Name: Freistehende Leaf Assays zur Vereinfachung der Genexpressionsstudien in Kartoffeln während des Befalls durch Kauen Voninsekt Manduca sexta (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 56 s
Description: Erfahren Sie ein vereinfachtes Verfahren zur Messung der Genexpression in Kartoffelblättern während des Befalls durch Manduca sexta. Diese Methode liefert reproduzierbare Daten zur Pflanzenabwehr.

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Die Autoren danken Bob Farrar und Alexis Park für die Bereitstellung von Insekten, die in dieser Studie verwendet werden, und für ihre Expertise in der Larveninszenierung. Weiterer Dank an Michael Blackburn und Saikat Ghosh für die kritische Überprüfung des Manuskripts.
Die Erwähnung von Handelsnamen oder kommerziellen Produkten in dieser Veröffentlichung dient ausschließlich der Bereitstellung spezifischer Informationen und impliziert keine Empfehlung oder Billigung durch das US-Landwirtschaftsministerium.
USDA ist Ein Anbieter von Chancengleichheit und Arbeitgeber.

HINWEIS: Das folgende Protokoll ist für eine Person zum Einrichten, Erfassen von Beobachtungen und Sammeln von Proben konzipiert. Mehrere Durchläufe desselben Setups können kombiniert werden, um die biologische Replikation zu erhöhen. Alle zusätzlichen Wiederholungen des Experiments sollten zur gleichen Tageszeit eingerichtet werden, um mögliche tagtägliche Einflüsse auf die Genexpression zu beseitigen. Das Protokoll ist so konzipiert, dass 3 "befallene" Blätter für 5 separate Erntezeitpunkte erstellt werden. Abgestimmte Steuerelementblätter für jeden Zeitpunkt erstellen insgesamt 30 Samples. Das Experiment kann mit einer Vielzahl von Blattgrößen und Larvenstadien durchgeführt werden, aber es wird empfohlen, dass Blattgröße, Larvenstadium und Befallzeit während des gesamten Verfahrens konsistent sein.
1. Zubereitung der Kartoffelpflanzen
HINWEIS: Alle Schritte, die sterile Technik erfordern, müssen in einer Gewebekulturhaube18,19durchgeführt werden.
<ol><li>Bereiten Sie Kennebec-Pflanzen aus der Explantationsquelle vor.<ol>
<li>Vorbereiten des Ausbreitungsmediums.<ol>
<li>4,43 g Murashige und Skoog (MS) mit Vitaminpulver, 20 g Saccharose und 2 g Agarersatz zu 1 L Umkehrosmose (RO) gereinigtem Wasser in einem 2 L Kolben mit Spinbar hinzufügen. Kolben auf eine Rührplatte geben und mischen. Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH auf 5,8 ein, während Sie weiter rühren. HINWEIS: Agar löst sich erst auf, wenn er autoklaviert ist.</li>
			<li>1 ml Konservierungsmittel/Biozid und Autoklav auf Flüssigkeitszyklus für 20 min (121 °C, 101,3 kPa) hinzufügen. Entfernen Sie das Medium unmittelbar nach Demzyklus aus dem Autoklaven und kühlen Sie es auf 50 °C. Übertragen Sie 100 ml steriles und gekühltes Vermehrungsmedium auf sterile Kulturgefäße (z. B. Magenta oder Plantcon) mit steriler Technik in einer Gewebekulturhaube.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bereiten Sie Explant-Material vor.<ol>
<li>Erhalten Sie die Explantationsquelle als Kennebec-Pflanzkartoffeln und entfernen Sie alle Spuren des Bodens, indem Sie mit Demhahn H2O waschen. Sprossen entfernen und mit einem sterilen Skalpell in 2 cm große Stücke schneiden.</li>
			<li>Sterilisieren Sie Sprossenstücke durch Einweichen für 15 s in 70% Ethanol, gefolgt von 13 min in 1:1 Bleichmittel (1 Teil RO-Wasser: 1 Teil konzentrierte keimtötende/kommerzielle Bleichmittel). 5 Mal steril h2 Oabspülen.</li>
			<li>Übertragen Sie Explantationsmaterial mit Sterilisationsmedium in einer Gewebekulturhaube mit steriler Technik auf sterile Gewebekulturgefäße mit Vermehrungsmedium. Übertragen Sie Gefäße in eine Pflanzengewebekulturkammer und wachsen Sie für 2-u20123 Wochen oder bis sich Pflanzenbeilage bei 24 °C, 16 h Licht (140 x-m -2s-1)/8 h dunkle Photoperiode bildet.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiten Sie knotenvermehrte Gewebekultur Kartoffelpflanzen vor.<ol>
<li>Vorbereiten von Knotentransfermedium. HINWEIS: Dadurch werden 10 Gewebekulturgefäße hergestellt, die am selben Tag oder im Voraus verwendet und bei 4 °C bis zum Knotentransfer gelagert werden können.<ol>
<li>Fügen Sie 36,43 g Nährstoff-Agar-Mix zu 1 L RO-gereinigtem Wasser in einem 2 L-Kolben mit einem Spin-Bar hinzu. Kolben auf eine Rührplatte geben und mischen. Stellen Sie den pH-Wert mit KOH auf 5,8 ein, während Sie weiter rühren. HINWEIS: Agar löst sich erst auf, wenn er autoklaviert ist.</li>
			<li>Autoklav auf Flüssigkeitszyklus für 20 min (121 °C, 101,3 kPa). Entfernen Sie das Medium unmittelbar nach Demzyklus aus dem Autoklaven und kühlen Sie es auf 50 °C. Übertragen Sie 100 ml sterilgekühltes Knotentransfermedium auf sterile Kulturgefäße (siehe Materialtabelle)mit steriler Technik in einer Gewebekulturhaube.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bereiten Sie Knotenschnitte vor.<ol>
