Name: Gewinnung von extrazellulären Vesikel aus ganze Gewebe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung extrazellulärer Vesikel aus Ganzgewebeproben mit hoher Reinheit. Diese Methode ermöglicht die morphologische und immunphänotypische Charakterisierung interstitieller Vesikel aus Tumoren.

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Die Autoren danken Dr. Richard Nowakowski und die Florida State University Labor Tier Ressourcen für die Bereitstellung und Pflege für die Tiere zu diesem Protokoll respektvoll zu entwickeln. Wir danken Liu Xia, Dr. Rakesh Singh und Florida State University translationale Science Laboratory für Hilfe mit der Massenspektrometrie Arbeit zur nachgelagerten Vesikel Charakterisierung sowie die FSU Biological Science Imaging Resource-Anlage für die Verwendung des Transmissions-Elektronenmikroskop in dieser Studie. Zu guter Letzt danken wir Dr. Mandip Sachdeva (Florida A & M University) für die Spende der Tumor Proben bei der Entwicklung dieser Methode verwendet. Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschüsse aus Florida Department of Health Ed und Ethel Moore Alzheimer Krankheit Forschungsprogramm an D.G.M. und J.M.O (6AZ11) und das National Cancer Institute der National Institutes of Health unter Prämiennummer vergeben R01CA204621 an D.G.M. vergeben

