Name: Vorbereitung von Gushukang (GSK) Granulat en for In Vivo und In Vitro Experiments (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 16 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung von Gushukang-Granulatlösungen für In-Vivo-Studien und serumhaltige Präparate für In-Vitro-Experimente. Diese kostengünstige Methode ermöglicht reproduzierbare pharmakologische Untersuchungen.

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Diese Studie wurde durch Stipendien der National Natural Science Foundation of China (81804116, 81673991, 81770107, 81603643 und 81330085), das Programm für Innovatives Team, Ministerium für Wissenschaft und Technologie chinas (2015RA4002 bis WYJ), das Programm für Innovatives Team, Bildungsministerium Chinas (IRT1270 bis WYJ), Shanghai TCM Medical Center of Chronic Disease (2017ZZ01010 bis WYJ), Dreijahre Aktion zur Beschleunigung der Entwicklung des Plans für traditionelle chinesische Medizin (ZY(2018-2020)-CCCX-3003 bis WYJ) und nationalen wichtigsten Forschungsentwicklungsprojekte (2018YFC1704302).

Alle experimentellen Verfahren wurden mit Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee der Shanghai University of TCM (SZY201604005) durchgeführt.
1. Vorbereitung und Verwaltung der GSK-Arbeitslösung
<ol><li>Berechnen Sie die äquivalenten Dosen von GSK-Granulat für die Maus.<ol>
<li>Berechnen Sie die Körperoberfläche basierend auf der Meeh-Rubner-Gleichung15: Körperoberfläche = K x (Körpergewicht2/3)/1000, wobei die K-Werte 10,6 für den Menschen und 9,1 für die Maus sind. Geht man von einem menschlichen Körpergewicht von 70 kg aus, dann die Körperoberfläche des Menschen (m2) = 10,6 x (702/3)/1000 = 1,8 m2. Bei einem Mauskörpergewicht von 20 g (0,02 kg; z.B. 1 Monat alt, weiblich, C57/BL6), dann Mauskörperoberfläche (m2) = 9,1 x (0,022/3)/1000 = 0,0067 m2.</li>
		<li>Berechnen Sie auf der Grundlage der berechneten Körperoberfläche das Körpertransformationsverhältnis für Mensch und Maus. Mensch: 70 kg/1,8 m2 = 39. Maus: 0,02 kg/0,0067 m2 = 3. GSK-Granulat = 20 g/70 kg x 39/3 = 3,72 g/kg bei 4 g/kg.</li>
		<li>Berechnen Sie auf Der Grundlage eines Körpergewichts von 20 g pro Maus die äquivalente Dosierung für die Maus: 4 g/kg x 0,02 kg = 0,08 g.</li>
		<li>Berechnen Sie drei Äquivalentdosen von GSK-Granulat auf der Grundlage von 20 Mäusen pro Gruppe und einer Intervention von 3 Monaten (90 Tage): (1) GSKL (OVX + niedrig dosierte GSK-Granulat [2 g/kg/Tag]): 0,04 g Maus/Tag x 20 Mäuse x 90 Tage = 72 g. (2) GSKM (OVX + mitteldosiertes GSK-Granulat [4 g/kg/ Tag]): 0,08 g Maus/Tag x 20 Mäuse x 90 Tage = 144 g. (3) GSKH (OVX + hochdosiertes GSK-Granulat [8 g/kg/Tag]): 0,12 g Maus/Tag x 20 Mäuse x 90 Tage = 216 g. HINWEIS: Bereiten Sie zusätzliche 20 % des GSK-Granulats in der Praxis vor, um den Verlust auszugleichen.</li>
	</ol></li>
	<li>Berechnen Sie das Volumen des GSK-Granulats pro Maus basierend auf dem Körpergewicht15: z.B. Volumen (V) = 0,24 ml/Maus/Tag. HINWEIS: Das Volumen für die intragastrische Verabreichung für die Maus beträgt 0,12 ml/10 g.</li>
	<li>Wiegen Sie 10 Tage im Wert von drei Dosen GSK-Granulat. Wiegen Sie 8 g, 16 g und 24 g GSK-Granulat und dienen als GSKL, GSKM und GSKH.</li>
	<li>Berechnen Sie die Äquivalentdosis von Calciumcarbonat mit Vitamin D3 (CAL) für die Maus auf der Grundlage der Meeh-Rubner-Gleichung15 wie in den Schritten 1.1.1 und 1.1.2: CAL-Dosierung = 2 Tablette/70 kg x 39/3 = 0,372 Tabletten/kg bei 0,4 Tabletten/kg.</li>
	<li>Berechnen Sie auf der Grundlage eines Körpergewichts von 20 g pro Maus (z. B. 1 Monat alt, weiblich, C57/BL6) die äquivalente Dosierung von CAL für die Maus: 0,4 Tabletten/kg x 0,02 kg = 0,008 Tablette. Berechnen Sie dann die Äquivalentdosis von CAL basierend auf 20 Mäusen pro Gruppe und einer Intervention, die 3 Monate (90 Tage) dauert: 0,008 Tabletten x 20 x 90 = 14,4 Tabletten. Wiegen Sie 10 Tage CAL (1,6 Tabletten).</li>
	<li>auflösung
	<ol>
<li>8 g GSK-Granulat in ein 50 ml-Rohr geben. 48 ml Saline hinzufügen und Rohr schütteln, um sich vollständig aufzulösen. HINWEIS: Der Standard für die vollständige Auflösung ist das Fehlen von Sedimenten. Die vollständige Auflösung kann weiter bestätigt werden, wenn eine Gavage-Nadel die Arbeitslösung aufstellen und dann reibungslos vertreiben kann.</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 1.5.1 mit 16 g und 24 g GSK-Granulat.</li>
		<li>Legen Sie 1,6 Tabletten (10 Tage Wert) von CAL in ein 50 ml Rohr. 48 ml Saline hinzufügen und Rohr schütteln, um sich vollständig aufzulösen. HINWEIS: Die Arbeitslösungen können bei -4 °C gelagert und alle 10 Tage vorbereitet werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Intragastrische Verabreichung
	<ol>
<li>Greifen Sie die Rückseite der Maus (1 Monat alt, weiblich, C57/BL6) mit der Maus nach vorne und stellen Sie sicher, dass sie fest in dieser Position bleibt. Halten Sie die Maus vor der Verabreichung für 2 x 3 min ruhig. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Forscher die Vorderseite der Maus deutlich sehen kann. Tragen Sie Handschuhe, um Mausbisse zu verhindern, vor allem für neue Forscher.</li>
