Name: Hemmung der Aspergillus Flavus Wachstum und Aflatoxin in transgenen Mais mit dem Ausdruck der α-Amylase-Inhibitor von Lablab Purpureus L. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Lernen Sie ein einfaches Kernel-Screening-Assay zur Analyse von Aspergillus flavus-Wachstum und Aflatoxin-Produktion in transgenem Mais mit antifungalen Proteinen. Diese Methode ermöglicht die zuverlässige Bewertung des Resistenzpotenzials.

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Wir danken David Meints, University of Arkansas für seine Hilfe bei der Entwicklung und Analyse von transgenem Mais während der frühen Generationen. Diese Arbeit erhielt die finanzielle Unterstützung des USDA-ARS CRIS-Projekts 6054-42000-025-00D. Erwähnung von Handelsnamen oder kommerzielle Produkte in diesem Artikel wird ausschließlich zum Zweck der Bereitstellung von spezifischen Informationen und bedeutet keine Empfehlung oder Billigung durch das US Department of Agriculture. USDA-ARS gleicher Beschäftigung Gelegenheit (EEO) Politik Mandate Chancengleichheit für alle Personen und verbietet Diskriminierung in allen Aspekten der Agentur Personalpolitik, Methoden und Erfahrungen.

(1) Plasmid Konstrukte und Mais transformation
<ol><li>PCR verstärkt Lablab AILP mithilfe der Primer 5'-TATCTAGAACTAGTGATTACCATGGCTCC-3 'und 5'-ATACTGCAGGATTGCATGCAGAGTAGTACTG-3"einfügen. Die PCR-Bedingungen umfassen einen anfängliche Denaturierung Schritt bei 98 ° C für 30 s (Schritt 1), gefolgt von Denaturierung bei 98 ° C für 10 s (Schritt 2), Glühen bei 55 ° C für 30 s (Schritt 3), Dehnung bei 72 ° C für 20 s (Schritt 4), 31 Zyklen von Schritt 2 zu Schritt 4 , und eine endgültige Dehnung Schritt bei 72 ° C für 5 min. Klon das PCR-Produkt in einer modifizierten pCAMBIA 1.300 Vektor mit Xbaich und Pstich Restriktionsschnittstellen. Reihenfolge der letzten Pflanze Ziel Vektor, die Ausrichtung und die Sequenz des Gens geklonte AILP im Vektor zu bestätigen.</li>
	<li>Agrobakterium Stamm EHA101 mit dem letzten Vektor-Konstrukt (Abbildung 1) als früher beschriebenen 16zu verwandeln.</li>
	<li>Nutzung umgewandelt Agrobacterium , enthält die letzte Pflanze Ziel Vektor, unreifen Mais (Zea Mays L. Hi-II) Embryonen (die Pflanze Transformation Anlage der Iowa State University durchgeführt) zu verwandeln 16.</li>
	<li>T0 Pflanzen im Gewächshaus (26-29 ° C; 16/8 h Photoperiode ergänzt mit Hochdruck Na-Lampen) und wiederholt werden um T-6 -Generation um Homozygotie für transgene Merkmal zu erreichen zu erhalten.</li>
</ol>2. Spore Keimung assay
<ol><li>Blattproben zu ernten und Lagern bei-80 ° C. Blattproben mit einem Mörser und Stößel mit flüssigem Stickstoff zu mahlen. In 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen 0,5 g wiegen Sie ab, fügen Sie 17 µL Protease-Inhibitor hinzu und legen Sie Rohre auf Eis.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie Rohre für 10 min bei 16.000 X g. 225 µL Pflanzenextrakt zu 0,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen und auf Eis.</li>
	<li>Bereiten Sie in einem 15 mL Zentrifugenröhrchen eine 5 mL-Spore-Aussetzung der Aspergillus Flavus 70 – GFP in 1 %-Kartoffel-Dextrose-Bouillon (w/V). Wirbel und Spore Konzentration 105 Sporen/ml mit einem Zählkammern anpassen. Achtung: A. Flavus produziert Aflatoxine, alle Arbeiten mit dieser Pilz in einem biologischen Sicherheitsschrank durchgeführt werden.</li>
	<li>Brüten Sie in PDB bei 28 ° C bis Kultur 50 % Initiation der Spore Keimung erreicht durch Vorwölbung der Sporen.</li>
	<li>Wirbel und aliquoten 25 µL Spore-Lösung für die 225 µL Pflanze zu extrahieren. 20 Stunden bei 28 ° C mit intermittierenden schütteln inkubieren Sie Proben.</li>
	<li>Aliquoten 25 µL Spore-Lösung auf einem Objektträger und Messen Sie die Länge der Keim Röhren Sporen mit der Digitalkamera-Software. Verwenden Sie ein Minimum von 20 wiederholte Messungen für jede Zeile. Hinweis: In dieser Phase legen Sie alle Kulturen bei 4 ° C Kolonie Wachstumsstop bis bereit zu zählen.</li>