Ganze Köpfe wurden mit Genehmigung von der institutionellen Tier Nutzung und Pflege Committee (IACUC) von der Florida State University erhalten. Insgesamt zwölf Mäusegehirnen (3 Gehirne aus jeder Altersgruppe: 2, 4, 6 und 8 Monate) aus einem C57BL/6 J Hintergrund für EV-Extraktion, wie zuvor beschrieben16dienten. Lung Tumor Proben wurden von Dr. Mandip Sachdeva unter Zustimmung des Florida Agricultural and Mechanical University IACUC großzügig gespendet. Lungentumore stammen aus der menschlichen Adenokarzinom-Zell-Linie H1975 in immungeschwächte nackten Mäusen Balb/c Nu/Nu angebaut. Daten aus zwei repräsentativen Tumor repliziert werden in dieser Studie hervorgehoben.
Hinweis: Eine schematische Übersicht der Vesikel Isolierung und Reinigung Methode ist in Abbildung 1zur Verfügung gestellt.
(1) Gewebe Dissoziation und differentielle Zentrifugation
<ol><li>Vorbereitung 10 mL Dissoziation-Puffer (10 mg Papain; 5,5 mM L-Cystein; 67 µM 2-Mercaptoethanol; 1,1 mM EDTA) in Hibernate-E Medium pro ca. 0,4 bis 1,0 g des Gewebes. Beachten Sie, dass alle Lösungen bei der EV-Anreicherung und Reinigung gefilterte Reinstwasser verdünnt werden sollte.</li>
	<li>Dissoziation-Puffer in einem 50 mL konische Rohr ganz frisches oder gefrorenes Gewebe hinzu, und inkubieren Sie in warmem Wasser Bad bei 37 ° C für 20 min. Gewebe kann in kleinere Bruchstücke vor der Inkubation geschnitten werden, wenn nötig.</li>
	<li>Fügen Sie nach der Inkubation Protease und Phosphatase Inhibitoren für eine endgültige 1 X Konzentration des Dissoziation Puffers, enthält das Gewebe hinzu.</li>
	<li>Gießen Sie die Lösung mit dem Gewebe in ein Locker geschnittenes Dounce-Homogenisator, und distanzieren Sie sanft das Gewebe mit ca. 30 langsamen Schlägen pro Probe zu. Die Anzahl der Schläge kann je nach Gewebe Konsistenz eingestellt werden.</li>
	<li>Transfer dissoziiert Gewebe im Puffer ein 50 mL konische Rohr und Zentrifuge bei 500 X g für 5 min bei 4 ° C, die Zellen und die restlichen faserige oder kohäsiven Gewebefragmente pellet.</li>
	<li>Übertragen Sie den Überstand auf eine saubere 50 mL konische Rohr und Zentrifuge bei 2.000 X g für 10 min bei 4 ° C, pellet und entsorgen Sie große Zelltrümmer.</li>
	<li>Übertragen Sie den Überstand auf eine saubere 50 mL konische Rohr und Zentrifuge bei 10.000 X g 40 min bei 4 ° C zu unerwünschten größere Bläschen oder kleine Apoptotic stellen Pellets wieder. Hinweis: Dieser Pellet kann für zusätzliche Studie von größeren Vesikeln gespeichert werden, falls gewünscht.</li>
	<li>Dekantieren Sie den Überstand durch einen 0,45 µm-Filter in einem sauberen 12 mL Ultrazentrifugation Röhrchen. Hinweis: Dicht fibrotische Gewebeproben möglicherweise nicht leicht gefiltert werden. Diese Proben können durch ein 40 µm Zelle Sieb gefiltert und dann seriell kleinere Nadeln (18 G, 20 G, 22 G) vor der Filterung durch den 0,45 µm-Filter durchlaufen.</li>
	<li>Ultrazentrifugen der Probe bei 100.000 X g für 2 h bei 4 ° C zu kleinen EVs Pellets.</li>
	<li>Überstand abgießen und die Ultrazentrifugation Rohre invertiert für ca. 5-10 min, klopfen häufig zu Restflüssigkeit auf den Seiten von Röhren entfernen lassen. Restflüssigkeit kann auch mit einem Absaugnadeln Vakuum Pipette abgesaugt werden.</li>
	<li>Wieder aussetzen Sie EV Pellet in 1,5 mL 0,25 M Saccharose-Puffer (10 mM Tris, pH 7.4). Es ist wichtig, die vollständige Resuspension des Pellet-in diesem Schritt zu gewährleisten. Dazu decken Sie die Rohre mit Parafilm vor vortexen EVs in Lösung. Rock die Ultrazentrifuge Rohre für 15-20 min bei Raumtemperatur vor einer endgültigen Wirbel-Mix.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie kurz die Rohre bei einer Geschwindigkeit nicht mehr als 1.000 X g flüssige Suspension an der Unterseite des Rohres zu erholen.</li>
	<li>Fahren Sie mit der gradient Reinigungsschritte unten, oder bei Bedarf speichern Sie EV Aussetzung bei 4 ° C über Nacht.</li>
</ol>2. Dichte Gradienten Reinigung
<ol><li>1,5 mL Saccharose/Tris-Puffer mit EVs zum Erstellen einer endgültigen Lösung mit 30 % Iodixanol fügen Sie 1,5 mL 60 % Iodixanol (Stammlösung in Wasser hinzu). Pipette oben und unten mehrmals um Lösung gründlich zu mischen. Seien Sie vorsichtig zu verlieren in der Pipettenspitze Lösung, da die hohen Iodixanol Konzentration ziemlich dickflüssig ist.</li>
	<li>Die 30 % Iodixanol Pufferlösung mit EVs auf den Boden einer 5,5 mL Ultrazentrifugation Röhre zu übertragen.</li>
	<li>Mindestens 1,5 mL 20 % und 10 % Iodixanol Lösungen pro Probe Reinstwasser aus 60 % Iodixanol Vorratslösung vorzubereiten.</li>