		<li>Die Gavage-Nadel (Größe: #12, 40 mm) in die Arbeitslösung des GSK-Granulats geben und 0,24 ml der Arbeitslösung ziehen.</li>
		<li>Setzen Sie die Gavage-Nadel durch eine Seite ihres Mundes in die Maus, bis die Gavage-Nadel den Magen erreicht. HINWEIS: Um zu bestätigen, dass die Gavage-Nadel den Magen erreicht hat: (1) Die Gavage-Nadel trifft auf das Gefühl des Widerstands. In der Zwischenzeit zeigt die Maus die Wirkung des Schluckens, bevor die Gavage-Nadel die physische Verengung der Speiseröhre passiert. (2) Etwa 0,5 ml der Arbeitslösung in die Maus injizieren und 1 min warten. Wenn es keine Lösung aus der Maus kommt, bedeutet dies, dass die Gavage-Nadel den Magen erreicht hat.</li>
		<li>Injizieren Sie die Arbeitslösung von GSK-Granulat (0,24 ml/Maus) in den Magen und ziehen Sie dann die Gavage-Nadel heraus. Bringen Sie die Maus in ihren Käfig zurück.</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 1.6.4 mit der CAL-Lösung und injizieren Sie 0,24 ml CAL-Lösung pro Maus. HINWEIS: Das Volumen der CAL-Lösung wird wie in Schritt 1.2 berechnet.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Micro-CT-Scannen
<ol><li>
T ibia Ernte und Zubereitung
	<ol>
<li>Intraperitoneal anästhesieren Maus mit 300 ml/100 g 80 mg/kg Ketamin am Tag nach der 90-tägigen Intervention. Verwenden Sie eine Nadelprise der Zehen, um zu bestätigen, ob die Maus vollständig beästhetisiert ist. Keine Antwort deutet auf eine erfolgreiche Anästhesie hin. Dann töten Sie die Maus mit Zervix-Dislokation.</li>
		<li>Fixieren Sie die Maus mit den Armen und Beinen auf Schaum mit Tacks.</li>
		<li>Schneiden Sie die Haut mit Schere (Größe: 8,5 cm) und Pinzette (Größe: 10 cm) der Beine vom proximalen bis zum distalen Ende ab und ernten Sie tibias.</li>
		<li>Die Tibias sofort in 70% Ethylalkohol geben und 3 Mal waschen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die linke Tibia der Maus mit Schwammschaum umwickeln und in ein Probenrohr (35 mm Durchmesser, 140 mm Länge) geben. HINWEIS: Die lange Achse der Probe sollte zusammen mit der des Probenrohrs sein. Stellen Sie sicher, dass das proximale Ende der Tibia nach oben zeigt.</li>
	<li>
Ausführen der Micro-CT 80 Scanmaschine
	<ol>
<li>Starten Sie die Micro-CT 80 Scanmaschine bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Stellen Sie das Probenrohr in micro-CT 80 ein und starten Sie den Querschnittsscan mit den folgenden Scanparametern: Pixelgröße 15,6 m, Röhrenspannung 55 kV, Röhrenstrom 72 a, Integrationszeit 200 ms, räumliche Auflösung 15,6 m, Pixelauflösung 15,6 m und Bildmatrix 2048 x 2048. HINWEIS: Der Cancellousknochen unterscheidet sich durch Vorscannen vom kortikalen Knochen. Der Scanbereich der Tibia ist definiert als der cancellous Knochenbereich von 5 mm unterhalb des Tibialplateaus bis zum distalen Ende.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Quantifizierung des Knochenparameters
	<ol>
<li>Nach Abschluss des Querschnittsscans erhalten Sie die Bilder der linken Tibias.</li>
		<li>Legen Sie den Dichteschwellenwert auf 245 bis 1000 fest. Verwenden Sie das Mikro-CT-Evaluierungsprogramm V6.6, um die folgenden Knochenparameter zu messen: Knochenmineraldichte (BMD), Knochenvolumen über Gesamtvolumen (BV/TV), trabekuläre Knochenzahl (Tb.N), trabekuläre Knochendicke (Tb.Th) sowie Knochen-Trabekularknochen-Trennung ( Tb.Sp).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Vorbereitung von Blutserum für In-vitro-Experimente
<ol><li>berechnung
	<ol>
<li>Berechnen Sie auf der Grundlage eines Körpergewichts der Ratte von 0,2 kg (1 Monat alt, weiblich, Sprague-Dawley) die Dosierung von GSK-Granulat: menschliche Dosierung/Tag x Körpergewicht der menschlichen x K/Körpergewicht der Ratte = 20 g/70 kg/Tag x 70 kg x K (K = 0,018) /0,2 kg = 2 g/kg/Tag. HINWEIS: K ist der pharmakologische Transformationskoeffizient zwischen Mensch und Maus15 (K = 0,018).</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 3.1.1 und berechnen Sie die folgenden Dosierungen.<ol>
<li>Berechnen Sie die Dosierung von GSKL: 10 g/70 kg/Tag x 70 kg x K/0,2 kg = 1 g/kg/Tag.</li>
			<li>Berechnung der Dosierung von GSKM: 20 g/70 kg/Tag x 70 kg x K/0,2 kg = 2 g/kg/Tag.</li>
			<li>Berechnen Sie die Dosierung von GSKL: 40 g/70 kg/Tag x 70 kg x K/0,2 kg = 4 g/kg/Tag.</li>
			<li>Berechnen Sie die Dosierung von CAL: 2 Tabletten /70 kg/Tag x 70 kg x K/0,2 kg = 0,2 Tabletten/kg/Tag.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Berechnen Sie die Gesamtdosis von GSK-Granulat und CAL.<ol>
<li>Berechnen Sie die Gesamtdosis für GSKL: 1 g/kg/Tag x 0,2 kg x 6 Ratten x 3 Tage = 3,6 g.</li>
			<li>Berechnen Sie die Gesamtdosis für GSKM: 2 g/kg/Tag x 0,2 kg x 6 Ratten x 3 Tage = 7,2 g.</li>
			<li>Berechnen Sie die Gesamtdosis für GSKH: 4 g/kg/Tag x 0,2 kg x 6 Ratten x 3 Tage = 14,4 g.</li>
