaltenden sensorischen Konflikt für das Studium des langzeitbasierten Lernens bei frei verhaltenden Mäusen zu erzeugen. Um die experimentellen Kosten und die Zeit des sensorischen Lernens zu senken, berücksichtigt dieser Ansatz die Kombination von In-vivo- und In-vitro-Experimenten. Nachdem Sie eine fehlende Reaktion auf Zehenkneifen in einer sedierten Maus bestätigt haben, verwenden Sie ein Paar stumpfe Zangen, um die Haut am Hinterkopf zu greifen und eine Schere zu verwenden, um einen eineinhalb cm langen Schnitt zu machen, um den Schädel freizulegen.Kratzen Sie das Periost mit einem Skalpell sanft und tragen Sie einen Tropfen grünen Aktivator auf die Mitte des Schädels auf, um die Knochendurchlässigkeit zu erhöhen. Als nächstes mischen Sie einen Löffel Polymer aus dem Implantationsset mit fünf Tropfen Monomer und einem Tropfen Katalysator und bürsten Sie eine großzügige Menge Zementmischung zwischen den Landmarken des Lambda und des Bregma-Schädels. Mit einer Wischbewegung von Lambda zu Bregma, legen Sie schnell den Kopfpfosten auf den Zement und wenden Sie zusätzlichen Zement um den unteren Teil des Pfostens, um sicherzustellen, dass der Kopfpfosten sicher am Schädel klebt.Während der Zement trocknet, das Harzpulver mit Harzflüssigkeit zu einer glatten Konsistenz mischen und das resultierende Harzgemisch auf den getrockneten Zement und um den Kopfpfosten auftragen. Nachdem Sie das Harz drei Minuten trocknen lassen, verwenden Sie eine Vicryl 4-0 Naht, um die Haut an der Rückseite der Ohren zu schließen und verwenden Sie einen Wattestäbchen, um eine 10 bis 20% Jodlösung auf den Schnitt aufzutragen. Dann legen Sie das Tier unter ein rotes Licht mit Überwachung bis zur vollständigen Genesung.Achtundvierzig Stunden nach der Operation richten Sie die Löcher im gestreiften Gerät mit den Löchern im Kopfpfosten aus und befestigen Sie das Gerät mit einem 1,3 mm Sechskantschraubendreher und zwei 1,2 mm Schrauben am Kopfpfosten. Wir empfehlen, das Gerät mit Hilfe eines zweiten Bedieners am Kopfpfosten zu befestigen, um das Risiko zu vermeiden, den Kopfpfosten abzureißen oder das Tier mit dem Schraubendreher zu verletzen. Um den Scheinzustand zu beheben, drehen Sie das Gerät auf den Kopf und mit dem hinteren Teil des Geräts, der in die rostrale Richtung gerichtet ist, richten Sie die Löcher im Gerät mit den Löchern im Kopfpfosten aus.Bestätigen Sie, dass das Gerät gut gesichert ist und vom Tier nicht entfernt werden kann und dass das Gerät keinen Druck direkt auf die Nase aussetzt, was möglicherweise Zuschmerzen, Atembeschwerden oder Hautverletzungen verursachen kann. Da die Mäuse während der ersten 48 Stunden nach dem Tragen des Geräts einige Verhaltensauffälligkeiten aufweisen können, überwachen Sie die Tiere während dieser Zeit genau und bieten einfachen Zugang zu Nahrung und Wasser, bis sich die Tiere akklimatisieren. Wiegen Sie die Mäuse unmittelbar nach der Implantation und alle 24 Stunden danach bis zum Ende des Experiments, wobei besondere Aufmerksamkeit auf die Mäuse, die das gestreifte Gerät tragen.Um das sensorische Verhalten der geräteangepassten Tiere aufzuzeichnen, sichern Sie die erste Maus mit den schraubeneingesteckten Schrauben am Kopfpfosten auf den Drehteller und legen Sie eine Siebkuppel um das Tier. Schalten Sie alle Lichter im Raum außer dem optokinetischen Projektor aus und starten Sie die optokinetische Reflex-Vollfeldstimulationsaufzeichnung bei verschiedenen Geschwindigkeiten sowohl im Uhrzeigersinn als auch gegen den Uhrzeigersinn. Sobald die Aufnahmen beendet sind, entfernen Sie die Kuppel und schalten Sie das Licht ein.Um den vestibulo-okulären Reflex in pechdunkel aufzuzeichnen, tragen Sie einen Tropfen von 2% Pilokarpin auf die Augen des Tieres auf und warten Sie mindestens fünf Minuten, bevor Sie die Salbe mit einem Wattestäbchen vorsichtig entfernen. Schalten Sie alle Lichter wieder aus und legen Sie eine Box über den Plattenspieler, um das Tier in der Tonhöhe dunkel zu halten. Vor Dem Start des horizontalen vestibulo-okulären Reflextests mit sinusförmigen Winkeldrehungen um eine vertikale Achse mit unterschiedlichen Frequenzen und/oder unterschiedlichen Geschwindigkeiten.Wenn die zweite Aufnahmesitzung beendet ist, kehren Sie die Maus unter einer Infrarotlampe mit Überwachung in ihren Käfig zurück, bis das Tier vollständig von den sekundären Vasodilatatoreffekten des Pilokanins vollständig genesen ist. Nach zwei Wochen, in dem sie entweder einen Schein oder ein gestreiftes Gerät tragen, bleiben die vestibulo-okulären Reflexreaktionen der Scheinmäuse nach der Anpassung unverändert, während die gestreiften geräteangepassten Tiere eine drastisch kompromittierte Reflexreaktion zeigen. Die Quantifizierung des mittleren vestibulo-okulären Reflexes gewinnt bei einer festen Frequenz von 0,5 Hertz und bei 40 Grad pro Sekunde vor und nach dem visuell-vestibulären Mismatch-Protokoll zeigt eine starke Verstärkungsabnahme bei den Mäusen, die das gestreifte Gerät trugen, während die Scheinmäuse keine signifikanten Gain-Änderungen zeigten.Der optokinetische Reflex von Mäusen, die das gestreifte Gerät tragen, ist jedoch mit dem für den Zeitraum vor dem sehvestibulären Protokoll und dem von den Scheintieren nachgewiesenen reflexartigen reflexartig vergleichbar. Achten Sie darauf, die Mäuse täglich zu überwachen und sicherzustellen, dass das Gerät richtig auf den Mäusen positioniert ist und dass es ihre Routinen nicht behindert. Im Anschluss an dieses Verfahren können In-vitro-Elektrophysiologie oder neuronale Bildgebung zur Identifizierung von Sellar-Anpassungsmechanismen oder Verhaltenstests zur Untersuchung verschiedener Reflexausgänge durchgeführt werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

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