	<li>Messen Sie 1,3 mL 20 % Iodixanol und sorgfältig Schicht über der unteren Verlaufsebene mit Hilfe einer Spritze und Nadel eine 18 G. Um zu vermeiden, mischen die Schichten an der Schnittstelle von Dichte, halten Sie die schräge der Nadel in Kontakt mit der Innenseite des Rohres oberhalb der Meniskus Ultrazentrifugation und fügen Sie die Lösung tropfenweise hinzu.</li>
	<li>Layer 1,2 mL 10 % Iodixanol Lösung auf die 20 % Iodixanol Schicht mit der gleichen Technik wie oben beschrieben.</li>
	<li>Sorgfältig balancieren Sie und laden Sie die Ultrazentrifugation Rohre in Rotor Eimer und Zentrifuge in ein Schaukel-Eimer-Rotor bei 268.000 X g 50 min bei 4 ° c Legen Sie die Beschleunigungs- und Verzögerungswerte Geschwindigkeiten der Zentrifuge auf die Mindestsätze zulässig, Unterbrechungen der Dichte Schichten zu vermeiden.</li>
	<li>Beschriften Sie zehn 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen für jede Probe zu Bruchteilen 1 bis 10 von der Dichtegradient entsprechen. Bruchteil 1 bezeichnet man als die obersten Bruch, der zuerst entfernt wird, während Bruch 10 der unteren Anteil zuletzt entfernt ist.</li>
	<li>Nach Abschluss der gradient Ultrazentrifugation sanft entfernen Sie die Rohre aus dem Rotor-Eimern und in einer stabilen Halterung. Eine sichtbare Band von Vesikeln wird oft in der Fraktion von Interesse gesehen werden. Pipette 10 serielle Bruchteile von 490 µL von der Spitze des Farbverlaufs in die entsprechenden Röhren. Es wird eine kleine Menge Flüssigkeit bleiben an der Unterseite des Rohres, die wahrscheinlich kontaminierende Proteine enthält. In diesem Beispiel kann verworfen, oder als Bruchteil 11 beibehalten, falls gewünscht.</li>
	<li>Messen Sie die Brechungsindizes der Fraktionen mit einem Refraktometer. Dies kann auch durchgeführt werden, mit einem Steuerelement Verlauf parallel laufen, wenn Probe Erhaltung notwendig ist. 20-30 µL der einzelnen Fraktionen Iodixanol auf die Oberfläche der Refraktometer mit Pipette, und schätzen die Dichte durch den Vergleich der Brechungsindizes zu bekannten Iodixanol dichten. Beachten Sie, dass Brüche in die Iodixanol-haltige Lösung über Nacht gespeichert werden können, ggf. vor dem fortfahren mit dem nächsten Schritt der Ultrazentrifugation waschen.</li>
	<li>Übertragen Sie jede Fraktion auf eine saubere 12 mL Ultrazentrifugation Rohr. 5 mL 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4) am Rohr und fügen Sie Mischung von Pipettieren langsam rauf und runter hinzu. Hinweis: PBS hinzugefügt, um die Proben sollten partikelfreie, werden gewährleistet durch sterile PBS durch einen 0,22 µm Filter Filterung und Lagerung bei Raumtemperatur Salz Niederschlag zu vermeiden.</li>
	<li>Fügen Sie eine zusätzliche 6 mL 1 X PBS nach oben und wieder umrühren Sie vorsichtig.</li>
	<li>Ultrazentrifugen der Rohre bei 100.000 X g für 2 h bei 4 ° C zu kleinen Bläschen wieder Pellets. Abgießen Sie den Überstand und tippen Sie auf die Rohre trocken ist, bevor die lyse von Vesikeln für Proteinanalytik (Schritt 3) oder Resuspension des EFD zur morphologischen Analyse (Schritt 5).</li>
</ol>(3) lyse und Immunoblot Bestätigung der EV-Proteine
Hinweis: Erhaltung der ganzen Vesikel für Morphologische Charakterisierung oder biologische Aktivität erwünscht, können Forscher direkt mit Schritt 5 fortfahren. In ersten Experimenten oder vor der Massenspektrometrie Analyse sollte allen Fraktionen erholt durch Immunoblot Brüche mit EV Proteine bestätigen analysiert werden.
<ol><li>Fügen Sie 40 µL starke Lyse Puffer (5 % SDS, 10 mM EDTA, 120 mM Tris-HCl pH 6,8, 2,5 % 2-Mercaptoethanol, 8 M Harnstoff) mit dem Zusatz von Protease-Inhibitor um EFD für Proteinanalytik lysieren hinzu, EV Pellet in Ultrazentrifuge Rohr. Hinweis: Wenn nicht-reduzierenden Bedingungen für Antikörpernachweis von Proteinen gewünscht werden, ersetzen Sie Reinstwasser für 2-Mercaptoethanol in der starken Lyse-Puffer.</li>
	<li>Vollständige Resuspension der Pellet und lyse der EVs im Puffer zu gewährleisten, indem man Parafilm über die Ultrazentrifugation tube, vortexen kräftig rocken dann für 20 min bei Raumtemperatur vor einem endgültigen Wirbel.</li>
	<li>Kurz Zentrifugieren Sie bei 1.000 X g für 30-60 s, um das gesamte Sample Volume wiederherzustellen. Übertragen Sie die Probe auf eine neue 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch und speichern bei-20 ° C bis-80 ° C bis Weiterverarbeitung.</li>
	<li>Die Proben für eine Endkonzentration von 1 X um gereinigte Lysates Immunoblot Analyse vorzubereiten, 5 X Laemmli Probenpuffer (10 % SDS, 250 mM Tris pH 6.8, 1 mg/mL Bromophenol blue, 0,5 M DVB-t, 50 % Glycerin, 5 % 2-Mercaptoethanol) hinzugefügt. Hinweis: Wenn nicht-reduzierenden Bedingungen gewünscht werden, ersetzen Sie die DVB-t und 2-Mercaptoethanol mit Reinstwasser.</li>