			<li>Berechnen Sie die CAL-Dosierung = 0,2 Tabletten/kg/Tag x 0,2 kg x 6 Ratten x 3 Tage = 0,72 Tabletten. HINWEIS: Für die Herstellung von 100 ml Kulturmedium (20% GSK-Granulat-haltiges Serum) werden insgesamt 10 ml GSK-Granulat-haltiges Serum benötigt. Es wird erwartet, dass jede Ratte (6 Ratten/Gruppe) nach der Zentrifugation 1,5 x 2 ml GSK-Granulat-haltiges Serum liefert.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Berechnen Sie das Volumen des Pro-Ratten-Granulats aufderte GSK-Granulat auf der Grundlage des Körpergewichts15: z. B. Volumen (V) = 2 ml/Ratte/Tag. HINWEIS: Das Volumen für die intragastrische Verabreichung bei Ratten beträgt 0,1 ml/10 g.</li>
	</ol></li>
	<li>Wiegen Sie 3 Tage im Wert von drei Dosen GSK-Granulat. Wiegen Sie 3,6 g, 7,2 g und 14,4 g GSK-Granulat und dienen als GSKL, GSKM und GSKH. Wiegen Sie 0,72 Tablette für die CAL-Gruppe.</li>
	<li>7,2 g GSK-Granulat in ein 50 ml-Rohr geben. 36 ml Saline hinzufügen und Rohr schütteln, um sich vollständig aufzulösen. Wiederholen Sie dies mit 3,6 g und 14,4 g GSK-Granulat.</li>
	<li>Wiederholen Sie Abschnitt 1.6 für die intragastrische Verabreichung mit 2 ml GSK-Arbeitslösung. HINWEIS: Verabreichen Sie das gleiche Volumen an Saline (2 ml pro Ratte) zur Herstellung von Serum und dient als leere Kontrollgruppe für In-vitro-Assays.</li>
	<li>Zubereitung des GSK-haltigen Serums
	<ol>
<li>Intraperitoneal anästhesieren die Ratten mit 300 ml/100 g 80 mg/kg Ketamin 1 h nach der letzten Verabreichung von GSK-Granulat. Verwenden Sie eine Nadelprise der Zehen, um zu bestätigen, ob die Ratte vollständig beäschend ist. Keine Antwort deutet auf eine erfolgreiche Anästhesie hin.</li>
		<li>Setzen Sie den Bauch nach dem Einschneiden der Haut und des Peritoneums mit einer geraden Schere auf den Boden des Thorax von Ratten aus. HINWEIS: Das chirurgische Instrument muss vor der Anwendung bei hohen Temperaturen und hohen Drücken sterilisiert werden. Der Operationsbereich muss während der Blutentnahme mit 70% Ethanol sterilisiert werden.</li>
		<li>Entfernen Sie das Bindegewebe der Bauchaorta mit Gewebepapier, um das Gefäß deutlich zu belichten.</li>
		<li>Mit einer 10 ml, 22 G Spritze Blut aus der Bauchaorta ziehen. Entfernen Sie dann die Nadel und übertragen Sie das Blut in ein 15 ml steriles Rohr. In der Regel können 6-8 ml Blut von einer Ratte erhalten werden. HINWEIS: Jede Ratte muss beim Blutziehen am Leben erhalten bleiben. Ein Indikator ist, dass die Bauchaorta pulsiert, wenn die Ratte am Leben ist. Die Ratte ist nach dem Blutziehen tot.</li>
		<li>Halten Sie die Röhre bei Raumtemperatur 30 bis 60 min aufrecht, bis das Blut in der Röhre geklont wird. Dann zentrifugieren Sie das Rohr bei 500 x 600 x g für 20 min. Übertragen Sie den gesamten Überstand (Serum) von einer Gruppe (6 Ratten) auf eine 50 ml sterile Röhre und schütteln, um zu mischen.</li>
		<li>Inaktivieren Sie das Serum, indem Sie 30 min in einem 56 °C-Wasserbad inkubieren. Filtern Sie das Serum mit einem hydrophilen Polyethersulfonspritzenfilter im Porenformat. Bei -80 °C für den langzeitigen Einsatz (weniger als 1 Jahr) lagern. HINWEIS: Das gefilterte Serum kann für In-vitro-Osteoclastogenese und Osteoblastogenese verwendet werden.</li>
	</ol></li>
	<li>bewerbung
	<ol>
<li>
In-vitro-Osteoclastogenese
		<ol>
<li>Verdünnen Sie die drei Dosierungen des GSK-haltigen Serums (GSKL, GSKM, GSKH) im Verhältnis 1:4 mit dem minimalen Eagle-Medium (-MEM), das L-Glutamin, Ribonukleoside und Desoxyribonukleoside enthält. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die endige Konzentration von GSK-haltigem Serum für In-vitro-Osteoclastogenese und Osteoblastogenese 20 % beträgt.</li>
			<li>Fügen Sie das verdünnte GSK-haltige Serum (200 L/Well) von Schritt 3.6.1.1 zu Knochenmarkmakrophagen (BMMs) von 4-6 Wochen alten C57BL/6-Mäusen für Osteoclastogenese hinzu und stimulieren BMMs mit Makrophagenkolonie-stimulierendem Faktor (M-CSF, 10 ng/mL) und Rezeptoraktivator für Kernfaktor-B-Ligand (RANKL, 100 ng/ml) wie zuvor beschrieben2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
In-vitro-Osteoblastogenese
		<ol>
<li>Wiederholen Sie Schritt 3.6.1.1.</li>
			<li>Fügen Sie das verdünnte GSK-haltige Serum (2 ml/well) zu den mesenchymalen Knochenstammzellen (BMSCs) von 4-6 Wochen alten C57BL/6-Mäusen hinzu, um Osteoblasten zu erzeugen, wie zuvor beschrieben16.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Granulat von TCM-Agenten sind eine der gemeinsamen Entscheidungen für Formulierungen oder Rezepte geworden. GSK-Granulat besteht aus mehreren pflanzlichen Arzneimitteln auf der Grundlage klinischer Erfahrungen oder der TCM-Theorie, und sie üben bessere heilende Effekte mit weniger Nebenwirkungen4. Im Vergleich zur Wasserabkochung haben die Granulate folgende Vorteile: guter Geschmack, Lieferkomfort, Langzeitlagerung, Standardprotokoll und konsistente Heileffekte sowie höhere Produktivität. Derzeit...

