Name: Identifizierung von pro- und Polyfluorinated chemische Spezies mit einem kombinierten gezielte und nicht gezielte Screening hochauflösende Massenspektrometrie-Workflow (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Lernen Sie die Quantifizierung und Identifizierung von PFAS in Wasserproben mittels kombinierter gezielter und ungezielter Massenspektrometrie. Diese Methode ermöglicht die umfassende Analyse fluorierter Umweltchemikalien.

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Die US Environmental Protection Agency, durch sein Büro für Forschung und Entwicklung, finanziert und verwaltet die Forschung hier beschrieben. Dieses Dokument wurde von der US Environmental Protection Agency, Office of Research und Entwicklung überprüft und zur Veröffentlichung freigegeben. In diesem Artikel geäußerten Meinungen sind diejenigen der Autoren und repräsentieren nicht unbedingt die Ansichten oder Richtlinien der U.S. Environmental Protection Agency. Diese Forschung wurde teilweise durch einen Termin, um die Postdoctoral Research Program am nationalen Exposition Research Laboratory von Oak Ridge Institut für Wissenschaft und Bildung durch interinstitutionelle Vereinbarung DW89992431601 zwischen verwalteten unterstützt die US Department of Energy und der US Environmental Protection Agency.

1. Sammlung von Wasserproben
<ol><li>Vorbereitung der Waldschutzgebiete Standard Aktien<ol>
<li>Bereiten Sie eine Standardmischung Waldschutzgebiete in Methanol, enthält gezielte Verbindungen des Interesses (z. B. PFOA, PFOS, HFPO-DA) bei 1 ng/µL. Dies ist die Native Waldschutzgebiete Mischung. Kommerziell hergestellte Mischungen sind ebenfalls verfügbar (d. h. PFAC Mix A und Mix-B).</li>
		<li>Bereiten Sie eine Standardmischung mit aufeinander abgestimmten stabiler Isotope beschriftet (SIL) Waldschutzgebiete Verbindungen (z. B. 13C4- PFOA, 13C8- PFOS, 13C3- HFPO-DA) zu 1 ng/µL. Dies ist die ist Waldschutzgebiete Mischung. Kommerziell hergestellte Mischungen sind ebenfalls verfügbar (d. h. MPAFC Mix A und Mix-B). Hinweis: Wenn eine SIL-Version von der gezielten Waldschutzgebiete nicht verfügbar ist, ein Surrogat mit ähnlicher Struktur und Kette Länge kann verwendet werden (z. B. 13C2- PFHxA für HFPO-DA)</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vorbereitung von Feld leer (FB), Spike leer (SB) Proben<ol>
<li>Füllen Sie zwei, Polypropylen sauber mit hoher Dichte (HDPE) oder Polypropylen (PP) Flaschen mit 1.000 mL Labor entionisiertem Wasser (DI), bekannt als Waldschutzgebiete frei. Achtung: Waldschutzgebiete Materialien haben häufig Toxizität und Karzinogenität undefiniert. Darauf sollte geachtet werden, um mündliche oder Haut zu Normen oder Stammlösungen vermeiden.</li>
		<li>Hinzufügen eines die Flaschen auf eine Endkonzentration die erwarteten Probe Konzentrationen (z. B. 100 ng/L) entspricht einer Menge von Waldschutzgebiete Standardmischung. Dies ist die Spike leer (SB).</li>
		<li>5 mL 35 % Salpetersäure Konservierungsmittel auf Spike leer hinzugeben.</li>
		<li>Durchführen Sie SB-Probe und unspiked Feld leer zu den Probenahmeort als Kontrollen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Feld der Probenahme Hinweis: Probensammler Nitril-Handschuhe und Probe aus fließenden Systemen wo möglich tragen. Tippen Sie auf Proben dürfen zu fließen und equilibrate vor der Probenahme (2-3 min).<ol>
<li>Sammeln Sie 500-1.000 mL Wasser von der Feld-Position in eine saubere Flasche HDPE oder PP.</li>
		<li>Probenflaschen und Feld leer 5 mL 35 % Salpetersäure Konservierungsmittel hinzufügen. Achtung: Salpetersäure ist ätzend und ein starkes Oxidationsmittel</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Beispiel Extraktion
Hinweis: Waldschutzgebiete sind allgegenwärtig und anhaltend. Sicherzustellen Sie, dass alle Lösungsmittel des höchsten Grades und auf niedriger Ebene Waldschutzgebiete Kontamination analysiert wurden. Spülen Sie alle Laborgeräte für die Zubereitung von Normen vor der Herstellung von Rohlingen und Proben.
<ol><li>Vorbehandlung der Probe<ol>
<li>Gießen Sie jede Probe in einem separaten, vorgereinigten 1 L HDPE graduierte Zylinder und Datensatz das genaue Volumen.</li>
		<li>Die entleerten Probenflasche 10 mL Methanol hinzu, cap sie, und gut schütteln, um adsorbierten Waldschutzgebiete aus dem Inneren der Flasche spülen.</li>
		<li>Die ausgespülte Flasche mit Methanollösung spülen die gemessenen Wasserprobe zurückzukehren.</li>
	</ol></li>
	<li>Standardkurve für Quantifizierung<ol>
<li>Geben Sie acht, 1 L HDPE/PP-Flaschen mit Waldschutzgebiete-freie VE-Wasser.</li>
		<li>Wählen Sie aus acht gleichmäßig verteilte Konzentrationen der gewünschten Quantifizierung abdeckt. Zum Beispiel: 10, 25, 50, 100, 250, 500, 750 und 1000 ng/L für eine Reihe von 10-1.000 ng/L.</li>
		<li>Jede Flasche die Endkonzentrationen Waldschutzgebiete in 2.2.2 bringen eine Menge von einheimischen Waldschutzgebiete Mischung hinzufügen (z. B. 100 µL Waldschutzgebiete Mix A bis 1L DI Wasser = 100 ng/L).</li>
	</ol></li>
	<li>Internen standard hinaus Hinweis: Zugabe von stabilen Isotop mit der Bezeichnung internen Standards (IS) ist nur erforderlich, wenn neben ungezielte Analyse quantitativer Ergebnisse gewünscht werden.<ol>
<li>Jede Probe in einer Konzentration, die Annäherung an des Mittelpunkt der die Kalibrierkurve ist Waldschutzgebiete Mischung hinzufügen (z. B. 250 µL ist Waldschutzgebiete Mix = 250 ng/L)</li>
	</ol></li>
	<li>Filtration<ol>
<li>Filtern Sie Proben durch GF/A Glasfaser Filter (47 mm, 1,6 µm Porengröße) unter sanfte Vakuum in einem vorgereinigten HDPE Isolierflasche 1 L.</li>
		<li>Wenn Feinstaub in der Flasche bleibt, mit zusätzlichen deionisiertes Wasser in den Filter zu spülen. Das gefilterte Wasser an die Probenflasche oder einen neuen Container für Festphasenextraktion zurückgeben.</li>
	</ol></li>
	<li>Festphasenextraktion (SPE) Hinweis: Patrone Konzentration beschrieben verwendet hier eine konstanten Fluss Kolbenpumpe. Alternative Methoden der Konzentration über ein Vakuum vielfältigen20 oder über ein Online-SPE-LC-MS17 Setup sind möglich aber nicht diskutiert.<ol>
<li>Eine schwache Anion Austausch (Wachs) Patrone mit 25 mL Methanol Zustand.</li>
		<li>Zustand der Wachs-Kartusche mit einer zusätzlichen 25 mL entionisiertem Wasser.</li>
		<li>Position-Pumpe Schlauch in gefilterten Musterflaschen zeichnen und beschriften SPE Kartuschen mit entsprechenden Beispielnamen.</li>
		<li>Pumpe 500 mL Probenwasser durch die Patrone mit einer stetigen Fluss-Rate von 10 mL/min (500 mL gesamt), verwerfen durchströmten Flüssigkeit zu verlieren. Hinweis: Größere oder kleinere Mengen können je nach der erwarteten Probe Konzentrationen konzentriert werden.</li>
		<li>Entfernen Sie die Patrone aus Kolbenpumpe für Elution. Hinweis: Wenn zusätzliche Proben unter Verwendung der gleichen Pumpe zu konzentrieren, sollte die Kolbenpumpe mit 25 mL Methanol gespült werden vor der Installation die nächsten Patrone für Gleichgewichtherstellung.</li>
		<li>SPE Patrone auf vielfältige Vakuum übertragen und mit gläsernen Behälter auszustatten.</li>
		<li>Spülen Sie die SPE Patrone mit 4 mL 25 mM, pH 4,0 Natrium Acetat Puffer unter sanfte Vakuum. Durchströmung zu verwerfen. Waschen Sie SPE Patrone mit 4 mL neutral Methanol. Anmerkung: Waschen Sie neutrale Fraktion gesammelt werden kann, wenn bestimmte nichtionische polare Analyten zu erwarten sind. Ansonsten um Abfälle entsorgen</li>
		<li>Legen Sie eine 15 mL Polypropylen Zentrifugenröhrchen unter jede SPE Patrone Laufmittel zu sammeln. Eluieren Sie Probe mit 4 mL 0,1 % Ammonium Hydroxid in Methanol.</li>
		<li>Entfernen Sie Elution Rohr zu und reduzieren Sie Eluat Volumen auf 500-1.000 µL durch Verdampfung unter trockenem Stickstoff-Stream in einem Wasserbad bei leicht erhöhter Temperatur (40 ° C).</li>
		<li>Konzentrierte Probe, die Extrakte vor der Analyse bei Raumtemperatur aufbewahrt werden können.</li>
	</ol></li>
	<li>Gezielte LC-MS/MS Quantifizierung<ol>
<li>Verdünnte 100 µL Probe mit 300 µL 2 mM Ammonium-Acetat-Puffer in einem HPLC-Probenfläschchen extrahieren.</li>
		<li>Kalibrieren und equilibrate eine HPLC und MS-Systeme gemäß Anweisungen des Herstellers. Hinweis: Hintergrund Waldschutzgebiete werden häufig durch den Einsatz von Fluorpolymer-Komponenten der meisten LC-Systeme und im Sample Vial Septen erkannt. Bestätigen Sie, dass die nachweisbaren Konzentrationen Lücken vor dem Gebrauch vernachlässigbar ist. Änderung des LC Systems Teflon Komponenten ersetzen wird vorgeschlagen, wenn möglich. Die Verwendung von einem "Hold-Up"-Trennsäule angrenzend an das Mischventil LC ist auch empfohlene29.</li>