	<li>Wenn ganze Gewebe Homogenat Kontrollen sind erwünscht, lösen Sie das Gewebe in der Harnstoff-haltige starke Lyse Puffer oben erläuterten mit Protease-Inhibitor, anschließend Zentrifugieren bei 10.000 X g für 10 min die restlichen extrazellulären Matrix, ganze Zellen zu verwerfen oder intakte Zelltrümmer. Die Gewebe-Homogenat für eine Endkonzentration von 1 X 5 X Laemmli Probenpuffer hinzufügen.</li>
	<li>Die Probenpuffer mit EV oder Gewebe homogenisierte Proben bei 95 ° C für 5-10 min kochen, dann gleich Ladevolumen (aus den Gegenwert von 0,1-0,3 g Gewebe Ausgangsmaterial; 1-2 µg des gereinigten EV Protein) der Fraktionen 1-10 zu einem 10 % SDS-PAGE Gel. Laden Sie gleich Masse von Gewebe Homogenat. Größeres Volumen der Proben wird möglicherweise für die Erkennung von unempfindlicher Antikörper benötigt.</li>
	<li>Gehen Sie mit Gelelektrophorese und Western-Blot Analyse wie zuvor detaillierte21 EV Proteine in den gereinigten Lysates bestätigen und relative Häufigkeit der EV in Sekundenbruchteilen zu vergleichen. Hinweis: Sobald EV Protein in Einklang Bruchteilen reproduzierbar nachgewiesen wurde, kann die endgültige Ultrazentrifugation Wäsche im Schritt 2.12 beschrieben auf Farbverlauf Bruchteile von Interesse beschränkt werden.</li>
</ol>(4) EV Protein Quantifizierung
<ol><li>Ein Waschmittel und Harnstoff-kompatibel Fluoreszenz basierende Assays zu verwenden, wenn sensible Quantifizierung der EV Proteine zur weiteren Analyse gewünscht wird (siehe Tabelle der Materialien). Beachten Sie, dass einige Fluoreszenz basierende Assays kompatibel mit dem Bromophenol Blue im Probenpuffer Laemmli sind, direkte lyse des Pellet-EV (in Schritt 2.12) in diesem Puffer zu erleichtern, falls gewünscht.</li>
	<li>Wenn die oben genannten Fluoreszenz-basierte Protein Quantifizierung Kit verwendet wird, vor Ort 1 µL der Probe oder Standards in mindestens auf dem mitgelieferten Filterpapier duplizieren und weiter Protein Quantifizierung nach Herstellerangaben.</li>
</ol>5. Charakterisierung von EV Morphologie
<ol><li>Um ganze Vesikel untersuchen nach der abschließende Zentrifugationsschritt in Schritt 2.12 waschen, auszusetzen Sie gründlich neu EV Pellet in partikelfreie 1 X PBS. Store EVs bei 4 ° C nicht länger als eine Woche bis Verarbeitung, Frost-Tau-Zyklen zu vermeiden. Hinweis: Es ist vorteilhaft, Brüche, die konsequent mit angereicherten EV Protein durch Immunoblot Analyse, morphologische Analysen zu Bruchteilen von Interesse zu begrenzen zuvor bestätigt haben.</li>
	<li>Führen Sie Nanopartikel tracking-Analyse auf ganze EV-Proben, die Konzentration und Größe von Vesikeln in Vorbereitungen, wie zuvor detaillierte22bestimmen.</li>
	<li>Charakterisieren Sie EV Morphologie zu und bestätigen Sie Größenmessungen durch Elektronenmikroskopie von Vesikeln, zu, falls gewünscht. EM-Raster aus Vesikel Suspensionen nach Schritt 5.123zubereitet werden oder alternativ als Block Vorbereitungen24 von Pellets nach Schritt 2.12 verarbeitet werden können.</li>
</ol>6. in-Gel Reinigung und Trypsin-Verdauung für Massenspektrometrie Analyse
<ol><li>Charakterisierung von EV Proteome durch Massenspektrometrie gewünscht, laden Sie gleich Masse (mindestens 10 µg Protein) der Fraktionen, die EVs in einer vorgegossenen Polyacrylamid-Gel zu trennen und zu reinigen Proteine enthalten. Hersteller gelieferten vorgegossenen Gele werden bevorzugt, die Verringerung der Potenzial kontaminierende Proteine (z.B. Keratin) in den Proben eingeführt.</li>
	<li>Führen Sie das Beispiel mindestens 0,5 Zoll in das Polyacrylamid-Gel für Proteinreinigung, dann fix und Flecken mit Coomassie-Färbung, wie oben beschrieben im Detail25.</li>
	<li>Schneiden Sie die Bahnen in 1 mm3 Würfel für Trypsin-Verdauung, als zuvor detaillierte19,26.</li>
	<li>LC-MS/MS-Instrument für die Trennung auf die Trennsäule und anschließende Analyse bestücken Sie 5 µL verdaute Peptid Probe durch Massenspektrometrie im Detail16angegebenen Parametern.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Viel wissenschaftliches Interesse wurde im Hinblick auf die Rollen, die kleine EVs in der Mikroumgebung Tumor sowie in Organentwicklung, Reifung und Funktion spielen generiert. Insgesamt bietet diese Studie einen optimierten Workflow für die Gewinnung von intakten EVs aus Gesamt-Hirn oder Tumor Proben. Während hier wir einfach die Anwendbarkeit dieser Technik auf Lunge Tumor abgeleitet EVs zeigen, könnte diese Methode einfach angepasst werden für die Arbeit auf anderen festen Geweben, Möglichkeiten für weitere Ex Vivo Ch...