</ol>3. Kernel Screening Assay (KSA)
<ol><li>KSA-Kappen durch Kleben 4 Snap Caps (22 mm) in einer Petrischale 60 x 15 mm zu konstruieren. Lassen Sie Kleber für 48 Stunden trocknen, bevor Sie Kappen verwenden. Jede KSA-Kappe bildet ein Rep (Abbildung 2).</li>
	<li>Sprühen Sie in einem sterilen biologischen Sicherheitsschrank eine quadratischen Bioassay-Fach (24 x 24 cm) mit 70 % Ethanol: H2O (V/V) und lassen Sie an der Luft trocknen. Das Fach sterile Chromatographiepapier hinzufügen. Sprühen Sie 9 KSA-Kappen mit 70 % Ethanol, lassen Sie Luft trocknen, und legen Sie in die Bioassay-Fach.</li>
	<li>Für jeden getesteten transgenen Maislinie 20 unbeschädigt Kerne auswählen und platzieren in einem 50 mL Zentrifugenröhrchen. Fügen Sie 70 % Ethanol und 4 Minuten ruhen lassen. Schütteln Sie Röhren während der Sterilisation. Gießen Sie das Ethanol und spülen Kerne dreimal in sterilen entionisiertem H2O.</li>
	<li>Bereiten Sie eine Spore-Aussetzung der Aspergillus Flavus 70 – GFP17 aus einer 6 Tage alten Kultur auf V8-Medium (5 % V8 Saft, 2 % Agar, pH 5,2) angebaut.<ol>
<li>Fügen Sie 20 mL steriles 0,02 % Triton X-100/entionisiertem H2O (V/V) und Schrott aus Sporen mit einer sterilen Schleife. Aus dem Inokulum und in eine sterile 300 mL-Becherglas pipettieren.</li>
		<li>Vorbereiten eine 5-fold Verdünnung mit 0,02 % Triton x-100, führen Sie dann eine Spore-Zählung mit einem Zählkammern. Verdünnen Sie wieder, wenn notwendig, 100 mL mit einer Konzentration von 4 x 106 Sporen/mL zu erhalten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kerne in einer sterilen 300 mL-Becherglas mit Stir Bar zu platzieren. Das Becherglas Inokulum hinzufügen. Achtung: Inokulum Kerne hinzufügen bewirkt Lösung zu spritzen. Becherglas auf einer Platte unter Rühren 3 Minuten lang. Nach 3 Minuten Inokulum in eine leere Becherglas abgießen.</li>
	<li>Mit einer Pinzette, legen Sie Kerne in die Bioassay-Teller (1 Kernel/GAP). Fügen Sie 30 mL entionisiertem Wasser am unteren Rand jeder Bioassay-Tablett und 7 Tage bei 31 ° C im Dunkeln inkubieren.</li>
	<li>Bereiten Sie Kerne für die Fotografie.<ol>
<li>4 Kerne aus jeder Zeile für mikroskopische Analyse und Fotografie beiseite. Hinweis: Kerne können bei 4 ° C nicht länger als 5 Tage vor dem Abschluss Fotografie gespeichert werden.</li>
		<li>Fotografieren Sie Kerne nach sieben Tagen nach der Impfung mit A. Flavus (Abbildung 3).</li>
		<li>Saubere äußere der Kerne mit einem weichen Tuch und deionisiertes Wasser. Führen Sie Längsprofile der Kerne und sofort Fotografieren unter dem Fluoreszenz-Mikroskop.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kerne für die Analyse vorbereiten.<ol>
<li>Saubere Fassade der verbleibenden Kerne mit einem weichen Tuch und deionisiertes Wasser.</li>
		<li>Platz 4 Kerne, bilden 1 Rep, in einem 15 mL Schraubverschluss Polycarbonat Fläschchen mit 2 Kugeln aus rostfreiem Stahl. Sofort frieren Sie Fläschchen in flüssigem Stickstoff und Store bei-80 ° C bis zu Weiterverarbeitung und Analyse ein.</li>
		<li>-80 ° C Gefrierschrank entnehmen Sie Fläschchen und Mahlen Sie der Kerne in einem Homogenisator bei 1.500 u/min für 3 Minuten. Hinweis: Bewahren Sie Kerne mit flüssigem Stickstoff eingefroren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(4) PCR-Screening von transgener Maiskörner
<ol><li>Verwenden Sie DNA-Isolierung-Kit genomischen DNA (gDNA) isolieren aus pulverisierte Maiskörner infiziert mit A. Flavus gemäß den Anweisungen des Herstellers. 10-15 mg pulverisierte Maiskörner kurz, 280 µL Puffer F, 20 µL Protease und 3 µL Dithiothreitol (DTT) hinzufügen. Brüten und schütteln in einem Thermomixer (56 ° C, 1.200 u/min, 30 min). 10.000 x g für 1 min Zentrifugieren und den klare Überstand auf äquilibriert Spalte übertragen. Inkubation bei Raumtemperatur für 3 min und Zentrifuge bei 700 X g für 1 min zum gDNA eluieren.</li>