Die Traditionelle Chinesische Medizin (TCM) ist einer der wichtigen ergänzenden und alternativen Ansätze zur Behandlung von Osteoporose1,2. Wasserabkochung ist die grundlegende und am häufigsten verwendete Form der Formel3. Es gibt jedoch auch Nachteile: schlechter Geschmack, Unannehmlichkeiten für den Transport, kurze Haltbarkeit und inkonsistente Protokolle, Begrenzung der Verwendungen sowie die heilende Wirkung. Um die oben genannten Nachteile zu vermeiden und um bessere Effekte zu erzielen, wurden Granulate entwickelt und weit verbreitet4verwendet. Obwohl viele Studien die pharmakologischen Mechanismen einer oder mehrerer wirksamer Komponenten aus dem Granulat5,6,7untersucht haben, sind die genauen Mechanismen und zugrunde liegenden pharmakologischen Prozesse schwer zu identifizieren. Dies liegt daran, dass zu viele effektive Komponenten aus einem Granulat gleichzeitig ähnliche oder entgegengesetzte Effekte ausüben können4. Daher würde die Entwicklung eines Standardprotokolls zur Vorbereitung des Granulats vor der Lieferung an den Körper nicht nur einen großen Einfluss auf die therapeutischen Ergebnisse haben, sondern ist auch für In-vivo- und In-vitro-Assays erforderlich.
Darüber hinaus sind die heilenden Wirkungen von Granulaten in der Klinik schwer zu bestätigen und anhand von In-vitro- oder Ex-vivo-Studien genau zu identifizieren, was eine Herausforderung schafft, da die pharmakologischen Mechanismen zu komplex sind. Um dies zu lösen, wurde die Herstellung von drogenhaltigem Serum zuerst von Tashino in den 1980er Jahrenvorgeschlagen 8. Von da an wandten zahlreiche Forscher medikamentenhaltiges Serum auf die Kräutermedizin an, einschließlich Granulat9,10,11. Derzeit wird die Wahl des medikamentenhaltigen Serums für In-vitro-Untersuchungen als eine Strategie betrachtet, die physiologische Bedingungen genau nachahmt.
Gushukang (GSK) Granulat wurde entwickelt, um postmenopausale Osteoporose (POP) auf der Grundlage der klinischen Praxis im Lichte der Theorie der TCM zu behandeln. GSK-Granulat verhindert Knochenverlust bei ovariectomisierten (OVX) Mäusen in vivo, hemmt die osteoklastische Knochenresorption und stimuliert die osteoblastische Knochenbildung4. Daher fanden Li et al.12 heraus, dass GSK-Granulate bei OVX-Mäusen Knochenschutzwirkungen haben, indem sie die Aktivitäten des Calciumrezeptors zur Stimulierung der Knochenbildung verbessern. Zur Bestätigung der knochenschützenden Wirkungen sowie der pharmakologischen Wirkungen von GSK-Granulat stellen die Autoren hier ein detailliertes Verfahren zur Herstellung von Arbeitslösungen und Medikamenten (GSK-Granulat) -haltigem Serum zur Verfügung. Darüber hinaus beschreibt dieser Artikel die Anwendung von GSK-Granulat in einem OVX-induzierten osteoporotischen Mausmodell und GSK-Granulat-haltigem Serum für In-vitro-Osteoclastogenese/Osteoblastogenese.
GSK-Granulat besteht aus mehreren Kräutern13,14 und kann leicht in Derinline gelöst werden. Daher dient Saline als Fahrzeug. Scheinoperierte Mäuse (Sham) und OVX-Mäuse wurden das gleiche Volumen an Salin verabreicht wie die mit Granulat verabreichten Mäuse. Die Äquivalentdosen von GSK-Granulat für die Maus wurden auf der Grundlage der Meeh-Rubner-Gleichung15berechnet. Diese Gleichung hat nicht nur den Vorteil, sichere Dosierungen zu erhalten, sondern garantiert auch pharmakologische Effekte15. Die drei Dosierungen von GSK-Granulat wurden wie folgt erzeugt: (1) GSKL: OVX + niedrig dosierte GSK-Granulate, 2 g/kg/Tag. (2) GSKM: OVX + mitteldosiertes GSK-Granulat, 4 g/kg/Tag. (3) GSKH: OVX + hochdosiertes GSK-Granulat, 8 g/kg/Tag. Mäuse in den GSKL-, GSKM- und GSKH-Gruppen wurden intragastrisch mit GSK-Granulat verabreicht. Als Positivkontrolle wurde beispielsweise Calciumcarbonat (600 mg/Tablette) mit Vitamin D3 (125 internationale Einheit/Tablette) in einem ausgereiften und vermarkteten Produkt (z. B. Caltrat [CAL]) zur Behandlung und Vorbeugung von Osteoporose verwendet.