Kleinen extrazelluläre Vesikel (EVs) gehören Endosomal abgeleitet Exosomen und kleine Membran-Schuppen-Microvesicles, die von breiten biomedizinischen Interesse sind. Kleinen EVs bestehen aus einer heterogenen Bevölkerung von 50-250 nm Membrane-springen Vesikeln mit biologisch aktiven Proteine, Lipide und Nukleinsäuren, die kollektiv geglaubt werden, um in einer Vielzahl von Krankheiten eine wichtige Rolle spielen. Förderung der Forschung hat diese Vesikel in Neurodegenerative und Prion-Erkrankungen, infektiöse Prozesse, Autoimmun- oder entzündlichen Bedingungen und Tumorwachstum und Metastasierung1,2,3 besonders verwickelt. , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. schnell wachsenden biomedizinischen Forschung in die Bedeutung der EVs in der Pathogenese der Krankheit hat parallel Interesse an der Entwicklung reproduzierbarer und rigoroser Methoden zur Isolierung und Reinigung von diesen Bläschen erzeugt.
Eine historische und aktuelle Herausforderung in EV Charakterisierung wurde die Unfähigkeit, kleine EV Subpopulationen vollständig zu trennen. Diese Herausforderung ist im Wesentlichen auf unser begrenztes Verständnis der unterschiedlichen molekularen Mechanismen für die Biogenese von unterschiedlichen Vesikeln. Überlappende Größe, Dichte und biologischen Fracht zwischen Subpopulationen weitere Umdrehungen diese Unterscheidungen. Teil dieser Herausforderung wurde auch die Verwendung weit unterschiedliche Anreicherung Techniken, Inkonsistenz in nachgelagerte Analyse der isolierten Vesikel in Laboratorien und aufrechtzuerhalten, und untergräbt die globale Anstrengungen zur kategorische EV Populationen zu beleuchten.
Es ist erwähnenswert, dass die Mehrheit der EV Charakterisierung von in-vitro-Sammlung der Zellkultur überstand, mit neueren Studien in vivo Beschreibung Techniken zur Isolierung von Vesikeln aus tierischen oder menschlichen Körperflüssigkeiten, einschließlich Plasma, Urin durchgeführt wurde , und Speichel. EVs in großen Mengen im Umlauf sind, erkannte sie auch, dass diese Vesikel spielen eine wichtige Rolle in der Zell-Zell-Kommunikationsveranstaltungen und in das Interstitium der zellulären Gewebe vorhanden sind. In Zusammenhang mit Krebs möglicherweise interstitielle EVs Modulation der Tumor Mikroumgebung für Krebszelle Aussaat und metastasiertem Wachstum14,15besonders wichtig. Infolgedessen gibt es Wert bei der Entwicklung und Optimierung von Techniken, um Bläschen aus soliden Gewebeproben zu extrahieren. Diese Methoden bieten eine Möglichkeit direkt Orgel - Studium oder Tumor - EVs geerntet von klinischen Proben, einschließlich kleinen Biopsien und teilweise oder vollständige Orgel Resektionen abgeleitet.
In dieser Studie und in einem früheren Bericht, herausgegeben von unserem Labor16wollen wir mehrere wichtige aktuelle EV Bereicherung Methodik Bedenken: 1) um eine reproduzierbare Technik zu isolieren und reinigen EVs nach den höchsten Standards derzeit zu beschreiben auf dem Fachgebiet anerkannt; (2) zu versuchen, kleine EV Subpopulationen hochangereichertes im Endosomal abgeleitet Exosomen zu isolieren; und 3), ein Protokoll für die Gewinnung von diesen Bläschen aus massivem Gewebeproben zur weiteren Charakterisierung zur Verfügung zu stellen.
Vor kurzem, Kowal und Kollegen beschrieben eine relativ kleine Iodixanol Dichtegradient zu trennen und zu reinigen EV Subpopulationen mit größerer Wirksamkeit als vergleichbare Saccharose Dichte Gradienten17. In der zitierten Studie wurden dendritische Zelle abgeleitet EVs, eingefangen in Sekundenbruchteilen relativ geringer Dichte, mit einer Dichte von 1,1 g/mL, in Endosomal Proteine als konsequenteste mit einem hohen Anteil von Exosomen vorhanden in diesem hochangereichertes Bruchteil. Nach Ansicht der Autoren enthalten dieser "bona fide" Exosomal Proteine Tumor Anfälligkeit gen 101 (TSG101), Syntenin-1, CD81 ADAM10, EHD4 und mehrere annexin Proteine17. Diese Technik, um eine Methode der Gewebe Dissoziation von Perez Gonzalez Et al.18 und eine nachfolgende differentielle Zentrifugation Protokoll zum ganzen Gehirn abgeleitet EVs16isolieren beschrieben gelingt später angepasst Wir zeigten auch die Nützlichkeit dieser Methode bei der Charakterisierung EV Proteome durch die Kombination eine sequenzielle Protokoll für nachgeschaltete quantitative und vergleichende Massenspektrometrie vesikuläre Protein, zuvor von unserem Labor19beschrieben. Diese arbeiten parallel, die aus dem Hill-Labor, in dem EVs aus der frontalen Kortex des Gehirns20angereichert wurden.
In dieser Studie wir näher auf diese Technik und die Anwendung des Protokolls vor kurzem von unserem Labor auf die Isolation der EVs aus massivem Lungentumoren zu verlängern. Nach unserer Kenntnis ist dies die erste Studie zu beschreiben, ein Protokoll zur EVs aus ex-Vivo Tumor Proben zu bereichern. Das breite Interesse im Rahmen des EFD als neuartige diagnostischen Biomarkern und ihre Rolle in der Tumorgenese gegeben, wird diese Methode wahrscheinlich für eine wachsende Zahl von wissenschaftlichen Forscher wertvoll erweisen. Aus klinischer Sicht könnte interstitielle EVs großen diagnostischen Wert, vor allem bei Exemplaren Hafen wo histologische Auswertung begrenzt ist. Unsere Hoffnung ist, dass die hier beschriebene Methode eine Grundlage für eine reproduzierbare Technik EVs aus frischen oder gefrorenen tierischen oder menschlichen chirurgische Proben, ebnet den Weg für die künftige Arbeit aufzudecken die bedeutende Rolle in der Pathogenese der Krankheit diese kleine Ernte Bläschen können spielen.