	<li>0,8 µL der extrahierten gDNA zum Einrichten einer 20 µL-PCR-Reaktion für jede Probe mit einem PCR-Kit zu nehmen. Folgen Sie Thermocyclings Bedingungen, wie im Protokoll des Herstellers empfohlen. Die PCR-Bedingungen umfassen einen anfängliche Denaturierung Schritt bei 98 ° C für 5 min (Schritt 1) gefolgt von Denaturierung bei 98 ° C für 5 s (Schritt 2), Glühen bei 55 ° C für 5 s (Schritt 3), Dehnung bei 72 ° C für 20 s (Schritt 4), 40 Zyklen von Schritt 2 zu Schritt 4 , und eine endgültige Dehnung Schritt bei 72 ° C für 1 min (Schritt 5).</li>
	<li>Verwenden Sie vorwärts Primer 5'-TATACCACCCCCATCCGTGT-3' und reverse-Primer 5'-AGCTCGGAAGCAAAAGACCA-3 "bestätigen das Vorhandensein von Lablab AILP gen in transgener Maiskörner.</li>
</ol>(5) RNA-Isolierung, cDNA Synthese und semi-quantitativen RT-PCR
<ol><li>Nehmen Sie homogenisiert A. Flavus infiziert Maiskörner zuvor gespeichert bei-80 ° C für die RNA-Extraktion. Mit einem total RNA Isolierungskit laut Protokoll des Herstellers aber mit geringfügigen Änderung18RNA extrahieren. Mischen Sie nach Zugabe von 50 mg Pulver homogenisiert Maiskorn in dem Extraktionspuffer es gut (ohne Heizungsjobstep) mit einer 1 mL Pipettieren Spitze und lassen Sie es auf Eis für 5-6 Minuten, bevor Sie fortfahren Folgeschritte wie im Protokoll des Herstellers beschrieben.</li>
	<li>Bereiten Sie mithilfe eines cDNA Synthese Kits nach des Herstellers Protokoll 18cDNA.</li>
	<li>Verwenden Sie 0,5 µL unverdünnte cDNA pro PCR-Reaktion für semi-quantitativen RT-PCR als früher beschriebenen18. Verwenden Sie vorwärts und rückwärts Primer qAILP-F 5'-TCCCAACAAGGCAACTACTG-3' und qAILP-R 5' - CGGTGTCGAAGAGACCTAGATA - 3' bzw. zu erkennen Lablab AILP Genexpression und forward und reverse Primer qRib-F 5ʹ-GGCTTGGCTTAAAGGAAGGT-3ʹ und qRib-R 5ʹ-TCAGTCCAACTTCCAGAATGG-3ʹ bzw. für den Ausdruck von Mais ribosomale Strukturgen (Rib), GRMZM2G02483819 als Zimmermädchen gen.</li>
</ol>(6) GLP Quantifizierung
<ol><li>Bereiten Sie 50 mL 0,2 M monobasic Natriumphosphat (NaH2PO4) und 0,2 M Diabas-Natriumphosphat (Na2HPO4·7H2O) in entionisiertem H2O.</li>
	<li>100 mL Phosphatpuffer pH 7,0 Sorenson bilden. Für pH 7,0 hinzufügen von 19,5 mL NaH2PO4 Lager, 30,5 mL NaHPO4·7H2O Lager und 50 mL entionisiertem H2O.</li>
	<li>25 mg Kernel Mahlgut (Frischgewicht, FW) wiegen Sie ab und in einen 1,0 mL Microcentrifuge Schlauch. Hinzu kommen die Zentrifugenröhrchen und Wirbel für 30 500 µL Phosphatpuffer s.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie Proben für 15 Minuten bei 16.000 X g. Pipettieren 100 µL Überstand in ein schwarz 96-well-Platte. Lesen Sie die Proben mit einem Fluorometer (Erregung 485 nm, Emission 528 nm).</li>
</ol>7. total Aflatoxin-Analyse
<ol><li>Verarbeitung und Aflatoxin Probengewinnung<ol>
<li>Trocken-Kernel Proben in einem Umluft-Ofen für 2 Tage bei 60 ° C. Wiegen Sie Proben und legen Sie in ein 50-mL-Erlenmeyerkolben mit einem Glasstopfen.</li>
		<li>Verleihen Sie in einer Dampfhaube 25 mL Methylenchlorid jedem Kolben. Achtung: Methylenchlorid ist sehr volatil und gilt als gefährlicher (reizend, karzinogen). Latex weder Nitril-Handschuhe sind sicher für die Arbeit mit Methylenchlorid. Verwenden Sie verbesserte organische Lösungsmittel beständig PolyVinylAlcohol Handschuhe.</li>
		<li>Schütteln Sie Proben für 30 min auf ein Handgelenk Aktion Shaker. Gießen Sie nach 30 min langsam den Extrakt durch eine geriffelte Filterpapier Kreis in einer 80-mL-Becherglas. Lassen Sie die Becher über Nacht trocknen unter einem Abzug.</li>
		<li>Am nächsten Tag Spritzen Methylenchlorid (ca. 5 mL) um die innere Felge von der trockenen Becher, wirbeln herum und gießen Sie in 2 Dram Glasfläschchen. Lassen Sie Fläschchen öffnen, um in einer Abzugshaube über Nacht trocknen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aflatoxin-Analyse<ol>
<li>4,0 mL 80 % Methanol hinzufügen: entionisiertem H2O (V/V), Fläschchen.</li>
		<li>Verwendung eines Aflatoxin Extraktion Kit Filtern reinigen Methanol-Lösung mit der angegebenen Spalte. Analysieren Sie total Aflatoxin Ebenen mit einem Fluorometer gemäß den Anweisungen des Herstellers.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt.