<li>Erhalten Sie Kennebec-Pflanzen, die aus Explant-Material (hergestellt in Schritt 1.1.2) angebaut werden. Plantlets sollten mindestens 3 bis 4 Knoten (Zweigpunkte) haben. Entfernen Sie die Blätter mit einer sterilen Schere oder einem Skalpell. Schneiden Sie Äste in der Nähe des Hauptstamms, so dass etwa 2 mm Zweiggewebe.</li>
			<li>Entfernen Sie Knotenabschnitte vom Stamm, indem Sie etwa 2 mm über und unter jedem Astpunkt oder Knoten schneiden. Anordnen Sie Knotenschnitte in einem sterilen Gewebekulturgefäß, das das Knotentransfermedium (hergestellt in Schritt 1.2.1.2) in der gleichen Ausrichtung wie im vorherigen Gefäß (Zweig nach oben) enthält.</li>
			<li>Gefäße mit Knotenschnitten in eine Pflanzengewebekulturkammer übertragen und für 2-u20123 Wochen bei 24 °C, 16 h Licht (140 x-2-s-1)/8 h dunkle Photoperiode wachsen. HINWEIS: Jeder Knotenschnitt wird zu einem neuen Pflanzgefäß heranwachsen. Die Anzahl der Stecklinge in jedem Gefäß bestimmt die Blattgröße. Weniger Stecklinge, die pro Gefäß übertragen werden, führen zu größeren Blättern. Drei Pflanzen pro Gefäß haben 15 mm x 20 mm Blätter in 2-u20123 Wochen.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>(Optional) Bereiten Sie bodenangebaute Kennebec-Kartoffelpflanzen vor. HINWEIS: Um größere Blätter zu produzieren, können knotenvermehrte Kartoffelpflanzen auf den Boden übertragen werden.<ol>
<li>Übertragen Sie Kartoffelpflanzen, die in Knotenanbaumittel angebaut werden, auf den Boden, indem Sie die Pflanze sanft aus dem Medium ziehen, bis das gesamte Wurzelgewebe aus dem Agar freigesetzt wird.</li>
		<li>Von den Wurzeln auf den Boden direkt über dem 1. Knoten übertragen und den Boden leicht um die Transplantation verpacken. Wasser schonend, um den Bodenkontakt mit dem Wurzelsystem zu gewährleisten.</li>
		<li>In eine Wachstumskammer mit 16 h Licht (140 'mol'm-2's-1)/8 h dunkle Photoperiode und 25/20 °C Tag/Nacht Temperaturen platzieren. HINWEIS: Pflanzen sind bereit, wenn die beiden oberen vollständig expandierten Blätter die für den Test geeignete Größe erreicht haben.</li>
	</ol></li>
	<li>(Optional) Bereiten Sie in Knollen angebaute Kartoffelpflanzen zu. HINWEIS: Kartoffelpflanzen, die aus Knollen angebaut werden, sind größer und robuster und können nützlich sein, wenn Larven auf Pflanzen aufgezogen werden oder wenn über Nacht Larvenfütterung gewünscht wird.<ol>
<li>Legen Sie eine Kartoffelknolle 6 in tief in einen 10 in Topf mit Bodenmischung ergänzt mit 10 ml pelleted Slow Release Dünger.</li>
		<li>In eine Wachstumskammer mit 16 h Licht (140 'mol'm-2's-1)/8 h dunkle Photoperiode und 25/20 °C Tag/Nacht-Temperatur. Die Pflanzen sind ca. 30-u201240 Tage nach der Knollenbepflanzung bereit. HINWEIS: Verwenden Sie keine Pflanzen, die zu blühen begonnen haben.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Zubereitung von Insekten zur Fütterung
<ol><li>Erhalten Sie gewünschte Larvenstadium von M. sexta. HINWEIS: Larven für diese Studie wurden auf künstliche Nein-Diät durch die 5. instar20 aufgezogen und von einer erfahrenen Person aus dem hauseigenen Insektary inszeniert. Larven können auch teilweise oder vollständig auf Pflanzengewebe aufgezogen werden. Larven essen nicht unmittelbar vor einem Molt und sind am ehesten direkt nach molt zu essen, so dass angemessene Inszenierung ist wichtig21.</li>
	<li>Larven je nach Larvengröße in ein geeignetes Containmentgefäß (z.B. 6-, 12-, 24-Well-Gewebekulturschale) übertragen. Es sollte eine Larve pro Brunnen in der Schale sein. HINWEIS: Larven können territoriales oder Kannibalistisches Verhalten ohne Nahrungsquelle anzeigen und verletzt werden, wenn sie zusammen untergebracht werden.</li>
	<li>(Optional) Larven bis zu 2 h verhungern, da dies die Larvenfütterung verbessern kann. HINWEIS: Larven sollten sich während dieser Zeit in einem Rückhaltegefäß in der Wachstumskammer befinden.</li>
</ol>3. Komponenten-Setup für das Befallexperiment
HINWEIS: Siehe die schematische Zusammenfassung in Abbildung 1.
<ol><li>Erstellen Sie Platzierungsvorlagen für jeden Erntezeitpunkt. HINWEIS: Es ist hilfreich, 5 verschiedene Schalen für jeden Erntezeitpunkt einzurichten. Dies hält Die Proben organisiert und ermöglicht es, die Gerichte effizienter als Set zu bewegen, ohne ihre Anordnung zu ändern. Wenn Schadensberechnungen durchgeführt werden, ist dies unerlässlich, da Bilder vor und nach dem Befall mit der gleichen Brennweite aufgenommen werden müssen.<ol>
<li>Erhalten Sie 5 robuste Schalen, die in der Lage sind, einen Satz von sechs entsprechend großen Petrischalen zu halten und mit weißem Papier zu säumen. HINWEIS: Die Größe der Petrischale basiert auf der Blattgröße, die für den Fütterungstest gewählt wurde. Das Blatt sollte leicht in die Schale passen, ohne die Seiten zu berühren. Zum Beispiel eignet sich eine 60 mm x 15 mm Schale für Blätter bis 50 mm Länge oder Breite.</li>