<table><tbody><tr><td>&alpha;-MEM</td><td>Hyclone Laboratorien</td><td>SH30265.018</td><td>Für Zellkultur</td></tr><tr><td>&beta;-Glycerophosphat</td><td>Sigma</td><td>G5422</td><td>Osteoblastogenese-Caltrat</td></tr><tr><td>(CAL)</td><td>Wyeth</td><td>L96625</td><td>Tierintervention</td></tr><tr><td>C57BL/6 Mäuse</td><td>SLAC Laboratory Animal Co., Ltd.</td><td>Zufällige</td><td>Ainimalpräparation</td></tr><tr><td>Dexamethsom</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid</td><td>Sigma</td><td>D2438</td><td>Zelle gefrorene</td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)</td><td>Sangon Biotech</td><td>60-00-4</td><td>Proben behandeln</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Gibco</td><td>FL-24562</td><td>Für die Zellkultur</td></tr><tr><td>Gushukang Granulat</td><td>Kangcheng Unternehmenin China</td><td>Z20003255</td><td>Pflanzliches verschreibungspflichtiges</td></tr><tr><td>Lichtmikroskop</td><td>Olympus BX50</td><td>Olympus BX50</td><td>Bilder für Osteoklastogenese</td></tr><tr><td>L-Ascorbinsäure 2-Phosphat Sequinagneium Slat Hyclrat</td><td>Sigma</td><td>A8960-5G</td><td>Osteoblastogenese</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Leica</td><td>DMI300B</td><td>Osteocast und Osteoblasten imagine</td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>Peprotech</td><td>AF-300-25-10</td><td>Osteoklastogenese</td></tr><tr><td>&Mu; icro-CT</td><td>Scanco Medical AG</td><td>&mu; CT80 Röntgenmikroskop Mikrotomograph</td><td>Knochenstrukturanaallyse</td></tr><tr><td>RANKL</td><td>Peprotech</td><td>11682-HNCHF</td><td>Osteoklastogenese</td></tr><tr><td>Sprague Dawley</td><td>SLAC Laboratory Animal Co., Ltd.</td><td>Stichprobenartige</td><td>Blutserumentnahme</td></tr><tr><td>Tartratresistentes Säurephosphat (TRAP) Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>387A-1KT</td><td>TRAP Färbung</td></tr></tbody></table>