Ertragsverluste bei landwirtschaftlichen Nutzpflanzen durch Erreger und Schädlinge ist ein globales Problem-20. Derzeit, Anwendung von synthetischen Fungiziden und Pestiziden ist das vorherrschende Mittel für steuernde Anlage Krankheitserreger und Schädlinge, aber passives Toxizität von diesen Biochemikalien in Lebens- und Futtermitteln kann ernsthafte Bedrohung für die menschliche und tierische Gesundheit21darstellen. Angesichts der wirtschaftlichen Bedeutung der Mais als ...

Mykotoxinbelastungen durch die Pilz-Gattungen, Aspergillus, Fusarium, Penicilliumund Alternaria ist ein großes Problem der Lebensmittel und Futtermittel angebauten weltweit1,2,3. Unter diesen phytopathogenen Pilzen hat Aspergillus die höchsten negative Auswirkungen auf die Ernte Wert und die Gesundheit von Mensch und Tier. Aspergillus flavus (A. Flavus) ist eine opportunistische Pflanze-Erreger, die infiziert Öl reichen Ernten wie Mais, Baumwollsaat und Erdnuss und produziert die potente Karzinogene, Aflatoxine, sowie zahlreiche giftige sekundäre Pflanzenstoffe (SMs). Mais ist ein wichtiges Nahrungsmittel und Futtermittel weltweit angebaut und ist sehr anfällig für Verunreinigungen durch A. Flavus. Die wirtschaftliche Auswirkungen einer Aflatoxinkontamination auf verliert und Minderwert bei Mais kann so viel wie $ 686,6 Millionen/Jahr in den USA2 mit prognostizierten Veränderungen des globalen Klimas, die Auswirkungen von Aflatoxinen kann dazu führen, dass größere wirtschaftliche Verluste in Mais mit Schätzungen so hoch wie $ 1,68 Milliarden/Jahr in die nahe Zukunft2. Angesichts der wirtschaftlichen und gesundheitlichen Beeinträchtigungen von Aflatoxinen in Mensch und Tier, möglicherweise vor der Ernte Aflatoxin Kontrolle im Mais der effizienteste Weg zur Verhinderung von Aflatoxinkontamination in Lebensmitteln und Futtermitteln.
Die großen vor der Ernte Kontrollansatz für Aflatoxin Widerstand in Mais, der in den letzten Jahrzehnten eingesetzt hat ist in erster Linie durch Züchtung, die eine erhebliche Menge an Zeit4erfordert. Vor kurzem hatte Biocontrol einige Erfolge bei der Reduzierung der Aflatoxin in groß angelegte Feld Anwendungen5,6. Neben Biocontrol hatte Anwendung modernster molekularer Tools wie z. B. "Host induzierte Gen-Silencing" (HIGS) durch RNAi und transgene Ausdruck des Widerstands-assoziierte Proteine einige Erfolge bei der Reduzierung von A. Flavus Wachstum und aflatoxin Produktion in kleinem Maßstab Labor- und Studien. Diese Ansätze werden derzeit neben der Identifizierung von neuen potenziellen A. Flavus gen Zielen für zukünftige Manipulation optimiert.
Neben Gene, die Mykotoxinproduktion als potentielle Ziele von transgenen Kontrollstrategien direkt beteiligt sind, haben Pilze Amylasen gezeigt worden, um eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Pathogenese und Mykotoxin-Erfolgsproduktion in frühen Phasen der Host-Pflanze-Infektion. Ein paar Beispiele Pythium Pleroticum (kausaler Agent Ingwer Rhizom Fäulnis), Fusarium Solani (kausaler Agent der Blumenkohl willst), wo positive Korrelationen zwischen Pathogenität und α-Amylase Expression und Aktivität beobachtet 7,8. Hemmung der α-Amylase-Aktivität durch gen-Knockout oder Knockdown Ansätze wirkt sich negativ auf Pilz Wachstum und Toxin-Produktion. Ein α-Amylase-Ko-Mutante von A. Flavus konnte Aflatoxine wenn auf Stärke Substrat oder entkeimten Maiskörner9gewachsen zu produzieren. In Fusarium Verticillioides , keine α-Amylase Ko-Belastung während der Infektion von Maiskörnern10Fumonisin B1 (Mykotoxine) produzieren. In einer neueren Studie Gilbert Et Al. (2018) gezeigt, dass ein RNAi-basierten Knock down- A. Flavus α-Amylase Ausdrucksformen durch HIGS A. Flavus Wachstum und Aflatoxin Produktion während Maiskorn Infektion11 deutlich reduziert .
Spezifische Inhibitoren der α-Amylase-Aktivität haben auch ähnliche Ergebnisse produziert, wie Down-Regulierung der α-Amylase Ausdruck entnommen. Der erste Bericht über die Rolle der ein α-Amylase-Inhibitor in Pilzresistenz kamen aus der Isolierung und Charakterisierung von einer 14-kDa-Trypsin-α-Amylase-Inhibitor von Maislinien resistent gegen A. Flavus12. Weitere screening von mehreren hundert Pflanzenarten Fakhoury und Woloshuk führten zur Identifizierung eines 36-kDa α-Amylase-Inhibitor-ähnlichen Proteins (AILP) aus den Samen der Hyazinthe Bohnen, Lablab Purpureus L.13. Der Peptidsequenz AILP glich Lektine aus der Familie der Lektine – Arcelin – α-Amylase-Inhibitor berichtet gemeinsam Bohne14,15. Gereinigten AILP wird keine hemmende Aktivität gegenüber Säugetieren Trypsin und weitere in-vitro Charakterisierung zeigte deutliche Hemmung der A. Flavus Wachstum und conidial Keimung13aufweisen. Die Berichte hier eindeutig zeigt α-Amylase kann dienen als Target in der Steuerung Ansätze beschränken, Krankheitserreger oder Schädlinge, die abhängig von Stärke Mobilisierung (durch α-Amylase-Aktivität) und Erwerb der lösliche Zucker als Energiequelle während ihrer Pathogene Interaktion mit Wirtspflanzen.
Alpha-Amylase ist bekannt, dass kritische A. Flavus Pathogenität9,10,11, und angesichts der Bedeutung der AILP als ein potenter Anti-A. Flavus Agent (α-Amylase Hemmung/Antigrowth)13, Wir generierten transgene Maispflanzen mit dem Ausdruck Lablab AILP gen unter der konstitutiven CaMV-35 s-Promoter. Ziel war es zu untersuchen, ob heterologen Expression von dieser α-Amylase-Inhibitor in Mais gegen A. Flavus Pathogenese und Aflatoxin Produktion während Maiskorn Infektion wirksam ist. Unsere Ergebnisse zeigen, dass transgene Maiskörner mit dem Ausdruck AILP deutlich A. Flavus Wachstum und Aflatoxin Produktion während der Kernel-Infektion reduziert.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Caisson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amazing Marine Goop</td><td>Eclectic Products</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch CFX96 Echtzeit-System</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp; Falcon Gewebekulturschalen, 60 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772F</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp; 5424 Mikrozentrifuge</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Erlenmeyerkolben mit Stopfen, 50 mL</td><td>Ace Glass</td><td>6999-10</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FluoroQuant Afla</td><td>Romer Labs</td><td>COKFA1010</td><td></td></tr><tr><td>geriffelte qualitative Filterpapierkreise, 15 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-790-14E</td><td></td></tr><tr><td>Force Air Oven</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FQ-Reader</td><td>Romer Labs</td><td>EQFFM3010</td><td></td></tr><tr><td>Geno/Grinder 2010</td><td>OPS Diagnostics</td><td>SP 2010-115</td><td></td></tr><tr><td>Verbesserte PolyVinylAlkohol Organic Solvent Resistant Handschuhe</td><td>Ansell</td><td>012-15-554</td><td></td></tr><tr><td>Innova 44 Inkubator Shaker</td><td>Brunswick Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iScript cDNA Synthesis Kit</td><td>Bio-Rad</td><td>1708890</td><td></td></tr><tr><td>flüssiger Stickstoff</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Low Form Griffin Becher, 100 mL</td><td>DKW Life Sciences</td><td>14000-100</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methylenchlorid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nexttec 1-stufiges DNA-Isolationskit für Pflanzen</td><td>Nexttec</td><td>47N</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse E600 Mikroskop mit Nikon DS-Qi1 Kamera</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon SMZ25 Stereomikroskop mit C-HGFI Episcopic Illuminator und Andor Zyla 4.2 sCMOS-Kamera</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nunc Square BioAssay Dishes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>240835</td><td></td></tr><tr><td>Phire Plant Direct PCR Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F130WH</td><td></td></tr><tr><td>Polycarbonat-Fläschchen, 15 ml</td><td>OPS Diagnostics</td><td>PCRV 15-100-23</td><td></td></tr><tr><td>Kartoffel Dextrose-Bouillon-Schnappverschluss</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 22 mm</td><td>DKW Life Sciences</td><td>242612</td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat zweibasisches Heptahydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat monobasisches</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectrum Plant Total RNA Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>STRN50</td><td></td></tr><tr><td>Edelstahl-Schleifkugeln, 3/8''</td><td>OPS Diagnostics</td><td>GBSS 375-1000-02</td><td></td></tr><tr><td>Rührplatte</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Synergy 4 Fluorometer</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T100 Thermocycler</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-9284</td><td></td></tr><tr><td>V8 Saft</td><td>Campbell's</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Whatman Qualitative Grade Plain Sheets, Klasse 3</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-820P</td><td></td></tr><tr><td>Schüttler am Handgelenk</td><td>Burrell Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