		<li>Bereiten Sie eine analytische Arbeitsvorrat aus der Standardkurve, Proben und eine zusätzliche Replikation der Standardkurve instrumentellen Drift über den Lauf zu beurteilen. Ein Beispiel-Arbeitsvorrat ist in Tabelle 1dargestellt.</li>
		<li>Analysieren Sie die Proben mit LC und MS Methoden für die gezielte widerrufen von Interesse gegründet. Der Beispiel-LC-Gradient ist in Tabelle 2 gezeigt und MS-Methoden-Parameter sind in Tabelle 3 und Tabelle 4dargestellt. Weitere ausführliche Diskussion McCord Et Al.21entnehmen.</li>
		<li>Generieren Sie eine Standardkurve aus den Standardproben mit dem Gipfel Bereichsverhältnis von Analyten an den internen Standard im Vergleich zu der Konzentration des Analyten. Generieren Sie eine quadratische Regressionsformel mit 1 / x Gewichtung für Konzentration Vorhersage9.</li>
		<li>Quantitate gezielte Analyten in jeder Probe mit dem vorbereiteten Standardkurven und Flächenverhältnis (Standardbereich / Bereich) bei jeder Messung.</li>
		<li>Wenn die Konzentration der Kalibrierung Bereich übersteigt, Verdünnen der Originalprobe mit VE-Wasser, versetzt mit entsprechenden IS Konzentration und erneut zu extrahieren, die Konzentration in den entsprechenden Bereich zu bringen.</li>
	</ol></li>
	<li>Non-gezielte LC-MS/MS-Datenerfassung<ol>
<li>Verdünnte 100 µL Probe mit 300 µL 2 mM Ammonium-Acetat-Puffer in einem HPLC-Probenfläschchen extrahieren.</li>
		<li>Kalibrieren und equilibrate eine HPLC und hochauflösende MS gemäß Anweisungen des Herstellers.</li>
		<li>Bereiten Sie eine analytische Arbeitsvorrat wie 2.6.2.</li>
		<li>Verwenden die Gerätesoftware, Datenerhebung LC-MS mit einer breiten Scan MS1 datenabhängiges Modus, MS/MS. Beispiel LC Farbverlauf in Tabelle 5zu sammeln. Weitere Diskussion über Geräteeinstellungen finden Sie in Strynar Et Al.30 und Newton Et Al.31. Hinweis: Für verbesserte MS/MS kann datenabhängig Qualitätsanalyse mit einer bevorzugten Ion eine Teilmenge der Features, die nach der Verarbeitung der Daten in 2.8.1-2.8.8 durchgeführt werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Non-bezogene Datenverarbeitung Hinweis: Datenanalyse kann mit einer breiten Palette von Software durchgeführt werden und diese Methoden spiegeln nicht die einzige oder beste Methode für eine willkürliche Dataset. Soweit möglich, bieten Schritte eine allgemeine Beschreibung, die in alternative Software durchgeführt werden kann. Verarbeitung der Beispieldaten in diesem Manuskript verwendet wurde mit Hersteller spezifische Software (Software-1 und 2 Software) als detaillierte in Newton Et al. durchgeführt.31.<ol><li>Führen Sie molekulare Merkmalsextraktion der chemischen Eigenschaften unter Verwendung eines mehrere open-Source Software Pakete32,33 oder Kreditor Software zur Identifizierung Monoisotopic Masse, Retentionszeiten und integrierte Peakflächen von chemischen Funktionen.<ol>
<li>Wählen Sie im Software-1, Add/Remove Beispieldateien > Dateien hinzufügen und wählen Sie die raw-Daten aus dem nicht zweckgebundenen Experiment, dann drücken Sie "OK".</li>
			<li>Software 1 Wählen Sie im Batch rekursiv Merkmalsextraktion > Open-Methode zum Laden einer Gegenmacht Methode oder Software-Einstellungen manuell zu bearbeiten. Profinder Einstellungen für Merkmalsextraktion finden Sie in Tabelle 6.</li>
			<li>Wählen Sie im Software-1, nach Merkmalsextraktion, Datei > Exportieren als CSV..., Datei > Exportieren als CEF..., oder Datei > Exportieren als PFA... zur Weiterverarbeitung. CEF-Dateien werden für den Rest der Beschreibung angenommen.</li>
			<li>Erstellen Sie in Software 2 (MPP) ein neues Experiment mit Typ Unbekanntes und Workflow-Typ Datenimport-Assistenten , und klicken Sie auf "OK".</li>
			<li>In MPP- Daten-Dateien auswählen und suchen Sie die exportierten Software 1 Ergebnisse (CEF oder PFA) importieren; dann klicken Sie auf weiter bis Ausrichtung Parameteroptionen angezeigt werden.</li>
			<li>Legen Sie im MPP die Compound Alignment-Werte auf 0,0 (Ausrichtung erfolgte bereits auf die Merkmalsextraktion Software 1, Schritt 2.8.1.2) dann klicken Sie auf weiter durch die einzelnen Schritte bis Ende zur Verfügung steht.</li>
		</ol></li>
		<li>Filtern Sie basierte auf analytische Reproduzierbarkeit Identifikationen. Wo mehrere wiederholte Proben zur Verfügung stehen, sollten die in Funktionen vorliegen > 80 % der einzelnen repliziert und haben eine analytische Variationskoeffizienten (CV) von < 30 %<ol>
<li>MPP wählen Sie im Versuchsaufbau > Experiment Gruppierung und weisen jede raw-Datei eine Gruppe entsprechend ihrer Herkunft-Probe (z. B. Wiederholungen aus der gleichen Quelle sollte in der gleichen Gruppe). Mehrere Gruppen können verschachtelte Variablen (z. B. Instrumental vs. technische Wiederholungen) entsprechend erstellt werden.</li>
			<li>MPP wählen Sie im Versuchsaufbau > erstellen Interpretation wählen Sie dann den Experiment-Parameter (z.B. Gruppe) und klicken Sie auf weiter , bis es fertig gibt. Dies erstellt eine Kategorie, die zukünftige Filterung auf betreiben kann.</li>
			<li>MPP wählen Sie im Qualitätskontrolle > "Filtern nach" Frequenz. Alle Entitäten und die Interpretation der Probe Group(non-averaged) 2.8.2.2 gegründet, dann drücken Sie nächsteEntity List gesetzt.</li>
			<li>Festlegen Sie für Input-Parameter Entität Aufbewahrung bei 80 % der Stichprobe in mindestens eine Bedingung, dann klicken Sie auf weiter , bis es fertig gibt. Benennen Sie die Liste Frequenz gefiltert Features</li>
			<li>MPP wählen Sie im Qualitätskontrolle > Filter auf Probe Variabilität. Entity List auf der Frequenz gefiltert Funktionen vom 2.8.2.4 und die Auslegung zu Group(non-averaged) gesetzt, dann drücken Sie nächste.</li>
			<li>Wählen Sie das Optionsfeld für Rohdaten und Reichweite des Interesses Koeffizient von Variation < 30 %. Klicken Sie nächste > Ende und speichern Sie die Liste als CV gefiltert Features.</li>
		</ol></li>
		<li>Entfernen von Features, wo keine Proben deutlich höher haben (> 3 fache) Fülle als die leere Feld (FB) Probe.<ol>
<li>Wählen Sie MPP in Analyse > Falten Änderung. CV gefiltert Features und die Interpretation der Probe, die Gruppe dann nächster Treffer Entity List gesetzt. Wählen Sie die Option Falte ändern alle gegen einzelne Bedingung und select-Bedingung FB oder was auch immer den Namen der Gruppe für die leere verarbeiteten Probe war.</li>
			<li>Auf dem folgenden Bildschirm die Fold-Change-Cutoff auf 3.0 festgelegt und klicken Sie sich durch bis zum Ende der Anweisungen. Speichern Sie die Liste als FC gefilterte Liste.</li>
		</ol></li>
		<li>Binäre Vergleiche von Einzelproben von Interesse gegen einen entsprechenden Hintergrund Probe ausführen (z. B. vorgelagerten vs. nachgeschaltet eine Punktquelle) Falte-Änderungen für einzelne chemische Eigenschaften bestimmen.<ol>
<li>Wählen Sie MPP in Analyse > Filter auf Vulkan für alle. FC gefilterte Liste und die Interpretation zu Gruppe Entity List gesetzt.</li>
			<li>Für den Fach-Änderung Zustand paar wählen Sie zwei Proben zum Vergleich (z. B. eine gekoppelte vor- und nachgelagerten Probe) und wählen Sie test Ungepaarte Mann-Whitney.</li>
			<li>Für eine vorläufige Analyse nicht wählen Sie einen Wert für mehrere Test-Korrektur auf dem folgenden Bildschirm, klicken Sie sich durch die Ergebnisdarstellung.</li>
			<li>Wählen Sie im Fenster Ergebnisse eine Falte-Änderung Cutoff von 3.0 und einem p-Wert Cutoff auf 0,1. Dann beenden und Export der Liste als Vorrunde Ergebnisse.</li>
		</ol></li>
		<li>Generieren Sie für jedes Objekt nach der Filterung vorhergesagten chemischen 'Formel(n) aus die genauen Masse und zusammengesetzte Massenspektrum.<ol>
<li>Wählen Sie im MPP, Interpretation der Ergebnisse > IDBrowser Identifikation und Vorrunde Ergebnisse Entity List.</li>
			<li>Wählen Sie in der IDBrowser identifizieren alle Verbindungen mit Molekulare Formel-Generator (MFG) als die Methode der Identifizierung.</li>
			<li>In den Optionen erzeugen Formel Elemente Spalte F hinzufügen und das Maximum auf 50 gesetzt, dann wählen Sie Finish. Wählen Sie im Anschluss an Formelgenerierung Speichern und wieder zurück zum MPP.</li>
			<li>In MPP Rechtsklick die gefilterte und MFG abgestimmt Entity List und wählen Sie Exportieren aus. Speichern Sie die Ergebnisse.</li>
		</ol></li>
		<li>Die Monoisotopic Masse der Arten in der reduzierten bedeutende chemische Feature-Liste für diejenigen mit Masse Mängel bezeichnend für Fluorierung zu prüfen; siehe Art und Fiehn34.</li>