vorbereitung von gushukang (gsk) granulat en for in vivo und in vitro experiments

Preparation Of Gushukang (GSK) Granules for In Vivo and In Vitro Experiments

Die traditionelle chinesische Kräutermedizin spielt eine Rolle als alternative Methode bei der Behandlung vieler Krankheiten, wie postmenopausale Osteoporose (POP). Gushukang (GSK) Granulat, ein vermarktetes Rezept in China, haben knochenschützende Wirkung bei der Behandlung von POP. Vor der Verabreichung an den Körper, ein Standard-Vorbereitungsverfahren ist allgemein erforderlich, die die Freisetzung von aktiven Bestandteilen aus Rohkräutern fördern und die pharmakologischen Wirkungen sowie therapeutische Ergebnisse zu verbessern. Diese Studie schlägt ein detailliertes Protokoll für die Verwendung von GSK-Granulat in in vivo- und in vitro-Experimentellen Assays vor. Die Autoren liefern zunächst ein detailliertes Protokoll zur Berechnung der tiergerechten Dosierungen von Granulaten für in vivo-Untersuchungen: Wiegen, Auflösen, Lagern und Verstoffen. Zweitens werden in diesem Artikel Protokolle für Mikro-CT-Scans und die Messung von Knochenparametern beschrieben. Die Probenvorbereitung, Protokolle zum Betrieb der Mikro-CT-Maschine und die Quantifizierung der Knochenparameter wurden ausgewertet. Drittens werden serumhaltige GSK-Granulate hergestellt und medikamentenhaltiges Serum für In-vitro-Osteoclastogenese und Osteoblastogenese extrahiert. GSK-Granulat wurde zweimal täglich an drei aufeinanderfolgenden Tagen intragastrisch an Ratten verabreicht. Anschließend wurde Blut entnommen, zentrifugiert, inaktiviert und gefiltert. Schließlich wurde Serum verdünnt und zur Durchführung von Osteoclastogenese und Osteoblastogenese verwendet. Das hier beschriebene Protokoll kann als Referenz für pharmakologische Untersuchungen von verschreibungspflichtigen pflanzlichen Arzneimitteln wie Granulaten betrachtet werden.