hemmung der aspergillus flavus wachstum und aflatoxin in transgenen mais mit dem ausdruck der α-amylase-inhibitor von lablab purpureus l.

Inhibition of Aspergillus flavus Growth and Aflatoxin Production in Transgenic Maize Expressing the &#945;-amylase Inhibitor from Lablab purpureus L.

Aflatoxinkontamination in Nahrungs-und Futtermitteln ist eine große Herausforderung weltweit. Aflatoxine, produziert durch den Pilz Aspergillus Flavus (A. Flavus) sind potente Karzinogene, die Ernte Wert in Mais und andere Öl reiche Ernten wie Erdnuss neben posieren ernsthafte Bedrohung für die menschliche und tierische Gesundheit erheblich reduzieren. Unterschiedliche Ansätze, einschließlich der klassischen Züchtung, transgene Ausdruck von Widerstand verbunden sind Proteine und RNA-Interferenz (RNAi)-basierten Host-induzierte Gen-silencing von kritischen A. Flavus gen Ziele werden ausgewertet, um zu erhöhen Aflatoxin Widerstand in anfälligen Pflanzen. Frühere Studien haben gezeigt, dass eine wichtige Rolle in der Pathogenese und Aflatoxin Produktion A. Flavus , schlägt dieses Gen/Enzym α-Amylase ist ein potenzielles Ziel, A. Flavus Wachstum und Aflatoxin-Produktion zu reduzieren. In diesem Zusammenhang wurde die aktuelle Studie durchgeführt, um heterologen Expression (unter Kontrolle der konstitutiven CaMV 35 s -Promoter) eines Lablab Purpureus L. α-Amylase-Inhibitor-ähnlichen Proteins (AILP) im Mais gegen A. Flavusbewerten. AILP ist ein 36-kDa-Protein, das ist ein kompetitiver Inhibitor des Enzyms A. Flavus α-Amylase und gehört zur Familie der Lektine – Arcelin – α-Amylase-Inhibitor Protein gemeinsam Bohne. In-vitro-Studien vor der aktuellen Arbeit hatte die Rolle des AILP bei der Hemmung von A. Flavus α-Amylase-Aktivität und Pilzwachstum gezeigt. Pilzwachstum und Aflatoxin-Produktion in Reife Kerne wurden mit GFP exprimierenden A. Flavus Belastung in Echtzeit überwacht. Dieser Kernel screening Assay (KSA) ist sehr einfach einzurichten und bietet zuverlässige und reproduzierbare Daten auf Infektion und das Ausmaß der Ausbreitung, die quantifiziert werden konnte zur Beurteilung von Genetik und transgenen Linien. Die Fluoreszenz von den Strapazen der GFP ist eng korreliert, pilzartige Wachstum und durch Verlängerung, es ist gut für Aflatoxin-Werte korrelierten.  Das Ziel der aktuellen Arbeit war, dieses Vorwissen in ein kommerziell wichtigen Getreide wie Mais, Aflatoxin Widerstand erhöhen zu implementieren. Unsere Ergebnisse zeigen eine Ermäßigung von 35 % – 72 % A. Flavus Anstieg AILP exprimierenden transgener Maiskörner, die wiederum in einer 62 bis 88 % Verringerung Aflatoxin übersetzt.