		<li>Beachten Sie chemische Serie mit gemeinsamen Polyfluorination Motive (CF2 (m/Z 49.9968), CF2O (m/Z 65.9917), CH2CF2O (m/Z 80.0074), etc.) mit Hilfe eines Massendefekt Plot oder Software-Algorithmus; siehe Diskussion Abschnitt, Liu Et Al.17, Loos Et Al.35 , und Dimzon Et Al.36.</li>
		<li>Suchen Sie vorhergesagten chemischen Formeln oder neutral Massen gegen die EPA Chemie Dashboard-Datenbank und/oder anderen Datenbanken zu möglichen chemische Strukturen zurück.<ol>
<li>Öffnen Sie das EPA Comptox Chemikalien Dashboard Batch such-Tool (https://comptox.epa.gov/dashboard/dsstoxdb/batch_search) und fügen Sie die Liste der Kennungen (Formeln oder Massen) im Feld ID nach der Auswahl der Bezeichner (z. B. MS-ready Formel oder Monoisotopic Masse).</li>
			<li>Wählen Sie Chemische Daten herunterladen... und auch keine physikalische/chemische/Toxikologie Daten für mögliche Übereinstimmungen aus der Dropdown-Liste auf Wunsch.</li>
		</ol></li>
		<li>Mit chemischen Intuition und verfügbaren Referenzdaten, entfernen Sie unwahrscheinlich Spiele mögliche chemische Struktur für jede Formel basierend auf Machbarkeit durch chemische Beständigkeit, physikalische Eigenschaften wie Ionizability oder Hydrophobie, das Vorhandensein der Herstellung von Chemikalien aus nahe gelegenen Quellen, etc. In Ermangelung von Zusatzdaten kann spektrale Machbarkeit rein auf der Grundlage der Literatur Prävalenz eingestuft werden; McEachran Et Al.37anzeigen</li>
		<li>Strukturen mit verfügbaren Standards und/oder gezielte hochauflösende MS/MS bestätigen passende Fragmente gegen Spektren von Datenbanken, in Silico theoretischen Spektren oder manuelle Kuration.</li>
	</ol></li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Probenbehandlung und Vorbereitung Die Einbeziehung der Referenz/Spike Standards sind für eine gezielte Analyse von höchster Bedeutung, da sie eine Rücklaufsperre bieten für analytische Gültigkeit überprüfen. Mangel an QC Proben verhindert, dass die Genauigkeit der Ergebnisse zu beurteilen; die allgegenwärtige Natur Fluorochemicals bedeutet, dass Chance Kontamination von Feldproben, Verarbeitung, Materialien oder LC-MS-System nicht ungewöhnlich ist und berücksichtigt werden muss. Darüber hinaus ermöglicht es für die Validierung des Protokolls unabhängig von Schwankungen in der täglichen Probe Verarbeitung, da viele Schritte sind sehr variabel, insbesondere die SPE und Konzentration Beispielschritte. Die Gewinnung von beiden älteren und neuartige perfluorierte Chemikalien kann durch die Wahl der stationären Phase für Konzentration und Komponenten der Quelle Proben, wie z. B. pH-Wert und Salzgehalt46stark beeinflusst werden. Der Einfluss der Probe Bedingungen sollte berücksichtigt werden, wenn bestimmte Klassen von Pefluorinated Chemikalien von Interesse sind. Alternative Zubereitung Stichprobenplänen für Wasser-Extrakte können verwendet werden, wenn der Laboraufbau vorliegt und die nachgeschalteten Datenanalyse ähnlich bleibt.
Gezielte Datenanalyse Für Verbindungen mit verfügbaren Normen und aufeinander abgestimmte, stabilen Isotop beschriftet interne Standards, sind die wichtigsten Aspekte für die Datenanalyse Instrumental- und Bestimmung der Methode Nachweisgrenzen und geeignete Berichterstattung Bereiche ermittelt werden, auf eine von Labor zu Labor-Basis mit Standardmethoden wie Signal-Rausch-Verhältnis von Low-Level-Standard spikes47. In Ermangelung von aufeinander abgestimmten internen Standards können Fehler von nicht übereinstimmenden Matrixeffekte auftreten, und genaue Rückseite-Vorhersage von Spike Proben kann verwendet werden, um die Genauigkeit der Messungen zu schätzen. Wenn Normen zur Vorbereitung einer Kurve fehlt, eine quantitative Schätzung eines unbekannten kann erfolgen durch Behandlung identisch zu einem eng aufeinander abgestimmte Standard Verbindung, aber Fehler in der Kalkulation sind in der Größenordnung von 10 + Falz mit begrenzte Fähigkeit, die Unsicherheit zu quantifizieren, siehe McCord, Newton und Strynar21. In diesen Fällen Trenddaten können noch gesammelt werden, aber Konzentration Schätzungen sind von Natur aus unzuverlässig.
Ungezielte Datenanalyse Peak Kommissionierung Einstellungen haben einen erheblichen Einfluss auf die Anzahl der chemischen Eigenschaften identifiziert, aber die Qualität der Funktionsauswahl wird ebenfalls stark beeinflusst. Die Entscheidungen der Interesse an der Spitze Kommissionierung sind 1) Intensität der einzelnen Massen in Spektren, die Ionen-Fülle Schwelle aufgenommen werden (2) die Intensität der extrahierten Chromatogramm Spitzen Funktionen, die Funktionserkennung Fülle Schwelle (3) Feature berücksichtigt werden Frequenz, die Replicate Schwelle und 4) analytische Variante, die CV-Schwelle (Abbildung 10).
Setzen unrealistisch niedrige Grenzwerte für Peak Picking Ergebnisse in einer exponentiellen Zunahme Beispielzeit aufzulösenden Zusatzfunktionen der immer geringere Fülle (Tabelle 7). Die Ion-Fülle Schwelle Filter Masse spektrale Eigenschaften wo genug von den einzelnen Isotop Häufigkeiten nicht die Schwelle überschreiten. Dies wählt idealerweise nur für Funktionen mit Qualität MS Spektren, sicherzustellen, dass sie echte chemische Eigenschaften anstatt instrumental Lärm sind, und damit für Formel Vorhersage in downstream-Processing. Ein entsprechenden Schwellenwert basiert auf instrumentelle Rauschen, im Idealfall mindestens 3 x die Rauschschwelle für MS1 scannt. Feature-Fülle-Schwelle filtert chemische Eigenschaften anhand der Intensität oder Fläche die chromatographische Features extrahiert. Dieser Schritt ermöglicht Ablehnung des niedrigen Fülle Gipfel, die in der Regel chromatographische mangelhaft, haben hohe Abweichungen, oder sind das Ergebnis einer anderen schlechten Software-Extraktion. Ein entsprechenden Schwellenwert muss pro Experiment und Matrix basiert auf einem akzeptablen Niveau der Armen Funktion Generation (z. B. Funktionen unterhalb der Schwelle Ausstellung inakzeptabel schlechten Chromatographie) ermittelt werden. Weiter kann analytische QC verwendet, um Funktionen auf chromatographische Ebene basierend auf inkonsistente Identifikation im analytischen und/oder vorbereitende Wiederholungen (Replicate Schwelle) ablehnen oder basierend auf schlechte Reproduzierbarkeit über Wiederholungen (CV-Schwelle). Geeignete Ebenen hängt die Qualität der Peak-Integrations-Software verwendet und die chemischen Einheiten untersucht. Für wasserlösliche perfluorierten Verbindungen und leicht optimierten Integration Protokolle Funktionen identifiziert werden sollten, 80 % der analytischen repliziert und CVs werden voraussichtlich weniger als 30 %, wie in Methodenabschnitt fallen.
Die Gipfel von ungezielte Analyse erkannt quantitative Schätzungen der Konzentrationen von den Materialien erkannt nicht nachgeben. Weiter, die Identität des wahren unbekannten kann schwierig sein zu bestätigen, da neuartige Substanzen Fehlen von öffentlich zugänglichen Datenbanken. Neuartige Strukturaufklärung erfordert umfangreiche Analyse mit mehreren Methoden und Know-how in der Massenspektrometrie und Chemie. Normalisierung der Peakflächen der chemischen Eigenschaften kann jedoch semi-quantitative Schätzungen der Konzentrationen von unbekannten aus bekannten Arten21bereitstellen. Wenn konsistente Probenahme und Vorbereitungsschritte beschäftigt sind, kann Zeit Trendinformationen für einzelne Arten erzeugt werden, um das Fortbestehen einer Chemikalie in die Zukunft zu überwachen, wie die Antwort für eine einzelnen Arten abgesehen von großen konsistent sein sollte Variationen in der Matrix-21.
Der Hauptvorteil dieser Methode ist die Erweiterbarkeit der Probenbehandlung, gezielte und nontargeted Analyse zu ermöglichen. Gezielte Analyse gleichwertige oder bessere quantitative Informationen bietet, fehlt es sehr breite Analyse gewünscht, beim Umgang mit neuer Materialien sowie ihre Beziehung zu Matrixwerkstoffe. Anwendung einer gezielten Methodik oder sogar einen Verdächtigen screening-Methode nur auf bekannten Materialien und begrenzte Datenbanken ist ein blinder bisher unbeobachteten Arten, auch wenn sie erhebliche gesundheitliche Auswirkungen haben können. Wie verbessert die Software und Datenbanken robuster werden, wird die Genauigkeit der unbekannten Identifikation weiter steigen, mit einem gleichzeitigen Rückgang die investierte Zeit und Fachkompetenz erforderlich, die multidimensionalen Daten generiert dadurch zu analysieren Ansatz. Trotzdem ist derzeit generierte Daten der zukünftigen Wertschöpfung, da Daten banking eine Post-hoc-Analyse mit einer neu entwickelten Software ermöglicht und Vergleich über die Zeit hinweg, ermöglicht auch wenn die Identität einer detektierten Verbindung derzeit unbekannt ist.