Die Ergebnisse des Mikro-CT-Scans zeigten, dass die OVX-Mäuse im Vergleich zu Saline-Kontrollmäusen einen signifikanten Knochenverlust zeigten (Abbildung 1A). Die Intervention (90 Tage) von GSK-Granulat hat die BMD stark erhöht, insbesondere in der GSKM-Gruppe (Abbildung 1B). Die Knochenstrukturparameter wie BMD, BV/TV, Tb.N und Tb.Th wurden quantifiziert. GSK-Granulatbehandlungen führten zu erhöhten BMD, BV/TV, Tb.N und Tb.Th, v...

Dieser Artikel enthält ein detailliertes Protokoll zur Vorbereitung einer Arbeitslösung von Gushukang-Granulat für Tierstudien und GSK-Granulat, das Serum für In-vitro-Experimente enthält. Dieses Protokoll kann auf pharmakologische Untersuchungen von pflanzlichen Arzneimitteln sowie auf Verschreibungen für In-vivo- und In-vitro-Experimente angewendet werden.

Vorbereitung von Gushukang (GSK) Granulat en for In Vivo und In Vitro Experiments

Traditional Chinese herbal medicine plays a role as an alternative method in treating many diseases, such as postmenopausal osteoporosis (POP). Gushukang ...

Dieses Protokoll bietet die Herstellung einer Arbeitslösung von Granulaten für In-vivo-Studien sowie die Herstellung von granulathaltigem Serum für In-vitro-Experimente. Ein Vorteil dieser Technik ist, dass die Methode aufgrund der geringen Kosten der Materialien und der Tiere, die Sie für die Experimente erstellen, leicht wiederholt werden kann. Beginnen Sie mit dem Hinzufügen von acht, 16 und 24 Gramm Gushukang, oder GSK, Granulat zu einzelnen 50-Milliliter-Röhren.Fügen Sie 48 Milliliter Wasser in jedes Rohr, und schütteln Sie die Rohre, um das Granulat vollständig aufzulösen. Dann 1,6 Tabletten Calciumcarbonat, ergänzt mit Vitamin D3, in eine weitere 50-Milliliter-Röhre geben und die Tabletten in 48 Milliliter Saline mit Schütteln auflösen. Für die intragastrische Verabreichung der Lösungen, zunächst sanft, aber fest manuell eine ein Monatige alte, weibliche, C57 Black 6 Maus für zwei bis drei Minuten zurückhalten.Wenn die Maus beruhigt ist, laden Sie eine 40-Millimeter-, Nummer 12-Gavage-Nadel mit 0,24 Millilitern einer Arbeitslösung von GSK-Granulat, und legen Sie die Gavage-Nadel in die Maus durch eine Seite des Mundes, bis der Nadelwiderstand gefühlt wird, was darauf hindeut

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Das Ziel dieses Protokolls ist es, SDF-1α, einen Stammzell-Homing-Faktor, in Dextransulfat-Chitosan-Nanopartikel einzubauen.  Die resultierenden Partikel werden auf ihre Größe und ihr Zetapotenzial sowie auf den Gehalt, die Aktivität und die In-vitro-Freisetzungsrate von SDF-1α aus den Nanopartikeln gemessen.

Herstellung und Charakterisierung von SDF-1α-Chitosan-Nanopartikel Dextransulfat

Wir beschreiben hier ein kosteneffizientes Granzym-Expressionssystem mit HEK293T Zellen, das hohe Ausbeuten an reiner, vollständig glykosylierter und enzymatisch aktiver Protease produziert.

Eine hohe Ausbeute und kosteneffiziente Expression System der Menschen Granzyme in Säugerzellen

Dieses Protokoll beschreibt die genaue Messung der neuronalen Lebensfähigkeit mit Fluorescein-Diacetat (FDA) und Propidium-Iodid (PI) Doppelfärbung in kultivierten Zerebellar-Granulat-Neuronen, einer primären neuronalen Kultur, die als in vitro- Modell in der Neurowissenschaften und der Neuropharmakologieforschung verwendet wird.