		<li>Verfolgen Sie einen Satz von sechs Kreisen mit der entsprechend großen Petrischale auf dem Papier in jedem Fach. Beschriften Sie einen Satz von Kreisen 'steuern' A, B und C und die andere 'befallen' A, B und C. Etikettieren Sie auch jede Platzierungsvorlage mit der entsprechenden Erntezeit.</li>
	</ol>
</li>
	<li>(Optional) Richten Sie eine Kamera für die Bildaufnahme "vor dem Befall" und "nach dem Befall" ein.<ol>
<li>Sichern Sie eine Kamera an einem Ständer an der entsprechenden Brennweite für die Bildaufnahme aller Petri-Gerichte in der Platzierungsvorlage.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Beschriften Sie die Erntezeitpunktrohre.<ol>
<li>Beschriften Sie einen Satz von 30, 1,7 ml Mikrozentrifugenrohren, die jedem Kreis in der Platzierungsvorlage entsprechen. Beschriften Sie die Rohre, um die Störung (Steuerung/Befallen), den Pflanzenreplikationsbuchstaben (A, B oder C) und den Erntezeitpunkt (Anzahl der Minuten nach dem Befall) angemessen zu identifizieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie Petri-Gerichte in Schritt 3.1.1 gewählt.<ol>
<li>Legen Sie eine sterile Filterpapierscheibe in jede der 30 Petrischalen ab Schritt 3.1.1. Fügen Sie steriles Wasser hinzu, um die Scheiben zu befeuchten; lassen Sie nicht zu, dass überschüssiges Wasser in der Schale pool. Platzieren Sie jedes Gericht in jedem der sechs Kreise in jeder Platzierungsvorlage.</li>
		<li>Positionieren Sie drei Kartoffelpflanzen neben jeder Platzierungsvorlage. Stellen Sie sicher, dass die Pflanzen alle das gleiche Alter und die relative Größe haben.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Durchführen von Befall
HINWEIS: Eine Erntezeitpunkt-/Platzierungsvorlage wird gleichzeitig eingerichtet.
<ol><li>Entfernen Sie die oberen beiden größenangepassten Blätter von jeder Pflanze mit steriler Schere und legen Sie ein Blatt in die Kontrolle Petrischale und eines in die befallene Petrischale für jede Pflanze (A, B und C). Führen Sie diesen Prozess so schnell wie möglich durch.</li>
	<li>(Optional) Übertragen Sie die Platzierungsvorlage auf den Kameraständer, um ein "vor dem Befall" Bild zu erfassen.</li>
	<li>Übertragen Sie Larven so schnell wie möglich mit Soft Touch Forceps auf jede befallene Schale. Stellen Sie den Timer für die gewünschte 'Befallzeit' ein. HINWEIS: Der Zeitraum, in dem Larven das Blattgewebe verbrauchen, ist die "Befallszeit". Dies ist etwas, das empirisch mit ein paar Testblättern/Larven vor Beginn des tatsächlichen Befalls bestimmt werden kann. Die gewählte "Befallszeit" sollte für alle befallenen Blätter konsistent sein. HINWEIS: Larven sollten mit Vorsicht durch Soft-Touch-Zangen behandelt werden. 2. bis 4. Instern kann sanft von ihrem Horn oder Mittelteil erfasst werden.</li>
	<li>Beobachten Sie die Fütterung, um sicherzustellen, dass alle Larven fressen. Larven sollten je nach Fütterungsverhalten hinzugefügt/entfernt werden. Halten Sie die Deckel auf den Petri-Gerichten so weit wie möglich. HINWEIS: Pro Blatt können mehrere Larven verwendet werden.</li>
	<li>Entfernen Sie Larven von den Blättern am Ende der Befallszeit. Starten Sie den Timer für die Erntezeit.</li>
	<li>(Optional) Übertragen Sie die Platzierungsvorlage auf den Kameraständer, um das Bild "nach dem Befall" zu erfassen. HINWEIS: Alle sechs Blätter in der Platzierungsvorlage werden zur jeweiligen Erntezeit geerntet.</li>
</ol>5. Ernteblätter
<ol><li>Jedes Blatt am Ende jedes Erntezeitpunkts in das entsprechende beschriftete Rohr geben und sofort einfrieren, indem man das Rohr in Flüssigkeit N2abgibt. Lagern Sie das geerntete Pflanzengewebe bei -80 °C bis zur Isolierung der RNA.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 4-u20125.1 für jeden Erntezeitpunkt.</li>
</ol>6. Verarbeitung von Blattgewebe für die Genexpressionsanalyse
<ol><li>Das gefrorene Blattgewebe zu einem Pulver mit einem Mikroschädling mahlen.</li>
	<li>Isolieren Sie die gesamte RNA und den Prozess zur Genexpression, wie zuvor beschrieben22.</li>
</ol>7. (Optional) Abschätzung der Blattschäden
<ol><li>Schätzen Sie den Prozentsatz der Blattschäden visuell oder berechnen Sie die Blattfläche in den Vor- und Nachbefallbildern.</li>
	<li>Messen Sie die Blattfläche mit Software-Tools (z.B. Phenophyt)23.</li>
	<li>Berechnen Sie aus Blattflächenmessungen den Schadensprozentsatz als % Schaden = [(Blattfläche vor – Blattfläche nach)/Blattfläche vor] x 100.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Die Verwendung bestehender Methoden für pflanzenkräuterelfenbeinte Pflanzen ist nicht erforderlich, um das Ziel dieser speziellen Studie zu erreichen (d. h. eine Reihe von Kandidatengenen auf ihre Reaktion auf Densonfall zu untersuchen). Der offensichtliche Vorteil der losgelösten Blattverfeinerung ist die Verkürzung der Zeit, die es braucht, um Kräuter-Assays durchzuführen. Die sperrige Natur ganzer Pflanzen mit Clipkäfigen wird eliminiert und Tests werden früher durchgeführt, da Pflanzen, die noch 2 Wochen alt sind, zu...