Die Klasse der pro- und Polyfluoroalkyl Stoffe (PFASs) sind persistente organische Schadstoffe mit bedeutenden Gesundheitsproblem. Die spezifischen Verbindungen Perfluorooctanoic Säure (PFOA) und Perfluorooctanesulfonate (PFOS) haben Trinkwasser beratenden Gesundheitsniveaus vom EPA1,2 und ihre großen US-Produktion nicht mehr in den 2000er Jahren3,4 . Ein bedeutende Verständnis für die Eigenschaften der Waldschutzgebiete wurden Materialien in der Textil- und Verbraucher Produktherstellung Sphären, Hunderte, wenn nicht Tausende von alternativen Waldschutzgebiete Chemikalien entwickelt, um Produktnischen, einschließlich Ersatz für füllen die veralteten Verbindungen5,6,7,8. Gibt es eine laufende müssen die ökologischen Ebenen geraden Kette perfluorierten Carbonsäuren zu überwachen und sulfonates solche PFOS und PFOA ihre Verwandten homologen Reihe, aber aufstrebenden chemische Verbindungen fallen nicht durch etablierte Methoden wie EPA 537 Methode9 und häufig fehlende analytische Standards für traditionelle gezielte Analyse. Die Absicht dieses Protokolls ist somit zweifach. Es bietet einen Weg für die gezielte LC-MS/MS-Analyse der Fluorochemical Arten im Wasser wo analytische Standards zur Verfügung stehen und die nahtlose Integration von eine ungezielte, hochauflösende Massenspektrometrie-basierte Ansatz für die Datenanalyse details Dies ermöglicht die Erkennung von unbekannten oder unerwarteten Verbindungen in der gleichen Proben.
Festphasen-Extraktion (SPE) ist eine etablierte Methode für die Probe Bereinigung und Konzentration mit Anwendungen für viele Analyte und Probe Matrizen10,11. Für Waldschutzgebiete Analyse mehrere feste remanente Phasen einschließlich unpolar, polar funktionalisiert und Ionenaustausch Spalten werden in unterschiedlichem Ausmaß seit Unterklassen von fluorierten Arten in einer Vielzahl von Matrizen9,12 13,14,15,16. Fortschritte in der SPE Probenanalyse mit Online-Setups erheblich erhöhen den Durchsatz des Ansatzes und verbessert die Reproduzierbarkeit der Probenbehandlung, aber die grundlegende Prozess bleibt konsistent17. Einige Anstrengungen, um die offline Konzentration der SPE mit großvolumigen Injektionen entfernen auch durchgeführt worden wären, aber diese erfordern Änderungen der Chromatographie, die sie platzieren Sie außerhalb des Bereichs der lässig Analyse18,19 . Unsere Analyse von Proben verwendet eine Polymere schwach Anion Austausch (Wachs) remanent Phase um sauren Waldschutzgebiete Materialien gründlich von der traditionellen organischen Verunreinigungen zu trennen, während erhebliche Probe Konzentration Faktoren zu erreichen. Diese Wachs-Phase ist wichtig, die kurzkettigen perfluorierten Säuren wie Perfluorobutane Sulfonate (PFBS) oder perfluorierten Ether wie Hexafluoropropylene Oxid Dimer Säure (HFPO-DA), die mehr als die längere Kette ältere perfluorierten polar sind zu erfassen Art20,21. Wie in den letzten Waldschutzgebiete Chemie5es eine deutliche Verschiebung in Richtung kürzere fluorierten Ketten und Äther Aufnahme gab, ermöglicht diese Phase Auswahl eine gründlichere von neuartigen Verbindungen für MS-Analyse.
Gezielte LC-MS/MS Quantifizierung mit Standards authentifiziert und stabiler Isotope mit der Bezeichnung interne Standards bietet ein unübertroffenes Niveau an Spezifität und Sensitivität für die Quantitative Analyse. Während dieser Ansatz in vielen Situationen wünschenswert ist, ist es unpraktisch für allzu häufigen Situationen in der Analyse. Gezielte Ansätze funktionieren nur für Arten, die in der Probe erwartet werden und welche Methoden zuvor festgelegt wurden. Für neue und sich abzeichnende Verbindungen dieser Ansatz ist nicht in der Lage sogar Arten, die möglicherweise von Interesse, unabhängig von ihrer Chemie oder Konzentration, zu erkennen und mit niedriger Auflösung Massenspektrometer sind fast nicht in der Lage, genügend Informationen zu eindeutige chemische Zuweisungen von unbekannten Verbindungen. Infolgedessen entstanden Bereich der ungezielte Analyse, Ausschöpfung des Potenzials von hochauflösenden moderne Massenspektrometer analysiert Proben ohne vorausgesetzten Hypothese und rückwirkend Chemikalien nachweisbar Features in der Probe zuweisen. Dieser Ansatz wurde umfassend in den Bereichen der Biologie22,23,24 und Umweltwissenschaften25,26,27 in zahlreichen Klassen von Chemikalien eingesetzt. Perfluorierte Chemikalien sind besonders einfach, in dieser Methode aufgrund ihrer einzigartigen Masse spektralen Muster zu identifizieren, und Hunderte von Verbindungen sind nur die letzten paar Jahre5,28beschrieben worden.
Das Protokoll hier besprochenen soll richten Sie gezielte LC-MS/MS Waldschutzgebiete Quantifizierung mit der Notwendigkeit zu identifizieren und neue Verbindungen des Interesses semi-quantitativ zu überwachen. Die SPE Phase Auswahl und Probe Präparationstechniken dienen der Erfassung von mehr hydrophile aufstrebenden Waldschutzgebiete Säuren aus dem Wasser zu gewährleisten und kann weniger für längere Kette Polymeren und nichtionischen Arten geeignet. Darüber hinaus durch ungezielte Analyse gewonnenen Daten ist dicht und der hohen Dimensionalität, die erfordert den Einsatz von Datenanalyse-Software. Solche Softwarepakete sind häufig herstellerspezifisch und erfordern Änderungen zwischen Instrument Plattformen bedienen. Soweit möglich, der Analyseprozess ist in einer generischen Weise beschrieben worden und open Source/Freeware-Alternativen verwiesen, aber die Effizienz und Genauigkeit von jeder Software-Ansatz müssen im Einzelfall beurteilt werden.