Mais-Transformation und molekulare Screening von transgenen Pflanzen
Unreife Embryonen Hi-II-Maislinien verwandelten sich mit Agrobacterium Tumefaciens EHA101 Stamm, enthält die letzte Pflanze Ziel Vektor mit dem Ausdruck der Lablab Purpureus AILP gen unter der Kontrolle des CaMV- 35 s Promotor. Fünf unabhängig transformierte Maislinien wurden an die T6-Generation für nachfolg...

Hier präsentieren wir ein Protokoll um Aspergillus Flavus Wachstum und Aflatoxin in Maiskörner mit dem Ausdruck einer antimykotischen Proteins zu analysieren.  Mit GFP exprimierenden A. Flavus Belastung überwacht wir die Infektion und die Ausbreitung des Pilzes in Reife Kerne in Echtzeit. Der Test ist schnell, zuverlässig und reproduzierbar.

Hemmung der Aspergillus Flavus Wachstum und Aflatoxin in transgenen Mais mit dem Ausdruck der α-Amylase-Inhibitor von Lablab Purpureus L.

Aflatoxin contamination in food and feed crops is a major challenge worldwide. Aflatoxins, produced by the fungus Aspergillus flavus (A. flavus) are ...

Hier präsentieren wir einen einfachen Kernel-Screening-Test, um Aspergillus flavus Wachstum und Aflatoxin-Produktion in Maiskernen zu analysieren, die ein antimykotisches Protein exdrücken. Mit einem grünen fluoreszierenden Protein, das aspergillus flavus Stamm exdrückt, überwachen wir die Infektion und Ausbreitung des Pilzes in reifen Kernen in Echtzeit. Dieser einfache Test bietet ein zuverlässiges Mittel zur Bewertung der Fähigkeit des Maiskerns, aspergillus flavus Infektion und Aflatoxin-Produktion zu widerstehen.Die Ergebnisse dieses Labor-Assays, der unter kontrollierten Bedingungen an ausgereiften Kernen durchgeführt wird, korrelieren gut mit den Ergebnissen einer Infektion unter Feldbedingungen. Demonstriert wird das Verfahren von Dr.Rajtilak Majumdar, einem Postdoc aus unserem Labor, zusammen mit Christine Sickler und David Ambrosio, Bio-Technikern auch aus unserem Labor. Zu Beginn kleben Sie 20 zwei mm Fangkappen in eine Petrischale, um KSA-Kappen zu erstellen.Lassen Sie den Kleber für 48 Stunden trocknen, bevor Sie die Kappen verwenden. In einem biologischen Sicherheitsschrank sprühen Sie eine quadratische Bioassayschale mit 70% Ethanol in Wasser. Lassen Sie die Schalenluft trocknen.Steriles Chromatographiepapier in das trockene Fach geben. Neun der KSA-Kappen mit 70% Ethanol besprühen und an der Luft trocknen lassen. Dann legen Sie die Kappen auf das Bioassay-Tablett.Wählen Sie für jede getestete transgene Maislinie 20 unbeschädigte Kerne aus und legen Sie sie in ein 50 ml Zentrifugenrohr. Wählen Sie mit einem Tisch-Stereomikroskop nur unbeschädigte Kerne für den Test aus. Beschädigte Kerne sind anfälliger für Aspergillus-Angriffe und produzieren mehr Aflatoxin, wodurch die Ergebnisse verzerrt werden und nicht die wahren antimykotischen oder antimikrobiellen Eigenschaften der Sorte darstellen.Fügen Sie 70% Ethanol in jede Röhre. Lassen Sie die Kerne vier Minuten lang sterilisieren und gelegentlich sanft schütteln. Danach das Ethanol vorsichtig abgießen und die Kerne in sterilem entionisiertem Wasser dreimal sanft abspülen.Erhalten Sie eine sechstägige Kultur von Aspergillus flavus Fleck 70 aus, die GFP ausdrückt, die auf V8-Medium angebaut werden. 20 ml steriles 0,02%Triton X-100 in entionisiertem Wasser hinzufügen. Und verwenden Sie eine sterile Schleife, um die Sporen abzukratzen.Pipette aus dem Inokulum und übertragen Sie es in ein 300 ml steriles Becherglas. Bereiten Sie eine fünffache Verdünnung mit 0,02%Triton X-100 vor und verwenden Sie ein Hämozytometer, um eine Sporenzahl durchzuführen. Bei Bedarf erneut verdünnen, um 100 ml mit einer Konzentration von vier Millionen Sporen pro ml zu erhalten.Gießen Sie das Inokulum in ein leeres Becherglas. Die Kerne in einen sterilen 300 ml Becher mit Rührstange geben und drei Minuten rühren. Mit Zangen übertragen Sie die Kerne auf die Bioassay-Schale und stellen sicher, dass nur ein Kernel in jede Kappe platziert wird.Fügen Sie 30 ml entionisiertes Wasser auf den Boden jedes Bioassay-Tabletts. Und sieben