Beurteilung der neuronalen Lebensfähigkeit unter Verwendung von Fluorescein-Diacetat-Propidium-Iodid-Doppelfärbung in Cerebellar-Granulat-Neuron-Kultur

Hier präsentieren wir die Vorbereitung eines Er-Xian-Abkochens (EXD) in vier Stufen - Einweichen, Abkühlen, Filtrieren und Konzentrieren - und zeigen die Verabreichung eines präparierten EXD-haltigen Serums an Ratten. Diese Methoden gelten für die in vivo und in vitro Studie von pflanzlichen Abkochungen wie traditionelle chinesische Medikamente.

Vorbereitung der Kräutermedizin: Er-Xian Decoction und Er-Xian-haltiges Serum für<em&gt; In vivo</em&gt; Und<em&gt; In vitro</em&gt; Experimente

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur murine granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor-producing T (THGM)-Helferzellen von naiven CD4 + T-Zellen, einschließlich Isolierung von naiven CD4 + T-Zellen, Differenzierung von THGM, zu differenzieren und Analyse von differenzierten Zellen THGM. Diese Methode kann auf Studien der Verordnung und Funktion von THGM Zellen angewendet werden.

In-vitro- Differenzierung von Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (GM-CSF) Maus-Herstellung von T-Helferzellen (THGM)

Wir haben mit eine gold-Nanopartikel-Peptid-Hybrid früher intravenös liefern einen synthetischen Peptid, Protein-Kinase C-Delta-Hemmer, die Ischämie-Reperfusion-induzierten akuten Lungenversagen reduziert. Hier zeigen wir das ausführliche Protokoll der Arzneistoff-Formulierung. Anderen intrazellulären Peptide können in ähnlicher Weise formuliert werden.

Protein Kinase C-Delta-Inhibitor Peptid Formulierung mit Gold-Nanopartikeln

Wir entwickelten und beschreiben ein Protokoll basiert auf dem nass Spinnerei-Konzept für den Bau von Gelatine-basierten Biomaterialien für die Anwendung des Tissue Engineering verwendet.

Nass-Spinnen-basierte Spritzgießprozess Gelatine für die Geweberegeneration

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein nicht-emulsionsbasiertes Verfahren zur Herstellung von Chitosan-Genipin-Mikrogelen. Die Größe dieser Mikrogele kann präzise kontrolliert werden, und sie können pH-abhängige Schwellungen aufweisen, in vivo abgebaut werden und mit therapeutischen Molekülen beladen sein, die im Laufe der Zeit nachhaltig freigesetzt werden, was sie für Tissue-Engineering-Anwendungen sehr relevant macht.

Herstellung von größenkontrollierten und emulsionsfreien Chitosan-Genipin-Mikrogelen für Tissue-Engineering-Anwendungen

Dieser Artikel beschreibt Protokolle für die Herstellung von Gelatine-Methacryloyl-Mikrogelen mit hohem Durchsatz unter Verwendung mikrofluidischer Geräte, die Umwandlung von Mikrogelen in resuspendierbares Pulver (Mikroaerogele), die chemische Anordnung von Mikrogelen zu körnigen Hydrogelgerüsten und die Entwicklung von körnigen Hydrogel-Biotinten mit erhaltener Mikroporosität für den 3D-Biodruck.

Gelatine-Methacryloyl-Hydrogel-Gerüste: Hochdurchsatz-Mikrogelherstellung, Gefriertrocknung, chemische Assemblierung und 3D-Bioprinting

Hier stellen wir einen gentherapeutischen Ansatz vor, bei dem ABE-beschichtetes Chitosan durch intraossäre Injektion direkt ins Knochenmark abgegeben wird.

Verbesserte Genverabreichung und -expression durch intraossäre Injektion von Chitosan-Nanopartikeln, verkapselten Adenin-Base-Editor-Plasmiden

In diesem Artikel wird eine einfache Ein-Topf-Rekonstitution von Zytoskelett-Netzwerken innerhalb von phasengetrennten Riesenvesikeln vorgestellt. Die Methode kann verallgemeinert und auf die Verkapselung oder den Einschluss einer Vielzahl von Biomolekülen angewendet werden.

In vitro Rekonstitution von Zytoskelett-Netzwerken in phasengetrennten riesigen unilamellären Vesikeln (GUVs)

Erfahren Sie die Herstellung von Gushukang-Granulatlösungen für In-Vivo-Studien und serumhaltige Präparate für In-Vitro-Experimente. Diese kostengünstige Methode ermöglicht reproduzierbare pharmakologische Untersuchungen.

Vorbereitung von Gushukang (GSK) Granulat en for In Vivo und In Vitro Experiments

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