Freistehende Leaf Assays zur Vereinfachung der Genexpressionsstudien in Kartoffeln während des Befalls durch Kauen Voninsekt Manduca sexta
15. Mai 2019
Die vorgestellte Methode schafft natürliches Pflanzenfresser schädigendes Pflanzengewebe durch die Anwendung von Manduca sexta Larven auf abgetrennte Blätter von Kartoffeln. Das Pflanzengewebe wird auf die Expression von sechs Transkriptionsfaktor-Homologen geprüft, die an frühen Reaktionen auf Insektenkraut beteiligt sind.
Dieses Protokoll verwendet einen schlanken Ansatz zur Messung der Pflanzengenexpression als Reaktion auf Insektenkraut. Durch die Verwendung von freistehenden Blättern, die in Petrischalen isoliert sind, sind die Insekten während der relativ kurzen Befallzeit leichter anzuwenden und zu überwachen und tragen zu reproduzierbaren Genexpressionsdaten bei. Dieses Protokoll kann an viele Wechselwirkungen zwischen Pflanze und Insekt angepasst werden.
wenn Basisbeobachtungen aus ganzen Anlagensystemen berücksichtigt werden. Die Unberechenbarkeit der Insektenfütterung kann eine Herausforderung sein. Daher bietet eine zuverlässige Versorgung mit gut inszenierten Larven und gesunden Pflanzen die besten Erfolgsaussichten.
Die Visualisierung, wie gesunde Pflanzen und Insekten auftreten und sich verhalten sollten, ist entscheidend für optimale Ergebnisse, insbesondere für Forscher, die neu auf dem Gebiet der Studie sind. Mit mir wird das Verfahren demonstriert: Frances Perez, Molekularbiologin für die genetische Verbesserung von Obst und Gemüse laboriert. Um Knoten vermehrte GewebeKultur Kartoffelpflanzen vorzubereiten, erhalten Sie zuerst Kennebec Pflanzen aus Explant-Material mit mindestens drei bis vier Knoten.
Verwenden Sie eine sterile Klinge, um die Blätter zu entfernen, die die Zweige in der Nähe des Hauptstamms schneiden und etwa zwei Millimeter Astgewebe pro Blatt hinterlassen. Schneiden Sie etwa zwei Millimeter über und unter jedem Knoten, um die Knotenabschnitte von den Stielen zu entfernen und die Knotenschnitte in einem sterilen Gewebekulturgefäß mit Knotentransfermedium mit nach oben zeigendem Ast anzuordnen. Dann übertragen Sie die Knotenschnitte für zwei bis drei Wochen Wachstum bei 24 Grad Celsius und eine 16-stündige helle, achtstündige dunkle Fotoperiode in eine Pflanzengewebekulturkammer.
Um die Insekten für die Fütterung vorzubereiten, erhalten Sie das gewünschte Larvenstadium von M.sexta und übertragen Sie eine Larve in jeden Brunnen eines geeigneten Einschließungsgefäßes entsprechend der Größe der Larve. Erstellen Sie Platzierungsvorlagen für jeden Erntezeitpunkt mit fünf stabilen Schalen, die einen Satz von sechs mit weißem Papier ausgekleideten Petrischalen in angemessener Größe halten können. Verfolgen Sie einen Satz von sechs Kreisen mit der entsprechend großen Petrischale auf dem Papier in jedem Fach und beschriften Sie einen Satz von Kreisen, die A, B und C steuern, und die anderen befallenen A, B und C.Dann beschriften Sie jede Platzierungsvorlage mit der entsprechenden Erntezeit.
Als Nächstes beschriften Sie ein 1,7 Milliliter Mikrozentrifugenrohr für jeden Kreis in der Platzierungsvorlage, um die Störung, den Pflanzenreplikationsbuchstaben und den Erntezeitpunkt entsprechend zu identifizieren. Wenn alle Rohre beschriftet sind, legen Sie eine sterile Filterpapierscheibe in eine Petrischale pro Schablone und befeuchten Sie die Scheiben mit sterilem Wasser, ohne überschüssigeFlüssigkeit in jeder Schale zu lassen. Legen Sie dann in jeder Platzierungsvorlage ein Gericht in jeden Kreis und platzieren Sie drei Kartoffelpflanzen gleichen Alters und relativer Größe neben jeder Platzierungsvorlage.
Um den Befall zu initiieren, verwenden Sie sterile Schere, um die oberen zwei Größe abgestimmten Blätter von jeder Pflanze zu entfernen und legen Sie ein Blatt in der Kontrolle Petrischale und eine in der befallenen Petrischale für jede Pflanze so schnell wie möglich. Wenn alle Blätter platziert sind, verwenden Sie Soft-Touch-Zangen, um mindestens eine Larve so schnell wie möglich in jede befallene Schale zu übertragen und den Timer für die gewünschte Befallzeit einzustellen. Beobachten Sie die Fütterung, um sicherzustellen, dass alle Larven fressen, und ersetzen Sie bei Bedarf alle nicht fütternden Larven.