Tage lang bei 31 Grad Celsius brüten. Nach sieben Tagen Impfung mit A.flavus, fotografieren Sie vier Kerne, die für mikroskopische Analyse und Fotografie bestimmt wurden.Verwenden Sie dann ein Weichgewebe und entionisiertes Wasser, um das Äußere der Kerne zu reinigen. Führen Sie Längsschnitte von Kernen durch und fotografieren Sie sofort unter dem Fluoreszenzmikroskop. Um die Kerne für die Analyse vorzubereiten, reinigen Sie die Außenseite der verbleibenden Kerne mit einem Weichgewebe und entionisiertem Wasser.Legen Sie vier Kerne, die einen Rep bilden, in eine 15 ml Schraubverschluss-Polycarbonat-Durchstechflasche mit zwei Edelstahlkugeln. Die Fläschchen sofort in flüssigem Stickstoff einfrieren und bei 80 Grad Celsius lagern, bis sie mit der weiteren Verarbeitung und Analyse fertig sind. Wenn Sie fertig sind, entfernen Sie die Kerne aus dem Gefrierschrank und verwenden Sie einen Homogenisator, um sie drei Minuten lang bei 1500 Umdrehungen pro Minute zu mahlen.Verwenden Sie die gleichen Bodenmaterialien für die GFP-Analyse, die Aflatoxin-Bestimmung und die molekulare Analyse, so dass alle Werte repräsentativ für die Proben sind. Während mindestens drei Replikationen empfohlen werden, ist mehr immer besser, abhängig von der Verfügbarkeit von qualitativ hochwertigen Kerneln. In dieser Studie werden unreife Embryonen von Mais-HI-II-Linien mit dem Agrobacterium tumefaciens EHA101-Stamm transformiert, der den endgültigen Pflanzenzielvektor enthält, der das Lablab purpureus AILP-Gen unter der Kontrolle des 35S-Promotors aus dem Blumenkohl-Mosaikvirus ausdrückt.Die PCR-Verstärkung des Ziel-AILP-Gens zeigte ein 548 bp Amplikon, das nur in den transgenen Maislinien beobachtet wurde. Das AILP-Gen zeigte Expression in den transgenen Linien, während in den Kontrollpflanzen keine AILP-Expression beobachtet wurde. Keimsporen im Frühstadium sind 20 Stunden lang rohen Blattextrakten aus jungen transgenen Maispflanzen ausgesetzt.Die hohe Gesamtlänge von Sporen, die transgenen Blattextrakten ausgesetzt sind, zeigen eine Reduktion von 58 bis 80 % im Vergleich zur Negativkontrolle. Der verwendete A.flavus-Stamm enthält einen GFP-Reporter, der die Überwachung und Quantifizierung des Pilzwachstums in Echtzeit ermöglicht. In transgenen AILP-Kernen wird eine signifikante Reduktion der GFP-Fluoreszenz im Vergleich zur isogenen Negativkontrolle beobachtet.Bei den AILP-Linien vier und fünf, 69 % bzw. 72 % ist ein deutlicher Rückgang des Pilzwachstums zu verzeichnen. Die anderen Zeilen zeigen eine Reduktion von 35 bis 60% im Vergleich zu den Kontrollkernen. In den AILP-Kernen wurde eine Reduktion des Aflatoxingehalts um 62 bis 88 % im Vergleich zur Kontrolle beobachtet.Linie 4 hat mit 486 ng pro g den niedrigsten Aflatoxingehalt, gefolgt von anderen Zeilen, die in den Kernen einen Gehalt zwischen 640 und 1498 ng pro g hatten. Nach diesem Verfahren können zusätzliche Methoden durchgeführt werden, wie z. B. die Verwendung eines Fluorometers zur Quantifizierung von GFP und als Pilzwachstum. Immunbasierte kommerzielle Kits oder HPLC oder EPLC können verwendet werden, um Aflatoxin-Quantifizierung durchzuführen.Die Verfügbarkeit von KSA bietet eine schnelle und einfache Möglichkeit, die Beständigkeit gegen Aflatoxinkontamination zu bestimmen. Die verschiedenen Maiszuchtlinien lassen sich mit dieser Technik schnell beurteilen. Während der Kernel-Screening-Test nicht gefährlich ist, sollte der Bediener sich vor der Exposition gegenüber Aspergillus flavus Sporen schützen, geeignete Schutzausrüstung verwenden.

inhibition-aspergillus-flavus-growth-aflatoxin-production-transgenic

Research

Forschung

JoVE Journal

Environment

Umwelt

Die Verwüstung von Getreide durch Samen-Pilzresistenz hat zahlreiche Forschungsarbeiten zum besseren Verständnis Pflanze-Pathogen-Interaktionen dazu aufgefordert werden. Um Saatgut-Pilz-Interaktionen in einem Labor untersuchen, entwickelten wir eine robuste Methode zur Quantifizierung von Pilz-Reproduktion, Biomasse und Mykotoxinkontamination mit Kernel Bioassays.