<table><tbody><tr><td>0,45 &Mikro; m Filter</td><td>VWR</td><td>28145-505</td><td></td></tr><tr><td>12 mL Ultrazentrifugenröhrchen</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>5,5 mL Ultrazentrifugenröhrchen</td><td>Beckman Coulter</td><td>344057</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Alix Antikörper</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-7129</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Calnexin</td><td>Antikörper Santa Cruz</td><td>sc-11397</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD63 Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab59479</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD81-Antikörper</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-9158</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Flotillin 2-Antikörper</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-25507</td><td></td></tr><tr><td>Anti-HSC70-Antikörper</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-7298</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Syntenin-1-Antikörper</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-100336</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TSG101-Antikörper</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-7964</td><td></td></tr><tr><td>EZQ Protein-Quantifizierungskit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R33200</td><td></td></tr><tr><td>FA-45-6-30 Rotor&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5820715006</td><td></td></tr><tr><td>FEI CM120 Elektronenmikroskop</td><td>TSS-Mikroskopie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Kaninchen-IgG (Fab-Fragment)</td><td>Genetex</td><td>27171</td><td></td></tr><tr><td>HALT-Phosphatase-Inhibitor (100-fache Lösung)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78420</td><td></td></tr><tr><td>HALT-Protease-Inhibitor (100-fache Lösung)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78438</td><td></td></tr><tr><td>Hibernate E medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1247601</td><td></td></tr><tr><td>MLS-50 Ausschwingrotor</td><td>Beckman Schar</td><td>367280</td><td></td></tr><tr><td>NanoSight LM10</td><td>Malvern</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optima MAX-XP Tisch-Ultrazentrifuge &nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>393315</td><td></td></tr><tr><td>Optima XE-100 Ultrazentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>A94516</td><td></td></tr><tr><td>Optiprep</td><td>Sigma</td><td>D1556</td><td>60% Iodixanol in steriler Wasserlösung</td></tr><tr><td>Q Exaktives HF-Massenspektrometer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-Ziegen-IgG</td><td>Genetex</td><td>26741</td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-Maus IgG</td><td>Genetex</td><td>26728</td><td></td></tr><tr><td>Refracto 30PX (Refraktometer)</td><td>Mettler Toledo</td><td>51324650</td><td></td></tr><tr><td>S-4-104 Rotor</td><td>Eppendorf</td><td>5820759003</td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Ti Schwingschaufel Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>333790</td><td></td></tr><tr><td>Tischzentrifuge 5804R</td><td>Eppendorf</td><td>22623508</td><td></td></tr></tbody></table>