Entfernen Sie alle Larven von allen Blättern am Ende der Befallzeit und starten Sie den Timer für die Ernte. Am Ende jedes Erntezeitpunkts jedes Blatt in die entsprechende Röhre geben und die Röhre sofort in flüssigen Stickstoff geben, um die Blattprobe vor der Lagerung bei minus 80 Grad Celsius bis zur RNA-Isolierung einzufrieren. Gesunde, genau inszenierte Larven sollten unmittelbar nach der Platzierung auf der Blattoberfläche mit der Fütterung beginnen und die Fütterung sollte während des Befallszeitraums ziemlich konsistent fortgesetzt werden.
Die Larve am Boden dieses Blattes verbrauchte kein Pflanzenmaterial und ist ein Beispiel für einen erfolglosen Befall. Diese Blätter wurden von zwei Wochen alten, sich vermehrten Gewebekulturpflanzen gelöst und mit unterschiedlichen Raten und Fütterungsstilen für jedes Larvenstadium verzehrt. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wurden vierte Instar-Larven ausgewählt, um die Schäden an den Blättern für reifere Kartoffelpflanzen, die sich den Feldkartoffeln annähern, weiter zu bewerten.
In diesen Genexpressionsstudien wurden zwei neue C2H2-Zinkfinger-Transkriptionsfaktoren identifiziert, die robust auf M.sexta-Kräutersindien reagieren und die Verwendung von freistehenden Blättern für Befall-Assays unterstützen. Denken Sie daran, Alter und Größe abgestimmte Blätter zu verwenden und die Larven für jedes Experiment richtig zu inszenieren, da die Homogenität zu reproduzierbareren Daten führt. Blattgewebe kann auf stressinduzierte reaktive Sauerstoffspezies und Jasmonsäurehormonderivate geprüft werden.
Ganze Transkriptom, Proteom, oder Mikrobiom Studien können auch auf dem BlattGewebe durchgeführt werden.
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Übersicht
Dieses Protokoll verwendet einen vereinfachten Ansatz zur Messung der Genexpression von Pflanzen als Reaktion auf Insektenherbivorie. Durch die Anwendung von Manduca sexta-Larven auf abgetrennten Kartoffelblättern können Forscher die Auswirkungen der Herbivorie auf die Genexpression einfach überwachen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Pflanzenbiologie
- Insekten-Pflanzen-Wechselwirkungen
- Genexpressionsanalyse
Hintergrund
- Insektenbefeuerung beeinträchtigt die Pflanzengesundheit und -entwicklung erheblich.
- Das Verständnis der Pflanzenreaktionen auf Befeuerung ist entscheidend für landwirtschaftliche Praktiken.
- Herkömmliche Methoden zur Untersuchung dieser Wechselwirkungen können komplex und variabel sein.
- Detachierte Blatttests bieten eine kontrollierte Umgebung für Experimente.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer zuverlässigen Methode zur Beurteilung der Genexpression von Pflanzen als Reaktion auf Herbivorie.
- Erleichterung der Untersuchung verschiedener Pflanzen/Insekten-Interaktionen.
- Verbesserung der Reproduzierbarkeit von Genexpressionsdaten.
Verwendete Methoden
- Anwendung von Larven von Manduca sexta auf abgetrennten Kartoffelblättern.
- Isolierung der Blätter in Petrischalen für eine kontrollierte Beobachtung.
- Überwachung des Fressverhaltens der Insekten während des Tests.
- Untersuchung der Expression von Homologen von Transkriptionsfaktoren.
Hauptergebnisse
- Eine erfolgreiche Applikation von Larven führt zu messbaren Veränderungen der Genexpression.
- Die Expression von sechs Homologen von Transkriptionsfaktoren wurde analysiert.
- Die Daten unterstützen die Reproduzierbarkeit und Anpassungsfähigkeit der Methode.
- Die Ergebnisse tragen zum Verständnis der Pflanzenreaktionen auf Herbivorie bei.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll bietet einen zuverlässigen Rahmen, um Pflanzenreaktionen auf Insektenherbivorie zu untersuchen.
- An verschiedene Pflanzen-Insekten-Interaktionen mit geeigneten Kontrollen anpassbar.
- Zukünftige Forschungsarbeiten können auf dieser Methode aufbauen, um umfassendere ökologische Auswirkungen zu erforschen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Detachierte Blatttests verringern die biologische Variabilität in Studien zu Pflanzen-Insekten-Interaktionen und ermöglichen reproduzierbarere Genexpressionsdaten für die Zielvalidierung in der agrarischen Biotechnologie. Dieser vereinfachte Ansatz unterstützt die mechanistische Risikominderung von Fressverhalten-Antwortwegen, indem er frühe Signaltransduktionsereignisse in einem kontrollierten, skalierbaren System isoliert. Die Methode verbessert die Vorhersagesicherheit bei der Identifizierung von Transkriptionsfaktoren und Signalknoten, die für die Entwicklung von Pflanzenschutzmerkmalen relevant sind.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung transkriptioneller Reaktionen auf Fraßschädigung durch Insekten, wodurch die funktionelle Validierung von Kandidatengenen wie C2H2-Zinkfinger-Transkriptionsfaktoren unterstützt wird.