Herbivory setzt eine Reihe molekularer Ereignisse in Gang, bei denen eine Pflanze sowohl den Angriff identifizieren als auch eine angemessene Reaktion auf ihr Überleben montieren kann. Eine Pflanze erhält zwei grundlegende Hinweise von kauenden Insekten; eine durch die physische Schädigung des Gewebes und die andere durch insektenspezifische Substanzen. Schadensassoziierte molekulare Muster (DAMPs) werden als Reaktion auf Schäden freigesetzt, die durch Larvenmspiele verursacht werden, und lösen eine klar definierte Wundreaktion aus, die zu einer Erhöhung des Hormons Jasmonsäure und der Transkription der Verteidigungsgene1führt. Eines der bekanntesten DAMPs ist systemin, ein Polypeptid, das durch die Spaltung des größeren Prosystemin-Proteins gebildet wird, nachdem ein Blatt 2,3verwundet wurde. Die Jasmonsäure-Wundreaktion wird durch pflanzenfressende molekulare Muster (HAMPs) weiter moduliert, die aus Raupenspeichel, Darminhalt (regurgitant) und Kot (frass) abgeleitet werden können4. Insekten verwenden diese Substanzen, um entweder die Abwehrzuwehr zu steigern oder zu umgehen5. Transkriptionsfaktoren leiten dann die Botschaft von Hormonsignalen in der Abwehrreaktion über die Regulierung der nachgeschalteten Abwehrgene6,7,8weiter.
Einige Pflanzen-Insekten-Interaktionsstudien, die in Laborumgebungen verwendet werden, sind vom simulierten Typ, mit dem Ziel, die natürliche Methode der Fütterung durch das Insekt zu annähernden. Simuliertes Krautwird wird in der Regel durch die Schaffung künstlicher Schäden an Pflanzengeweben mit verschiedenen Werkzeugen erreicht, die den spezifischen Mechanismus von Insektenmundteilen imitieren, die ausreichen, um die Freisetzung von DAMPs zu verursachen und die Produktion von Verteidigungsgenen auszulösen. Andere insektenspezifische Komponenten wie mundende Sekrete oder Regurgitant werden oft hinzugefügt, um den Beitrag von HAMPs9,10,11zu replizieren. Die Erstellung einer bestimmten Größe und Art der Wunde und die Anwendung präziser Mengen an HAMPs ist ein Vorteil für diese Arten von Studien und kann reproduzierbarere Ergebnisse liefern. Natürliche Pflanzenschutzstudien, bei denen Schäden am Pflanzengewebe durch die Anwendung von felderworbenen oder im Labor gezüchteten Insekten durchgeführt werden, sind oft schwieriger, da Wundgrößen- und HAMP-Mengen durch Insektenverhalten bestimmt werden und die Variabilität der daten. Die natürlichen versus simulierten Methoden und ihre Vor- und Nachteile sind in der Literatur gut diskutiert12,13,14.
Um frühe Signalereignisse wie Transkriptionsfaktoren zu untersuchen, muss ein bestimmter Prozentsatz des Blattes in relativ kurzer Zeit verbraucht werden, so dass Larven sofort zu kauen beginnen und den Verbrauch aufrecht erhalten müssen, bis das Blatt zur Analyse eingefroren ist. M. sexta ist ein gefräßiger Feeder auf mehreren solanaceous Pflanzen während vieler seiner Larvenstadien, so dass es ideal für die Vermittlung von maximalen Schaden in einer relativ kurzen Zeit15. Dies ist praktisch, wenn frühe Signalereignisse untersucht werden, da die Reaktion der Pflanze fast unmittelbar nach einem Insektenkontakt mit der Blattoberfläche16,17auftritt. Die häufig verwendete Clip-Käfig-Methode der Einschließung erweist sich als ungeschickt, da mehrere Käfige während des gesamten Experiments kontinuierliche Anpassungen erfordern würden, um die Entfernung oder Zugabe von Larven zu ermöglichen. Die Blätter müssen auch groß genug und stark genug sein, um mehrere Insekten zu unterstützen, die gleichzeitig füttern. Diese Arten von Kartoffelpflanzen benötigen viel Platz, um die Fütterung zu beobachten. Larven werden oft an die Unterseite der Blattoberfläche verlagert, was auch Fütterungsbeobachtungen recht schwierig macht. Ganze Pflanzen zu verwenden, um diese Experimente durchzuführen, ist eindeutig umständlich.
Die aktuelle Studie verwendet freistehende Blätter, die in Petrischalen isoliert sind, anstatt ganze Pflanzen, um den gesamten Pflanzenansatz für das Studium von Kräutern zu rationalisieren und zu vereinfachen. Die Anwendung des Protokolls in dieser Studie beschränkt sich auf die Beobachtung einer Gruppe von C2H2-Transkriptionsfaktoren, die früh in Kartoffelblättern nach pflanzenfressenden Schäden durch M. sexta Larven induziert wurden.