gewinnung von extrazellulären vesikel aus ganze gewebe

Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue

Zirkulierenden und interstitielle kleine Membrane-springen extrazelluläre Vesikel (EVs) stellen viel versprechende Ziele für die Entwicklung von neuartigen diagnostische oder prognostische Biomarker Assays und wahrscheinlich dienen als wichtige Akteure bei der Progression von ein breites Spektrum von Krankheiten. Die aktuelle Forschung konzentriert sich auf die Charakterisierung von Vesikeln aus mehreren Zelle sezerniert und Gewebetypen um besser zu verstehen, welche Rolle der EVs in der Pathogenese der Bedingungen, einschließlich Neurodegeneration, Entzündungen und Krebs. Bleiben jedoch weltweit konsistente und reproduzierbare Techniken zu isolieren und reinigen Vesikel im Gange. Darüber hinaus werden Methoden zur Gewinnung von EVs aus festen Gewebe ex Vivo kaum beschrieben. Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll zum Extrahieren von kleinen EVs von Interesse aus ganz frischen oder gefrorenen Gewebe, einschließlich Gehirn und Tumor Proben zur weiteren Charakterisierung. Wir zeigen die Anpassungsfähigkeit dieser Methode für mehrere nachgeschaltete Analysen, einschließlich Elektronenmikroskopie und Immunophenotypic Charakterisierung von Vesikeln sowie quantitative Massenspektrometrie EV Proteine.

Eine schematische Übersicht über die Gewebe Dissoziation, differentielle Zentrifugation und gradient Reinigung von Vesikeln wird in Abbildung 1angezeigt. Die morphologische und Immunophenotypic Bestätigung der Gradient-gereinigte EVs wird in Abbildung 2hervorgehoben. Ein Diagramm der reproduzierbaren dichten nach Ultrazentrifugation des 10-30 % Iodixanol Verlaufs mit zwei unterschiedlichen Vesikel Populationen migrieren nach oben...

Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll um kleine extrazelluläre Vesikel (EVs) aus dem ganzen Gewebe, einschließlich Gehirn und Tumor Proben zu isolieren. Diese Methode bietet eine reproduzierbare Technik um EVs aus festen Gewebe für weitere nachgelagerte Analysen zu extrahieren.

Gewinnung von extrazellulären Vesikel aus ganze Gewebe

Circulating and interstitial small membrane-bound extracellular vesicles (EVs) represent promising targets for the development of novel diagnostic or ...