<table><tbody><tr><td>Acqity Ultra-Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie-System&nbsp;</td><td>Waters Corporation</td><td></td><td>Modifiziert mit PFCs-Analysekit (176001744); ein gleichwertiges UPLC-System ist akzeptabel, wenn der PFAS-Hintergrund überprüft und als niedrig bestätigt wird</td></tr><tr><td>Ammoniumacetat</td><td>Fluka</td><td>17836</td><td>Massenspektrometriequalität >99 % reines</td></tr><tr><td>Ammoniumhydroxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>338818</td><td></td></tr><tr><td>Balance</td><td>Mettler</td><td>AB204S</td><td></td></tr><tr><td>BEH C18 Umkehrphasen-UPLC-Säule, 2,1-fach; 50&nbsp; mm, 1,7&nbsp; &mu; M&nbsp;</td><td>Waters Corporation</td><td>186002350</td><td></td></tr><tr><td>Doppelkolben-Spritzenpumpe</td><td>Waters Corporation</td><td>SPC10-C</td><td></td></tr><tr><td>Eisessigsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ARK2183&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Glas-Mikrofaserfilter</td><td>Whatman</td><td>1820-070</td><td></td></tr><tr><td>Probenflasche aus Polyethylen mit hoher Dichte</td><td>Nalgene</td><td>2189-0032&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Hochauflösendes Massenspektrometer</td><td>Verschiedene</td><td></td><td>Massenspektrometer sollten in der Lage sein, genaue Massen zu liefern < 10ppm und Sammeln von MS/MS-Daten.&nbsp; Agilent 6530 qTOF und Thermo Fisher Orbitrap Fusion wurden in dieser Arbeit verwendet</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Salpetersäure (35 % w/w)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SVCN-5-1</td><td>Kann im Haus mit konzentrierter Salpetersäure und Reagenzwasser hergestellt werden</td></tr><tr><td>Polypropylen Buchner Trichter</td><td>ACE Glas</td><td>12557-09&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cenitrfuge-Röhrchen und Kappe aus Polypropylen</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Vakuumflasche aus Polypropylen (1 L)</td><td>Nalgene</td><td>DS4101-1000</td><td></td></tr><tr><td>Quattro Premier XE Dreifach-Quadrupol-Massenspektrometer&nbsp;</td><td>Waters Corporation</td><td></td><td>Äquivalent Triple-Quadrupol oder besseres System kann stattdessen verwendet werden, sollte eine hohe Empfindlichkeit und Stabilität für eine gezielte Analyse bieten</td></tr><tr><td>Reagenz Wasser</td><td></td><td></td><td>Jede Quelle, die als PFAS-frei eingestuft wurde</td></tr><tr><td>Natriumacetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W302406</td><td></td></tr><tr><td>TurboVap Stickstoffverdampfer&nbsp;</td><td>Caliper Life Sciences</td><td>103198</td><td>Gleichwertige Systeme oder Rotations-Vakuumverdampfer können stattdessen verwendet werden</td></tr><tr><td>SPE-Kartusche mit schwachem Anionenaustausch (Oasis WAX Plus)</td><td>Waters Corporation</td><td>186003519</td><td></td></tr><tr><td>Standard Solutions</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2,3,3,3-Tetrafluor-2-(1,1,2,2,3,3,3-heptafluorpropoxy)propansäure (HFPO-DA)</td><td>Wellington</td><td>HFPO-DA</td><td></td></tr><tr><td>Zusätzliche Zielverbindungsstandards von Interesse</td><td></td><td></td><td>, die auf der Grundlage einer vorläufigen Analyse und der Verfügbarkeit von Standards bestimmt werden</td></tr><tr><td>Massenmarkiertes HFPO-DA</td><td>Wellington</td><td>M2HFPO-DA</td><td></td></tr><tr><td>Natives PFCA/PFAS-Gemisch (2 μg/ml)</td><td>Wellington</td><td>PFAC-MXA</td><td>oder PFAC-MXB; oder einzeln hergestelltes Gemisch mit Verbindungen von Interesse</td></tr><tr><td>Markiertes PFCA/PFAS mit stabilen Isotopen Mischung (2 μg/ml)</td><td>Wellington</td><td>MPFAC-MXA</td><td>oder MPFAC-MXB; oder einzeln hergestellte Mischung, die Verbindungen enthält, die für native PFAS von Interesse</td></tr> sind<tr><td>Software</td>Mass Profiler Professional Agilent Oder Open-Source-Softwarepakete <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Profinder</td><td>Agilent</td><td></td><td>Oder Open-Source-Softwarepakete</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