<table><tbody><tr><td>Agar-Ersatz</td><td>PhytoTechnology Laboratories</td><td>G3251</td><td>Produkt ist ein Gelzan-Containment-Gefäß</td></tr><tr><td>(6-, 12- oder 24-Well-Schale)</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>08-772-49, 08-772-50, 08-72-51</td><td>Viele andere Firmen verkaufen diese Produkte</td></tr><tr><td>manduca Eier&nbsp;</td><td>Carolina Biological Supply Company</td><td>143880</td><td>30-50 Eier</td></tr><tr><td>manduca Eier&nbsp;</td><td>Great Lakes Hornworm</td><td>NA</td><td>50, 100, 250 oder 500 Eier</td></tr><tr><td>Manduca Larven</td><td>Carolina Biological Supply Company</td><td>Anfrage für spezifische Larven Anfragen</td><td>für</td></tr><tr><td>Manduca Larven</td> im Stadium Great <td>Lakes Hornwurm</td><td>für spezifische Larven Anfrage</td><td>für</td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen im Instar, 1,7 ml&nbsp;</td><td>Thomas Scientific</td><td>1158R22</td><td>diese wurden in flüssigem N2 getestet und explodieren nicht</td></tr><tr><td>Murashige & Skoog (MS) Basalmedium mit Vitaminen</td><td>PhytoTechnology Laboratories</td><td>M519</td><td>zur Herstellung einer</td></tr><tr><td>Nährstoff-Agar-Mischung</td> aus Vermehrungsmedium <td>verwendet PhytoTechnology Laboratories</td><td>M5825</td><td>Produkt ist Murashige & Skoog Basal Medium mit Vitaminen, Saccharose und Gelzan</td></tr><tr><td>Papierfilterscheiben</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>09-805A</td><td>Whatman Circles-Kauf passend für Petrischale</td></tr><tr><td>Petrischale, 60X15 mm oder 100X15 mm</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>FB0875713A oder FB0875712</td><td>Kaufgröße, die für</td></tr> Kartoffelknollen in Blattgröße geeignet ist<tr><td>&nbsp;</td><td>jede</td><td>Größe B (nicht biologisch)</td><td>schlägt Maine Farmer vor" s</td></tr><tr><td>Tauschtöpfe, 10" &nbsp;</td><td>Griffin Gewächshausbedarf, Inc.</td><td>41PT1000CN2</td><td></td></tr><tr><td>Konservierungsmittel/Biozid</td><td>Plant Cell Technology</td><td>NA</td><td>Produkt ist PPM (Plant Preservative Mixture)</td></tr><tr><td>Pflanzkartoffeln für explantische Quellen</td><td>jeder</td><td>B-Größe (nicht biologisch)</td><td>schlagen Maine Farmer vor s Austausch</td></tr><tr><td>Langzeitdünger (14-14-14 )</td><td>any</td><td>NA</td><td>Osmocote ist eine beliebte Markenmarke</td></tr><tr><td>Soft Touch Pinzette</td><td>BioQuip</td><td>4750</td><td></td></tr><tr><td>Bodenmischung</td><td>Griffin Greenhouse Supplies, Inc.</td><td>65-51121</td><td>Produkt ist ein steriles Kulturgefäß mit Sunshine LC1-Mix</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>PhytoTechnology Laboratories</td><td>C2100</td><td>Magenta-Gefäß, PTL-100</td></tr><tr><td>Sterilkulturgefäß</td><td>Fisher Wissenschaftlich&nbsp;</td><td>ICN2672206</td><td>Produkt ist MP Biomedicals Plantcon</td></tr></tbody></table>