- Operativer Wert: Vereinfacht den experimentellen Workflow, indem Blätter vor der Infestation abgetrennt werden, wodurch der Platzbedarf verringert und die Durchsatzleistung für die gezielte Analyse erhöht wird.
- Strategischer Wert: Erleichtert die Hypothesenprüfung in pflanzlichen Abwehrwegen und unterstützt die Priorisierung von Merkmalen für Verbesserungsstrategien in der Pflanzenzüchtung.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bietet eine standardisierte Plattform zur Quantifizierung von Genexpressionsänderungen als Reaktion auf definierte Herbivorie-Störungen.
- Operativer Wert: Verwendet eine auf Petrischalen basierende Blattbefestigung, um Reproduzierbarkeit und einfache Überwachung des Fressverhaltens von Larven zu gewährleisten.
- Strategischer Wert: Ermöglicht die Anpassung an verschiedene Pflanze-Insekt-Systeme und unterstützt dadurch eine breite Anwendbarkeit in Programmen zur Entdeckung agrochemischer Wirkstoffe und pflanzlicher Merkmale.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem downstream Analysen von Stressmarkern wie reaktiven Sauerstoffspezies und Jasmonsäurederivaten ermöglicht werden.
- Operativer Wert: Ermöglicht die Profilierung des gesamten Transkriptoms, Proteoms oder Mikrobioms von Blattgeweben und verbessert dadurch die Integration multi-omischer Ansätze bei der Merkmalsbewertung.
- Strategischer Wert: Stärkt die translationale Kontinuität, indem frühe Genexpressionsantworten mit phänotypischen Ergebnissen in Bezug auf Herbivorie-Resistenz verknüpft werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Der abgetrennte Blatttest fügt sich in die Entdeckungsbiologiephase ein und ermöglicht die Hypothesenprüfung und Klärung von Wegen in einem frühen Stadium, bevor man zur Leitstrukturfeststellung in der Entwicklung von Pflanzenmerkmalen übergeht.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung herbivorieinduzierter Signalwege und verdeutlicht die Rolle von Transkriptionsfaktoren in frühen Abwehrreaktionen.
- Screening: Stellt Bereitschaft für Assays durch standardisierte Blattpräparation und kontrollierte Befallsbedingungen sicher und gewährleistet reproduzierbare quantitative Ergebnisse.
- Analytik: Erzeugt Genexpressionsdaten, die den Vergleich zwischen befallenen und Kontrollbedingungen ermöglichen und die statistische Auswertung von Behandlungseffekten erlauben.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Kontinuität, indem sie die Analyse von Hormonderivaten und Markern oxidativen Stresses ermöglicht, die mit phänotypischer Resistenz assoziiert sind.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Dient als wiederverwendbare Plattform für verschiedene Pflanze-Insekt-Interaktionen und reduziert so die Kosten für Neuentwicklungen in Programmen zur Merkmalsentdeckung.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Zielvalidierung, indem Störgrößen durch gesamtpflanzliche Variabilität reduziert und auf blattautonome Signalwege fokussiert wird.
- Operativer Wert: Verbessert Standardisierung und Skalierbarkeit durch vereinfachte Blattabtrennung und ein auf Petrischalen basierendes Testformat.
- Strategischer Wert: Verbessert Go/No-Go-Entscheidungen in der Merkmalentwicklung, indem zuverlässige und reproduzierbare Daten zu frühen Abwehrreaktionen bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Kandidatengenen basierend auf konsistenten, auf Fraßschädigung reagierenden Expressionsmustern.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in Pflanzengewebekultur, Larvenstadien-Bestimmung und RNA-Isolationsmethoden.
- Abhängig von steriler Ausrüstung, kontrollierten Wachstumskammern und Infrastruktur zur RNA-Konservierung (flüssiger Stickstoff, Lagerung bei -80 °C).
- Setzt eine standardisierte Auswahl des Blattalters, der Blattgröße und des Larvenentwicklungsstadiums über verschiedene Arbeitsgruppen hinweg voraus, um experimentelle Einheitlichkeit zu gewährleisten.
- Erfordert Anpassungsüberlegungen, wenn die Methode auf andere Pflanzenarten oder Insekten-Fraßfeinde mit unterschiedlichen Fressverhalten ausgeweitet wird.
- Zu den praktischen Einschränkungen zählen die Notwendigkeit gesunder, einheitlich entwickelter Larven sowie eine sorgfältige Überwachung, um ein konsistentes Fressverhalten während des gesamten Testzeitraums sicherzustellen.