identifizierung von pro- und polyfluorinated chemische spezies mit einem kombinierten gezielte und nicht gezielte screening hochauflösende massenspektrometrie-workflow

Identifying Per- and Polyfluorinated Chemical Species with a Combined Targeted and Non-Targeted-Screening High-Resolution Mass Spectrometry Workflow

Historische und neue pro- und Polyfluoroalkyl Stoffe (PFASs) haben großes Interesse von der Öffentlichkeit und Behörden von der lokalen auf Bundesebene sammelte. Die Weiterentwicklung der Waldschutzgebiete Chemikalien stellt eine Herausforderung für die Umweltüberwachung, wo hinkt Weiterentwicklung gezielt Methoden unbedingt die Entdeckung neuer chemischer Verbindungen. Deshalb ein Bedürfnis, zukunftsweisende Methoden, die neue und unerwartete Verbindungen zu erkennen, überwachen diese Spezies im Laufe der Zeit und lösen Details ihrer chemischen Struktur ermöglicht zukünftige arbeiten in der menschlichen Gesundheit haben. Zu diesem Zweck ungezielte Analyse durch hochauflösende Massenspektrometrie bietet einen breiten Basis Erkennung Ansatz, der mit fast jeder Probe Vorbereitung Schema kombinierbar und bietet wichtige Funktionen für zusammengesetzte Identifikation nach ihrer Entdeckung. Hierin, wir beschreiben ein Festphasen-Extraktion (SPE) basierte Konzentration Beispielmethode für kürzere Kette und mehr hydrophilen Waldschutzgebiete Chemikalien, wie z. B. pro fluorierten Äther Säuren und Sulfonaten, abgestimmt und Analyse von Proben vorbereitet auf diese Weise in beschreiben gezielte und Nichtziel-Modi. Gezielte Methoden bieten überlegene Quantifizierung Referenzstandards gibt es aber an sich beschränkt auf erwarteten Verbindungen bei der Analyse. Im Gegensatz dazu kann ein ungezielte Ansatz das Vorhandensein von unerwarteten Verbindungen zu identifizieren und sind einige Angaben zur ihrer chemischen Struktur. Informationen über chemische Eigenschaften können verwendet werden, zu korrelieren Verbindungen Probe standortübergreifend und Fülle und auftreten im Laufe der Zeit zu verfolgen.

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die sequentielle gezielte Quantifizierung und ungezielte Analyse von fluorierten Verbindungen im Wasser durch Massenspektrometrie. Diese Methode liefert quantitative Konzentrationen bekannt Fluorochemical Verbindungen und identifiziert unbekannte Chemikalien im zugehörigen Proben mit semi-quantitative Schätzungen von ihrer Fülle.

Identifizierung von pro- und Polyfluorinated chemische Spezies mit einem kombinierten gezielte und nicht gezielte Screening hochauflösende Massenspektrometrie-Workflow

Historical and emerging per- and polyfluoroalkyl substances (PFASs) have garnered significant interest from the public and government agencies from the ...