freistehende leaf assays zur vereinfachung der genexpressionsstudien in kartoffeln während des befalls durch kauen voninsekt manduca sexta

Detached Leaf Assays to Simplify Gene Expression Studies in Potato During Infestation by Chewing Insect Manduca sexta

Die multitrophische Natur von Genexpressionsstudien von Insektenkraut erfordert eine große Anzahl biologischer Replizieren, wodurch einfachere, schlankere Kräuterschutzprotokolle erforderlich sind. Störungen von Kauinsekten werden in der Regel in ganzen Pflanzensystemen untersucht. Während diese ganze Organismus-Strategie beliebt ist, ist es nicht notwendig, wenn ähnliche Beobachtungen in einem einzigen abgetrennten Blatt repliziert werden können. Es wird davon ausgegangen, dass die für die Signaltransduktion erforderlichen Grundelemente innerhalb des Blattes selbst vorhanden sind. Bei frühen Ereignissen in der Signaltransduktion müssen Zellen nur das Signal von der Störung empfangen und an benachbarte Zellen übertragen, die auf Genexpression untersucht werden.
Die vorgeschlagene Methode ändert lediglich den Zeitpunkt der Ablösung. In ganzen Pflanzenexperimenten sind Larven auf ein einzelnes Blatt beschränkt, das schließlich von der Pflanze gelöst und auf Genexpression untersucht wird. Wenn die Reihenfolge der Exzision umgekehrt wird, von der letzten in ganzen Pflanzenstudien, auf den ersten in der freistehenden Studie, wird das Fütterungsexperiment vereinfacht.
Solanum tuberosum var. Kennebec wird durch Knotentransfer in einem einfachen Gewebekulturmedium vermehrt und auf Wunsch auf den Boden übertragen. Die Blätter werden von der Mutterpflanze entfernt und in Petrischalen verlegt, wo der Fütterungstest mit den Larvenstadien von M. sextadurchgeführt wird. Beschädigtes Blattgewebe wird auf die Expression relativ früher Ereignisse in der Signaltransduktion geprüft. Die Genexpressionsanalyse identifizierte befallspezifische Cys2-His2 (C2H2)-Transkriptionsfaktoren, was den Erfolg der Verwendung von freistehenden Blättern in frühen Reaktionsstudien bestätigte. Die Methode ist einfacher durchzuführen als ganze Pflanzenbefall und verbraucht weniger Platz.

Der Blattverbrauch definiert den Erfolg des Protokolls. Gesunde, genau inszenierte Larven sollten sofort nach der Platzierung auf der Blattoberfläche mit der Fütterung beginnen und die Fütterung sollte während der Befallzeit ziemlich konsistent fortgesetzt werden. In Video 1beginnt die Larve an der Spitze sofort nach der Platzierung zu kauen und hält eine konstante Rate während der Fütterung. Dies ist besonders wichtig, wenn frühe Genexpressionsereignisse nach dem Befall ...

Die vorgestellte Methode schafft natürliches Pflanzenfresser schädigendes Pflanzengewebe durch die Anwendung von Manduca sexta Larven auf abgetrennte Blätter von Kartoffeln. Das Pflanzengewebe wird auf die Expression von sechs Transkriptionsfaktor-Homologen geprüft, die an frühen Reaktionen auf Insektenkraut beteiligt sind.

Freistehende Leaf Assays zur Vereinfachung der Genexpressionsstudien in Kartoffeln während des Befalls durch Kauen Voninsekt Manduca sexta

The multitrophic nature of gene expression studies of insect herbivory demands large numbers of biological replicates, creating the need for simpler, more ...