Die Quantifizierung der Pilzbesiedlung, Sporogenese und Produktion von Mykotoxinen Kernel-Bioassays

Die Verwendung einer Nadelinjektionsmethode zur Inokulation von Mais- und Teosintenpflanzen mit dem biotrophen Erreger Ustilago maydis wird beschrieben.  Die Nadelinjektionsimpfung erleichtert die kontrollierte Abgabe des Pilzerregers zwischen den Pflanzenblättern, wo der Erreger durch die Bildung von Appresorie in die Pflanze gelangt. Diese Methode ist hocheffizient und ermöglicht reproduzierbare Impfungen mit U. maydis.

Eine schnelle und effiziente Methode zur Beurteilung der Pathogenität von Ustilago-Maydis auf Mais- und Teosintenlinien

Wir zeigen, ein Verfahren zur Analyse von Aflatoxinen und die Transgen-Expression in Erdnusskerne, die die RNA-Interferenz-Signale zum Dämpfen Aflatoxin-Synthesegene in dem Pilz Aspergillus flavus enthalten. RNAi-vermittelte Kontrolle von Mykotoxinen in Pflanzen ist bisher nicht berichtet worden.

RNAi-vermittelten Kontrolle der Aflatoxine in Peanut: Methode, um Mykotoxinproduktion und Transgenexpression in der Erdnuss-Analyse /<em&gt; Aspergillus</em&gt; Pathosystem

Wir beschreiben eine robuste Strategie Gen - Ersatz zu genetisch den Pilz Sauereien manipulieren Ustilago maydis. Dieses Protokoll wird erklärt, wie Deletionsmutanten zu erzeugen Infektion Phänotypen zu untersuchen. Es kann erweitert werden , um Gene in jeder gewünschten Weise zu modifizieren, beispielsweise durch eine Sequenz Hinzufügen eines fluoreszierenden Protein - Tag kodiert.

Genetische Manipulation der Pflanze Pathogen<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Zu Pilzbiologie und Pflanzen Mikroben-Interaktionen Studie

Diese Arbeit beschreibt das Klonen einer Ustilago Maydis Trojanisches Pferd Belastung für die in-situ Lieferung von sekretierten Proteinen, Mais in drei verschiedene Arten von Mais Gewebe.

Mit Ustilago Maydis als ein Trojanisches Pferd für In Situ Lieferung von Mais Proteine

Pflanzenmorphogene können verwendet werden, um die genetische Transformation widerspenstiger Genotypen zu verbessern. Beschrieben wird hier ein Agrobacterium-vermittelte genetische Transformation (QuickCorn) Protokoll für drei wichtige öffentliche Mais-Inzuchtlinien.

Agrobacterium- Vermitteltune unreife Embryo-Transformation von widerspenstigen Mais Inzuchtlinien mit morphogenen Genen

Ein Agrobacterium-basiertes Injektionsprotokoll (Agroinjektion) wird für die Impfung von Fuchsschwanzmosaikvirus und Zuckerrohrmosaikvirusclone in Maissämlinge vorgestellt. Die Impfung auf diese Weise führt zu einer Virusinfektion, einem virusinduzierten Gen-Silencing von Markergenen und einer viralen Überexpression von GFP.

Direkte Agroinokulation von Maissämlingen durch Injektion mit rekombinanten Foxtail Mosaic Virus und Sugarcane Mosaic Virus Infectious Clones

Dieses Manuskript beschreibt ein optimiertes Inokulationsprotokoll, das abgelöste Maisblatthüllen für reproduzierbare zytologische, physiologische und molekulare Studien von Maisinteraktionen mit pilzlichen Pflanzenpathogenen verwendet. Die Blattscheiden erleichtern die Echtzeitbeobachtung zellulärer Interaktionen zwischen der lebenden Pflanze und dem Pilz in nicht fixiertem Gewebe.

Abgetrennte Maisscheiden für die Lebendzell-Bildgebung der Infektion durch pilzliche Blattmais-Erreger

Um die Unterdrückung der Population von Aedes aegypti mit dem RIDL-® (Freisetzung von Insekten, die ein dominantes Lethal-System tragen) zu erreichen, muss eine große Anzahl männlicher Mücken freigesetzt werden. Dies erfordert den Einsatz von Techniken und Technologien für die Massenaufzucht, um zuverlässige Systeme bereitzustellen, um die maximale Anzahl hochwertiger männlicher Mücken zu erhalten.

Massenproduktion von gentechnisch veränderten Aedes aegypti für Feldfreisetzungen in Brasilien

Mikroplatten-basierten Verfahren werden für die farbmetrische oder fluorimetrische Analyse der extrazellulären Enzymaktivität beschrieben. Diese Verfahren ermöglichen die Schnelltest an einer solchen Tätigkeit in großer Zahl von Umweltproben in einem überschaubaren Zeitrahmen.

Bestimmung mikrobieller extrazelluläre Enzymaktivität in Wasser, Böden und Sedimente mit hohem Durchsatz Mikrotiterplatten-Assays

Lernen Sie ein einfaches Kernel-Screening-Assay zur Analyse von Aspergillus flavus-Wachstum und Aflatoxin-Produktion in transgenem Mais mit antifungalen Proteinen. Diese Methode ermöglicht die zuverlässige Bewertung des Resistenzpotenzials.

Hemmung der Aspergillus Flavus Wachstum und Aflatoxin in transgenen Mais mit dem Ausdruck der α-Amylase-Inhibitor von Lablab Purpureus L. (Video) | JoVE Journal

Hemmung der Aspergillus Flavus Wachstum und Aflatoxin in transgenen Mais mit dem Ausdruck der α-Amylase-Inhibitor von Lablab Purpureus L.

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