Dieser Ansatz ermöglicht die Quantifizierung bekannter PFAS und die Entdeckung neuer Substanzen in denselben Proben, verglichen mit gezielten Ansätzen allein, die aufkommende, besorgniserregende Verbindungen vermissen. Dieses Protokoll zielt auf eine breitere Palette von PFAS-Verbindungen ab, die für die neuesten neu entstehenden Chemikalien repräsentativ sind. Wenn der Konzentrationsschritt für die Verbindungen angepasst ist, könnten die hier verwendeten Messmethoden auf jede Klasse von Chemikalien angewendet werden.Um eine Probe vom Feld zu sammeln, tragen Sie Nitrilhandschuhe und sammeln Sie 500 bis 1 000 Milliliter Wasser aus dem Feld in einer sauberen, hochdichten Polyethylen-, HDPE- oder Polypropylenflasche. Fügen Sie der Probenflasche und einem Feldrohling fünf Milliliter 35% Salpetersäure-Konservierungsmittel hinzu und transportieren Sie die Proben zurück ins Labor. Gießen Sie jede Probe in einzelne, vorgereinigte, ein Liter hohe Polypropylen-Zylinder und zeichnen Sie das genaue Volumen der Proben auf.Fügen Sie 10 Milliliter Methanol in jede geleerte Probenflasche, bevor Sie das Flascheninnere verkappen und kräftig schütteln, um absorbierte Pro- und Polyfluoralkylsubstanzen oder PFAS aus dem Flascheninnenraum zu spülen. Dann geben Sie die gemessene Wasserprobe mit der methanolischen Spüle in die spülte Flasche zurück. Um eine Standardkurve für die Quantifizierung zu erhalten, füllen Sie acht leere Ein-Liter-Probenflaschen mit PFAS-freiem entionisiertem Wasser und beschriften Sie die Flaschen mit acht gleichmäßig verteilten Konzentrationen, die den gewünschten Quantifizierungsbereich abdecken.Fügen Sie als Nächstes eine Menge nativen PFAS-Mix zu jeder Flasche hinzu, um die entsprechenden PFAS-Konzentrationen zu erzielen, und fügen Sie der Probe die interne Standard-PFAS-Mischung in einer Konzentration hinzu, die dem Mittelpunkt der Kalibrierkurve entspricht. Filtern Sie dann die Proben durch Glasfaser A filtert unter schonendem Vakuum in einzelne, vorgereinigte, ein Liter hochdichte Polypropylen-Vakuumflaschen. Wenn Partikel in der Flasche verbleiben, spülen Sie das zusätzliche deionisierte Wasser aus und filtern Sie die Wäsche in den Kolben.Für die Festphasenextraktion das gefilterte Wasser in die Probenflasche zurückgeben und einen schwachen Anionenaustausch oder WAX-Patrone mit 25 Milliliter Methanol und weiteren 25 Milliliteren entionisiertem Wasser konditionieren. Positionieren Sie die Pumpenzugschläuche innerhalb der gefilterten Probenflaschen und beschriften Sie die Festphasenextraktion oder SPE-Kartuschen mit den entsprechenden Probennamen. Pumpen Sie 500 Milliliter jeder Probe durch jede Patrone mit einer konstanten Durchflussrate von 10 Millilitern pro Minute, wobei der Durchfluss verworfen wird.Entfernen Sie die WAX SPE-Patronen von den Kolbenpumpen, und übertragen Sie die SPE-Patrone auf einen Vakuumkrümmer, der mit externen Glasbehältern ausgestattet ist. Spülen Sie jede SPE-Patrone mit vier Millilitern 25-Millimolar, pH-Vier-Natriumacetat-Puffer unter sanftem Vakuum, gefolgt von einer vier Milliliter neutralen Methanolwäsche. Am Ende der Wäsche ein 15-Milliliter Polypropylen-Zentrifugenrohr unter jede SPE-Patrone legen, um das Eluent zu sammeln, und die Proben mit vier Millilitern 0,1% Ammoniumhydroxid in Methanol zu deuten.Entfernen Sie dann die Elutionsrohre und reduzieren Sie das Eluatvolumen auf 500 bis 1.000 Mikroliter durch Verdunstung unter trockenem Stickstoffstrom in einem Wasserbad bei 40 Grad Celsius. Für die gezielte Flüssigchromatographie mit Tandem-Massenspektrometrie 100 Mikroliter Probenextrakt mit 300 Mikrolitern zweimillimolaren Ammoniumacetatpuffers in einer Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie-Probedurchstecher verdünnen und einen analytischen Arbeitsvorrat bestehend aus der Standardkurve, Proben und einer zusätzlichen Replikation der Standardkurve zur Beurteilung der instrumentalen Drift über den Lauf erstellen. Analysieren Sie die Proben mit Standard-Flüssigkeitschromatographie und Massenspektrometrie-Methoden für die gezielten Verbindungen von Interesse etabliert.Am Ende der Analyse erzeugen Sie eine Standardkurve aus den Standardstichproben unter Verwendung des Spitzenflächenverhältnisses des Analyten zum internen Standard im Vergleich zur Konzentration des Analyten, und erzeugen Sie eine quadratische Regressionsformel mit einer über x Gewichtung für die Konzentrationsvorhersage. Quantitieren Sie die Zielanalyten in jeder Probe unter Verwendung der vorbereiteten Standardkurven und des Flächenverhältnisses für jede Messung. Übersteigt die Konzentration den Kalibrierbereich, verdünnen Sie die Originalprobe mit entionisiertem Wasser, das mit der entsprechenden internen Standardkonzentration gespickt ist, und re-extract, um die Konzentration in den entsprechenden Bereich zu bringen.Für die nicht zielgerichtete Flüssigchromatographie mit Tandem-Massenspektrometrie 100 Mikroliter Probenextrakt mit 300 Mikrolitern zweimillimolaren Ammoniumacetatpufferinzite in eine Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie-Probedurchstechflasche verdünnen. Nachdem Sie einen Arbeitsvorrat wie gezeigt gesetzt haben, verwenden Sie die Instrumentensoftware, um Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometriedaten mit einem breiten Scan im datenabhängigen Modus zu sammeln. Für die nicht zielgerichtete Datenverarbeitung öffnen Sie das entsprechende Softwarepaket zur Extraktion molekularer Funktionen, und wählen Sie Beispieldateien hinzufügen/Entfernen und Dateien hinzufügen aus, und wählen Sie die Rohdaten aus dem nicht zielgerichteten Experiment aus.Klicken Sie auf OK, und wählen Sie Batch Recursive Feature Extraction and Open Method aus, um eine vorab festgelegte Methode zu laden oder die Softwareeinstellungen manuell zu bearbeiten. Generieren Sie für jedes Feature, das nach dem Filtern verbleibt, vorhergesagte chemische Formeln aus dem exakten Massen- und Verbundmassenspektrum, und öffnen Sie das Tool der Umweltschutzbehörde CompTox Chemicals Dashboard Batch Search. Um die vorhergesagten chemischen Formeln oder neutralen Massen zu durchsuchen, um potenzielle chemische Strukturen zurückzugeben, wählen Sie den Bezeichnertyp aus, und fügen Sie die Liste der Bezeichner in das Bezeichnerfeld ein.Wählen Sie chemische Daten herunterladen und alle physikalischen, chemischen oder toxikologischen Daten, die für potenzielle Übereinstimmungen gewünscht werden, aus dem Dropdown-Menü aus. Bestätigen Sie dann die Strukturen anhand der verfügbaren Standards und/oder gezielten hochauflösenden Tandem-Massenspektrometrie-Abgleich der Fragmente mit den Spektren aus den Datenbanken, in silico theoretischen Spektren oder manueller Kuration. Quantitative Flüssigchromatographie mit Tandem-Massenspektrometrie-Ergebnissen wird in Form von Ionenchromatogrammen für das gesamte Ionenchromatogramm und den extrahierten Ionenchromatogrammen spezifischer chemischer Übergänge für gemessene Chemikalien dargestellt.Der integrierte Spitzenbereich eines chemischen Übergangs hängt mit der Zusammengesetztenfülle zusammen und kann verwendet werden, um die genaue Konzentration anhand einer auf einen internen Standard normalisierten Kalibrierkurve zu berechnen. Die nicht zielgerichtete Analyse mit einem vollständigen MS-Scan ergibt ein gesamtes Ionenchromatogramm für Proben, das die Ad-hoc-Generierung extrahierter Ionenchromatogramme für einzelne Ionen ermöglicht. PFAS-Verbindungen weisen aufgrund ihres Übergewichts an Fluoratomen negative Massendefekte auf, und polyfluorierte Verbindungen weisen positive, aber wesentlich kleinere Massendefekte auf als homologe organische Materialien.Ein zweiter Methodenfilterschritt besteht darin, homologe Reihen zu identifizieren, die sich wiederholende Einheiten enthalten, die PFAS-Arten gemeinsam sind, indem ein geeignetes Softwarepaket verwendet wird. Aus hochauflösenden MS-Daten können eine oder mehrere vermeintliche chemische Formeln mit dem isotopen-Fingerabdruck des Massenspektrums abgeglichen und bewertet werden. Chemische Formeln können weiter bestätigt werden, und einige strukturelle Informationen können aus Tandem-Massenspektrometriedaten gewonnen werden.Weitere Massenspektrometrieexperimente können verwendet werden, um die Identität neuer Verbindungen zu bestätigen, und Probenvergleiche können Informationen über die Prävalenz und relative Menge an Chemikalien geben. Es ist sehr wichtig, geeignete Rohlinge und Qualitätskontrollproben für die Matrix zu haben, um die quantitativen und nicht zielgerichteten Messungen zu validieren. Die gezeigten Strategien sind zum neuen Ansatz für das Umweltscreening für PFAS geworden, indem sie die Entdeckung von Unbekannten und die Vorhersage ihrer Identität ermöglichen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Environment