Dieses Protokoll verwendet einen schlanken Ansatz zur Messung der Pflanzengenexpression als Reaktion auf Insektenkraut. Durch die Verwendung von freistehenden Blättern, die in Petrischalen isoliert sind, sind die Insekten während der relativ kurzen Befallzeit leichter anzuwenden und zu überwachen und tragen zu reproduzierbaren Genexpressionsdaten bei. Dieses Protokoll kann an viele Wechselwirkungen zwischen Pflanze und Insekt angepasst werden.wenn Basisbeobachtungen aus ganzen Anlagensystemen berücksichtigt werden. Die Unberechenbarkeit der Insektenfütterung kann eine Herausforderung sein. Daher bietet eine zuverlässige Versorgung mit gut inszenierten Larven und gesunden Pflanzen die besten Erfolgsaussichten.Die Visualisierung, wie gesunde Pflanzen und Insekten auftreten und sich verhalten sollten, ist entscheidend für optimale Ergebnisse, insbesondere für Forscher, die neu auf dem Gebiet der Studie sind. Mit mir wird das Verfahren demonstriert: Frances Perez, Molekularbiologin für die genetische Verbesserung von Obst und Gemüse laboriert. Um Knoten vermehrte GewebeKultur Kartoffelpflanzen vorzubereiten, erhalten Sie zuerst Kennebec Pflanzen aus Explant-Material mit mindestens drei bis vier Knoten.Verwenden Sie eine sterile Klinge, um die Blätter zu entfernen, die die Zweige in der Nähe des Hauptstamms schneiden und etwa zwei Millimeter Astgewebe pro Blatt hinterlassen. Schneiden Sie etwa zwei Millimeter über und unter jedem Knoten, um die Knotenabschnitte von den Stielen zu entfernen und die Knotenschnitte in einem sterilen Gewebekulturgefäß mit Knotentransfermedium mit nach oben zeigendem Ast anzuordnen. Dann übertragen Sie die Knotenschnitte für zwei bis drei Wochen Wachstum bei 24 Grad Celsius und eine 16-stündige helle, achtstündige dunkle Fotoperiode in eine Pflanzengewebekulturkammer.Um die Insekten für die Fütterung vorzubereiten, erhalten Sie das gewünschte Larvenstadium von M.sexta und übertragen Sie eine Larve in jeden Brunnen eines geeigneten Einschließungsgefäßes entsprechend der Größe der Larve. Erstellen Sie Platzierungsvorlagen für jeden Erntezeitpunkt mit fünf stabilen Schalen, die einen Satz von sechs mit weißem Papier ausgekleideten Petrischalen in angemessener Größe halten können. Verfolgen Sie einen Satz von sechs Kreisen mit der entsprechend großen Petrischale auf dem Papier in jedem Fach und beschriften Sie einen Satz von Kreisen, die A, B und C steuern, und die anderen befallenen A, B und C.Dann beschriften Sie jede Platzierungsvorlage mit der entsprechenden Erntezeit.Als Nächstes beschriften Sie ein 1,7 Milliliter Mikrozentrifugenrohr für jeden Kreis in der Platzierungsvorlage, um die Störung, den Pflanzenreplikationsbuchstaben und den Erntezeitpunkt entsprechend zu identifizieren. Wenn alle Rohre beschriftet sind, legen Sie eine sterile Filterpapierscheibe in eine Petrischale pro Schablone und befeuchten Sie die Scheiben mit sterilem Wasser, ohne überschüssigeFlüssigkeit in jeder Schale zu lassen. Legen Sie dann in jeder Platzierungsvorlage ein Gericht in jeden Kreis und platzieren Sie drei Kartoffelpflanzen gleichen Alters und relativer Größe neben jeder Platzierungsvorlage.Um den Befall zu initiieren, verwenden Sie sterile Schere, um die oberen zwei Größe abgestimmten Blätter von jeder Pflanze zu entfernen und legen Sie ein Blatt in der Kontrolle Petrischale und eine in der befallenen Petrischale für jede Pflanze so schnell wie möglich. Wenn alle Blätter platziert sind, verwenden Sie Soft-Touch-Zangen, um mindestens eine Larve so schnell wie möglich in jede befallene Schale zu übertragen und den Timer für die gewünschte Befallzeit einzustellen. Beobachten Sie die Fütterung, um sicherzustellen, dass alle Larven fressen, und ersetzen Sie bei Bedarf alle nicht fütternden Larven.Entfernen Sie alle Larven von allen Blättern am Ende der Befallzeit und starten Sie den Timer für die Ernte. Am Ende jedes Erntezeitpunkts jedes Blatt in die entsprechende Röhre geben und die Röhre sofort in flüssigen Stickstoff geben, um die Blattprobe vor der Lagerung bei minus 80 Grad Celsius bis zur RNA-Isolierung einzufrieren. Gesunde, genau inszenierte Larven sollten unmittelbar nach der Platzierung auf der Blattoberfläche mit der Fütterung beginnen und die Fütterung sollte während des Befallszeitraums ziemlich konsistent fortgesetzt werden.Die Larve am Boden dieses Blattes verbrauchte kein Pflanzenmaterial und ist ein Beispiel für einen erfolglosen Befall. Diese Blätter wurden von zwei Wochen alten, sich vermehrten Gewebekulturpflanzen gelöst und mit unterschiedlichen Raten und Fütterungsstilen für jedes Larvenstadium verzehrt. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wurden vierte Instar-Larven ausgewählt, um die Schäden an den Blättern für reifere Kartoffelpflanzen, die sich den Feldkartoffeln annähern, weiter zu bewerten.In diesen Genexpressionsstudien wurden zwei neue C2H2-Zinkfinger-Transkriptionsfaktoren identifiziert, die robust auf M.sexta-Kräutersindien reagieren und die Verwendung von freistehenden Blättern für Befall-Assays unterstützen. Denken Sie daran, Alter und Größe abgestimmte Blätter zu verwenden und die Larven für jedes Experiment richtig zu inszenieren, da die Homogenität zu reproduzierbareren Daten führt. Blattgewebe kann auf stressinduzierte reaktive Sauerstoffspezies und Jasmonsäurehormonderivate geprüft werden.Ganze Transkriptom, Proteom, oder Mikrobiom Studien können auch auf dem BlattGewebe durchgeführt werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Environment