Dieses Protokoll bietet eine strenge und reproduzierbare Technik zur Extraktion und Isolierung kleiner extrazellulärer Vesikel aus ganzen Gewebeproben für nachgeschaltete Ex-vivo-Analysen. Mit einem der höchsten Reinheitsgrade, die derzeit erreichbar sind, erleichtert diese Methode die direkte morphologische, immunphenotypic, und tiefe Charakterisierung der interstitiellen Vesikel in verschiedenen Gewebeproben, einschließlich Tumoren sezerniert. Hier zeigen wir die Isolierung von Gewebe-EVs von Hirn- und Lungentumorproben.Diese Technik kann jedoch auch auf Studien mit verschiedenen, gutartigen oder anderen Tumorproben angewendet werden. Zu Beginn 10 Milliliter Dissoziationspuffer im Hibernate-E-Medium für jedes 0,4 bis 1,0 Gramm Gewebe vorbereiten. Fügen Sie das gesamte frische oder gefrorene Gewebe in einem 50-Milliliter-Rohr in den Puffer und in einem warmen Wasserbad bei 37 Grad Celsius für 20 Minuten inkubieren.Danach protease und Phosphatase-Inhibitoren für eine endgültige 1x Konzentration im Dissoziationspuffer hinzufügen. Gießen Sie die Lösung mit dem Gewebe in einen lockeren Fit-Down-Homogenisator. Verwenden Sie etwa 30 langsame Striche pro Probe, um das Gewebe sanft zu dissoziieren.Übertragen Sie dann die dissoziierte Gewebe- und Pufferlösung in ein 50 Milliliter konisches Rohr. Zentrifugieren Sie bei 500x g und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten, um die Zellen und die restlichen Fasern oder kohäsiven Gewebefragmente zu pellet. Übertragen Sie den Überstand auf ein sauberes 50 Milliliter konisches Rohr und Zentrifugen bei 2.000x g und bei vier Grad Celsius für 10 Minuten, um die großen Zellablagerungen zu pellet und zu entsorgen.Übertragen Sie diesen Überstand auf ein sauberes 50 Milliliter konisches Rohr und Zentrifugen bei 10.000x g und bei vier Grad Celsius für 40 Minuten, um unerwünschte größere Vesikel oder kleine apoptotische Körper zu pellet. Dekantieren Sie den Überstand durch einen 0,45-Mikrometer-Filter in ein sauberes 12-Milliliter-Ultrazentrifugationsrohr. Als nächstes ultrazentrifugieren Sie die Probe bei 100, 000x g und bei vier Grad Celsius für zwei Stunden, um kleine Elektrofahrzeuge zu pellet.Dekantieren Sie den Überstand und lassen Sie die Ultrazentrifugationsrohre fünf bis zehn Minuten invertiert, indem Sie häufig tippen, um Restflüssigkeit an den Seiten der Rohre zu entfernen. Dann setzen Sie das EV-Pellet in 1,5 Milliliter 0,25 Molsukrosepuffer wieder aus. Bedecken Sie die Rohre mit Parafilm, und wirbeln Sie dann die Elektrofahrzeuge in Lösung.Die Ultrazentrifugenrohre 10 bis 15 Minuten bei Raumtemperatur schaukeln. Und dann noch einmal Wirbel. Zentrifugieren Sie die Rohre kurz mit einer Geschwindigkeit von weniger als 1.000x g, um die Flüssigkeitssuspension an der Unterseite des Rohres zurückzugewinnen.Bei Bedarf die Suspension bei vier Grad Celsius über Nacht aufbewahren. Fügen Sie zunächst 1,5 Milliliter 60%Iodixanol zu den 1,5 Millilitern des Saccharose-Tris-Puffers hinzu, der die EVs enthält, um eine endige Lösung mit 30% Iodixanol zu erstellen. Pipette auf und ab mehrmals, um die Lösung gründlich zu mischen.Übertragen Sie diese Lösung auf den Boden eines 5,5 Milliliter Ultrazentrifugationsrohrs. Als nächstes mischen Sie den 60%iodixanol Stock mit ultrareinem Wasser, um mindestens 1,5 Milliliter von 20% und einer 10%iodixanol Lösung vorzubereiten. Mit einer Spritze und einer 18-Meter-Nadel 1,3 Milliliter der 20%iodixanol-Lösung messen und sorgfältig auf den unteren Farbverlauf schichten.Halten Sie die Nadelfase in Kontakt mit der Innenseite des Rohres, direkt über dem Meniskus und fügen Sie die Lösung Tropfen weise, um zu vermeiden, mischen Sie die Schichten an der Dichte-Schnittstelle. Schicht 1,2 Milliliter der 10%iodixanol Lösung auf der Oberseite der 20%-Schicht, mit der gleichen Technik. Wägen Und laden Sie die Ultrazentrifugationsrohre sorgfältig in Rotorschaufeln.Stellen Sie die Beschleunigungs- und Verzögerungsgeschwindigkeiten eines Schwenkschaufelrotors auf die Mindestgeschwindigkeiten und zentrifugieren Sie für 50 Minuten auf 268.000x g und auf vier Grad Celsius. Während die Probe zentrifugiert wird, beschriften Sie 10 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohre für jede Probe, die den Fraktionen eins bis 10 des Dichtegradienten entsprechen. Sobald die Zentrifugation abgeschlossen ist, entfernen Sie die Rohre vorsichtig aus den Rotorschaufeln und legen Sie sie in einen stabilen Halter.Pipette 10 Serielle Fraktionen von 490 Mikrolitern von der Oberseite des Farbverlaufs in die entsprechenden Rohre. Messen Sie mit einem Refraktometer die Brechungsindizes der Brüche. Übertragen Sie dann jede Fraktion in ein sauberes 12-Milliliter-Ultrazentrifugationsrohr.Fügen Sie fünf Milliliter 1x PBS zu jedem Rohr und Pipette nach oben und unten langsam zu mischen. Fügen Sie weitere sechs Milliliter 1x PBS an die Oberseite des Rohres und sorgfältig mischen. Ultrazentrifugieren Sie die Rohre bei 100, 000x g und bei vier Grad Celsius, um die kleinen Vesikel neu zu pellet.Dekantieren Sie den Überstand und tippen Sie auf die Rohre trocken, bevor Sie die Vesikel zur Proteinanalyse lysieren oder die Elektrofahrzeuge für die morphologische Analyse resuspendieren. Um die Elektrofahrzeuge für die Proteinanalyse zu lysieren, fügen Sie 40 Mikroliter starken Lysepuffers, der Proteaseinhibitor enthält, in die EV-Pellets ein. Parafilm über jedes Rohr legen und kräftig wirbeln.Als nächstes die Rohre für 20 Minuten bei Raumtemperatur und Wirbel wieder schaukeln. Zentrifugieren Sie die Probe kurz 30 bis 60 Sekunden lang bei 1.000x g, um das gesamte Probenvolumen wiederherzustellen. Jede Probe in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr geben und bei einer Temperatur zwischen 20 und 80 Grad Celsius lagern, bis sie zur Weiterverarbeitung bereit ist.Um die gereinigten Lysate für die Immunoblot-Analyse vorzubereiten, fügen Sie den Proben 5x Laemmli-Probenpuffer für eine Endkonzentration von 1x hinzu. Kochen Sie die Probe bei 95 Grad Celsius für fünf bis zehn Minuten. Laden Sie dann ein gleiches Volumen von Brüchen eins bis zehn in ein 10%SDS-Seitengel.Belasten Sie eine gleiche Masse von Gewebe homogenat. Führen Sie Elektrophorese und Western Blot-Analysen durch, um EV-Proteine in den gereinigten Lysaten zu bestätigen und die relative EV-Fülle in Fraktionen zu vergleichen. In dieser Studie werden extrazelluläre Vesikel extrahiert und aus ganzem Gewebe gereinigt.Nach der Ultrazentrifugation des 10 bis 30%iodixanol Gradienten kann eine Population von Licht-EVs gesehen werden, die bis zu Bruchteil zwei migrieren, während eine Population von dichten Elektrofahrzeugen gesehen werden kann, die je nach Gewebetyp bis zu Bruchteil fünf wandert. Repräsentative Immunoblots der Gradientenfraktionen weisen die effiziente Trennung und Reinigung kleiner tumorabgeleiteter Elektrofahrzeuge in Fraktion fünf auf. Bemerkenswert ist, dass Lungentumorproben in dichten Elektrofahrzeugen angereichert erscheinen, verglichen mit Licht-EVs, die zuvor aus ganzem Hirngewebe geerntet wurden.Repräsentative Nanopartikel-Tracking-Analysen und Elektronenmikroskopie von gewebeabgeleiteten Vesikeln in der vorherrschenden Vesikel-haltigen Fraktion zeigen die Anreicherung und Konservierung ganzer Vesikel. Im Einklang mit der bekannten Größe und Struktur von kleinen Elektrofahrzeugen. Interstitielle Elektrofahrzeuge stellen vielversprechende Ziele für die Entwicklung neuartiger diagnostischer oder prognostischer Biomarker-Assays dar.Diese Technik stellt Forschern Werkzeuge für die Extraktion und Reinigung von Vesikeln für nachgeschaltete Nutzen zur Verfügung. Nach extraktion von ganzen oder lysierten Gewebe-EVs kann eine breite Charakterisierung von Vesikeln einschließlich proteomischer, genomischer und lipidomischer Analysen durchgeführt werden. Darüber hinaus können Stichproben für gezieltere Ansätze verwendet werden.Vesikel, die direkt aus Gewebeproben isoliert werden, können weitere Einblicke in Krankheitsmechanismen, einschließlich der Tumorgenese, liefern und in Zukunft wichtige diagnostische oder prognostische Werkzeuge liefern.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Dieses Video beschreibt die Technik zur Extraktion extrazellulärer Vesikel aus frischem oder gefrorenem Gewebe. Die isolierten extrazellulären Vesikel können für weitere Analysen verwendet werden, um ihre bedeutende Rolle bei der Pathogenese der Krankheit aufzudecken.

Extraktion extrazellulärer Vesikel: Eine Technik zur Isolierung extrazellulärer Vesikel aus ganzen Gewebeproben mittels Differenzialzentrifugation

Dieses Video demonstriert die auf Dichtegradienten-Ultrazentrifugation basierende Aufreinigungsmethode zur Isolierung von Subpopulationen extrazellulärer Vesikel, die für Charakterisierungsstudien geeignet sind.

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Dies ist ein Protokoll, um Gewebe extrazelluläre Vesikel (EVs) aus der Leber zu isolieren. Das Protokoll beschreibt einen zweistufigen Prozess mit Kollagenaseperfusion, gefolgt von differentialer Ultrazentrifugation, um Lebergewebe-EVs zu isolieren.

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Gewinnung von extrazellulären Vesikel aus ganze Gewebe

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