Umwelt

Die nicht-gezielte Erstellung von Metabolitenprofilen durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie in Verbindung mit Massenspektrometrie (UPLC-MS) ist eine leistungsfähige Technik zur Untersuchung des Stoffwechsels.  In diesem Artikel wird ein typischer Arbeitsablauf für die Erstellung von nicht-zielgerichteten Metabolitenprofilen von Serum beschrieben, einschließlich Probenorganisation und -vorbereitung, Datenerfassung, Datenanalyse, Qualitätskontrolle und Metabolitenidentifizierung.

Large Scale Non gezielte Metabolomic Profiling von Serum von Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Untargeted metabolomics stellt eine Hypothese generieren Momentaufnahme eines metabolischen Profils. Dieses Protokoll wird zeigen, die Extraktion und Analyse von Metaboliten von Zellen, Serum oder Gewebe. Eine Reihe von Metaboliten werden mit flüssigem befragten-Flüssigphasenextraktion, Mikroströmungsfühler UltraPerformance Flüssigkeits-Chromatographie / hochauflösende Massenspektrometrie (UPLC-HRMS), gekoppelt mit Differential-Analyse-Software.

Untargeted Metabolomics aus biologischen Quellen Mit UltraPerformance Flüssigkeits-Chromatographie-hochauflösender Massenspektrometrie (UPLC-HRMS)

Proton Transfer Reaction Time of Flight Mass Spectrometry ermöglicht eine hochempfindliche, schnelle und nicht-invasive Analyse flüchtiger organischer Verbindungen. Um das Potenzial zu demonstrieren, geben wir drei Beispiele: Milchsäurefermentation von Joghurt (Online-Bioprozessüberwachung), verschiedene Apfelgenotypen (groß angelegtes Screening) und retronasaler Raum nach dem Kaffeetrinken (Nasenraumanalyse).

PTR-ToF-MS gekoppelt mit einem automatisierten Probenahmesystem und einer maßgeschneiderten Datenanalyse für Lebensmittelstudien: Bioprozessüberwachung, Screening und Nasenraumanalyse

Eine verbesserte Polymerase-Kettenreaktion-RFLP-Verfahren zur Genotypisierung Kugelfisch-Spezies durch Flüssigchromatographie / Massenspektrometrie beschrieben. Eine Umkehrphasen-Silica-Monolith Säule wird zur Trennung verdaut Amplikons eingesetzt. Dieses Verfahren kann die monoisotopisch Massen von Oligonukleotiden aufzuklären, die zur Identifizierung Basenzusammensetzung nützlich ist.

Verbesserte Polymerase-Kettenreaktion-RFLP Genotypisierung von Toxic Kugelfisch durch Flüssigchromatographie / Massenspektrometrie

Dieses Protokoll beschreibt einen einzigen Durchsatz für ergänzende analytische und Omics Techniken, die ihren Höhepunkt in einer voll gepaart Charakterisierung von natürlichen organischen Stoffen und mikrobielle Proteomics in verschiedenen Ökosystemen. Dieser Ansatz ermöglicht die robuste Vergleiche zur Identifizierung von Stoffwechselwegen und Transformationen für Treibhausgasproduktion Beschreibung und Vorhersage Reaktionen auf Veränderungen der Umwelt wichtig.

Single-Durchsatz ergänzende hochauflösende Analysetechniken für die Charakterisierung von komplexen natürlichen organischen Substanz Mischungen

Described ist ein Proteomik-Workflow zur Identifizierung von Proteininteraktionspartnern aus einer nuklearen subzellulären Fraktion mithilfe der Immunaffinitätsanreicherung eines bestimmten Proteins von Interesse und der etikettenfreien Massenspektrometrie. Der Workflow umfasst subzelluläre Fraktionierung, Immunpräzipitation, filtergestützte Probenvorbereitung, Offline-Bereinigung, Massenspektrometrie und eine nachgelagerte Bioinformatik-Pipeline.

Etikettenfreier Immunpräzipitations-Massenspektrometrie-Workflow für großangelegtes Nuklear-Interactome-Profiling

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Wir haben einen ungezielten metabolomischen Workflow entwickelt, der XY-Meta und metaX zusammen integriert. In diesem Protokoll zeigten wir, wie XY-Meta verwendet werden kann, um eine Lockvogel-Spektralbibliothek aus der Open-Access-Spektrenreferenz zu generieren, und führten dann eine FDR-Kontrolle durch und verwendeten das metaX, um die Metaboliten nach der Identifizierung der Metabolomik-Spektren zu quantifizieren.

Ein integrierter Workflow zur Identifizierung und Quantifizierung von FDR-Kontroll-basierten, ungezielten Metabolomen

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Untersuchung des Langstreckentransports von Perfluoralkylsäuren in Weizen mittels Split-Root-Expositionstechnik

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Fentanyl-Analog-Screening mit LC-TIMS-TOF MS/MS

Lernen Sie die Quantifizierung und Identifizierung von PFAS in Wasserproben mittels kombinierter gezielter und ungezielter Massenspektrometrie. Diese Methode ermöglicht die umfassende Analyse fluorierter Umweltchemikalien.

Identifizierung von pro- und Polyfluorinated chemische Spezies mit einem kombinierten gezielte und nicht gezielte Screening hochauflösende Massenspektrometrie-Workflow (Video) | JoVE Journal

Identifizierung von pro- und Polyfluorinated chemische Spezies mit einem kombinierten gezielte und nicht gezielte Screening hochauflösende Massenspektrometrie-Workflow

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