Umwelt

Quelle: Shi, J. et al. Screening und Identifizierung von RNA-Silencing-Suppressoren aus sekretierten Effektoren pflanzlicher Krankheitserreger. J. Vis. Exp. (2020)Dieses Video demonstriert einen Co-Infiltrationstest zur Identifizierung von Pathogen-Effektorproteinen, die die RNA-Silencing in Nicotiana benthamiana 16c unterdrücken. Ein fluoreszierender Reporter und ein Kandidat-Effektorgen werden über Agrobacterium in Pflanzenblätter abgegeben. Normalerweise degradiert RNA-Silencing die...

Co-Infiltrationstest zur Untersuchung von Erregereffektoren, die die Abschaltung von Pflanzen-RNA unterdrücken

Quelle: Rufián, J. S. et al. Einzelzellanalyse der Expression von Pseudomonas syringae-Genen im Pflanzengewebe. J. Vis. Exp. (2022).Dieses Video demonstriert eine Methode zur Analyse der Genexpression in pflanzenextrahierten, pathogenen Bakterien auf Einzelzellniveau mit einem fluoreszierend markierten Transkriptionsfaktor. Konfokale Bildgebung zeigt Heterogenität in der Expression von Virulenzgenen und hebt die funktionelle Vielfalt innerhalb einer klonalen bakteriellen Population hervor.

Einzelzellanalyse der Genexpression aus pflanzenextrahierenden Krankheitserregern

Agroinfiltration und PVX-Agroinfektion sind routinemäßige funktionelle Assays für die transiente ektopische Expression von Genen in Pflanzen. Diese Methoden sind effiziente Assays in Effektoromik-Strategien (schnelle Resistenz und Avirulenz-Gen-Entdeckung) und entscheidend für die moderne Forschung in der molekularen Pflanzenpathologie. Sie erfüllen die Nachfrage nach robuster Hochdurchsatz-Funktionsanalyse in Anlagen.

Agroinfiltration und PVX Agroinfektion in Kartoffel und Nicotiana benthamiana

Die Quantifizierung des Erregerwachstums ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Charakterisierung verschiedener Immunantworten von Arabidopsis thaliana (im Folgenden: Arabidopsis). Das hier beschriebene Verfahren stellt einen optimierten Spritzeninfiltrationsassay zur Quantifizierung der Pseudomonas syringae pv dar. Maculicola ES4326-Wachstum in adulten Arabidopsis-Blättern.

Bakterielle Blatt Infiltration Assay für Bildende Charakterisierung pflanzlicher Abwehrreaktionen mit Hilfe der<em&gt; Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae</em&gt; Pathosystem

Viele entwicklungsrelevante Gene haben zell- oder gewebespezifische Expressionsmuster. In dieser Arbeit werden LM-RNA-seq-Experimente zur Identifizierung von Genen beschrieben, die an der Grenze zwischen Maisblatt, Blatt, Scheide und in lg1-R-Mutanten im Vergleich zum Wildtyp unterschiedlich exprimiert werden. Die hier diskutierten experimentellen Überlegungen gelten für transkriptomische Analysen anderer Entwicklungsphänomene.

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Dieser Artikel beschreibt neuartige Techniken für mündliche Lieferung doppelsträngige RNA (DsRNA) durch die Leitbündel Gewebe von Pflanzen für die RNA-Interferenz (RNAi) im Phloem Sap Futterinsekten entwickelt.

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Das Ziel des hier vorgestellten Protokolls soll die transkriptomischen Reaktion der Endosphere isoliert Bacillus Mycoides auf Kartoffel Wurzelausscheidungen zu studieren. Diese Methode erleichtert die Identifizierung von wichtigen bakteriellen Gene Pflanze-Mikroben-Interaktionen beteiligt und gilt grundsätzlich für andere Endophyten und Pflanzen, mit geringfügigen Anpassungen.

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Hier stellen wir ein modifiziertes Screening-Verfahren vor, das ausgiebig eingesetzt werden kann, um RNA-Silencing-Suppressoren bei Pflanzenpathogenen schnell zu überprüfen.

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Freistehende Leaf Assays zur Vereinfachung der Genexpressionsstudien in Kartoffeln während des Befalls durch Kauen Voninsekt Manduca sexta (Video) | JoVE Journal

Freistehende Leaf Assays zur Vereinfachung der Genexpressionsstudien in Kartoffeln während des Befalls durch Kauen Voninsekt Manduca sexta

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