Name: Induktion der medikamenteninduzierten Autoimmunhepatitis bei BALB/c-Mäusen zur Untersuchung ihrer pathogenen Mechanismen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-29T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: Erfahren Sie die Induktion einer medikamenteninduzierten Autoimmunhepatitis bei BALB/c-Mäusen zur Untersuchung pathogener Mechanismen und Geschlechtsunterschiede. Dieses reproduzierbare In-vivo-Modell ermöglicht die Analyse von Leberpathologie und Immunantworten.

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Dr. Njoku möchte Dr. Noel R. Rose, MD PhD, für seine Anleitung und aufschlussreichen Diskussionen danken, die zur Formulierung dieses Modells geführt haben.

<ol><li>Castiella, A., Zapata, E., Lucena, M. I., Andrade, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-induced+autoimmune+liver+disease%3A+A+diagnostic+dilemma+of+an+increasingly+reported+disease%5BTitle%5D)+AND+%22World+J.+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Drug-induced autoimmune liver disease: A diagnostic dilemma of an increasingly reported disease.</a> World J. Hepatology. 6 (4), 160-168 (2014).</li>
<li>Bjornsson, E. S., Bergmann, O. M., Bjornsson, H. K., Kvaran, R. B., Olafsson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence%2C+presentation%2C+and+outcomes+in+patients+with+drug-induced+liver+injury+in+the+general+population+of+Iceland%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Incidence, presentation, and outcomes in patients with drug-induced liver injury in the general population of Iceland.</a> Gastroenterology. 144 (7), 1419-1425 (2013).</li>
<li>Castiella, A., Lucena, M. I., Zapata, E. M., Otazua, P., Andrade, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-induced+autoimmune-like+hepatitis%3A+a+diagnostic+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Digestive+Diseases+and+Sciences%22%5BJournal%5D)">Drug-induced autoimmune-like hepatitis: a diagnostic challenge.</a> Digestive Diseases and Sciences. 56 (8), 2501-2502 (2011).</li>
<li>Czaja, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-induced+autoimmune-like+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Digestive+Diseases+and+Sciences%22%5BJournal%5D)">Drug-induced autoimmune-like hepatitis.</a> Digestive Diseases and Sciences. 56 (4), 958-976 (2011).</li>
<li>Pohl, L. R., Thomassen, D., Pumford, N. R., Butler, L. E., Satoh, H., Ferrans, V. J., Perrone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hapten+carrier+conjugates+associated+with+halothane+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Hapten carrier conjugates associated with halothane hepatitis.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 283, 111-120 (1991).</li>
<li>Njoku, D. B., Talor, M. V., Fairweather, D., Frisancho-Kiss, S., Odumade, O. A., Rose, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+model+of+drug+hapten-induced+hepatitis+with+increased+mast+cells+in+the+BALB%2Fc+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Molecular+Pathology%22%5BJournal%5D)">A novel model of drug hapten-induced hepatitis with increased mast cells in the BALB/c mouse.</a> Experimental and Molecular Pathology. 78 (2), 87-100 (2005).</li>
<li>Cottagiri, M., Nyandjo, M., Stephens, M., Mantilla, J., Saito, H., Mackay, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+drug-induced%2C+immune-mediated+hepatitis%2C+interleukin-33+reduces+hepatitis+and+improves+survival+independently+and+as+a+consequence+of+FoxP3%2B+T-cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">In drug-induced, immune-mediated hepatitis, interleukin-33 reduces hepatitis and improves survival independently and as a consequence of FoxP3+ T-cell activity.</a> Cellular and Molecular Immunology. , (2018).</li>
<li>Lohse, A. W., Manns, M., Dienes, H. P., Meyer zum Buschenfelde, K. H., Cohen, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+autoimmune+hepatitis%3A+disease+induction%2C+time+course+and+T-cell+reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Experimental autoimmune hepatitis: disease induction, time course and T-cell reactivity.</a> Hepatology. 11 (1), 24-30 (1991).</li>
<li>McCarthy, E. K., Vakos, A., Cottagiri, M., Mantilla, J. J., Santhanam, L., Thomas, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+Shared+Cytochrome+p4502E1+Epitope+Found+in+Anesthetic+Drug-Induced+and+Viral+Hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Identification of a Shared Cytochrome p4502E1 Epitope Found in Anesthetic Drug-Induced and Viral Hepatitis.</a> mSphere. 3 (5), (2018).</li>
<li>Cho, J., Kim, L., Li, Z., Rose, N. R., Talor, M. V., Njoku, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+bias+in+experimental+immune-mediated%2C+drug-induced+liver+injury+in+BALB%2Fc+mice%3A+suggested+roles+for+Tregs%2C+estrogen%2C+and+IL-6%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+One%22%5BJournal%5D)">Sex bias in experimental immune-mediated, drug-induced liver injury in BALB/c mice: suggested roles for Tregs, estrogen, and IL-6.</a> PLoS. One. 8 (4), 61186(2013).</li>
<li>Satoh, H., Gillette, J. R., Takemura, T., Ferrans, V. J., Jelenich, S. E., Kenna, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+immunological+basis+of+halothane-induced+hepatotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Investigation of the immunological basis of halothane-induced hepatotoxicity.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 197, 657-673 (1986).</li>
<li>Eliasson, E., Kenna, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+P450+2E1+is+a+cell+surface+autoantigen+in+halothane+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Cytochrome P450 2E1 is a cell surface autoantigen in halothane hepatitis.</a> Molecular Pharmacology. 50 (3), 573-582 (1996).</li>
<li>Bourdi, M., Chen, W., Peter, R. M., Martin, J. L., Buters, J. T., Nelson, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cytochrome+P450+2E1+is+a+major+autoantigen+associated+with+halothane+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Research+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Human cytochrome P450 2E1 is a major autoantigen associated with halothane hepatitis.</a> Chemical Research in Toxicology. 9 (7), 1159-1166 (1996).</li>
<li>Njoku, D. B., Li, Z., Washington, N. D., Mellerson, J. L., Talor, M. V., Sharma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppressive+and+pro-inflammatory+roles+for+IL-4+in+the+pathogenesis+of+experimental+drug-induced+liver+injury%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Suppressive and pro-inflammatory roles for IL-4 in the pathogenesis of experimental drug-induced liver injury.</a> European Journal of Immunology. 39 (6), 1652-1663 (2009).</li>
<li>Aithal, G. P., Ramsay, L., Daly, A. K., Sonchit, N., Leathart, J. B., Alexander, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+adducts%2C+circulating+antibodies%2C+and+cytokine+polymorphisms+in+patients+with+diclofenac+hepatotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatic adducts, circulating antibodies, and cytokine polymorphisms in patients with diclofenac hepatotoxicity.</a> Hepatology. 39 (5), 1430-1440 (2004).</li>
<li>Higuchi, S., Kobayashi, M., Yoshikawa, Y., Tsuneyama, K., Fukami, T., Nakajima, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-4+mediates+dicloxacillin-induced+liver+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Letters%22%5BJournal%5D)">IL-4 mediates dicloxacillin-induced liver injury in mice.</a> Toxicology Letters. 200 (3), 139-145 (2011).</li>
<li>Rubtsova, K., Marrack, P., Rubtsov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+dimorphism+in+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Sexual dimorphism in autoimmunity.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (6), 2187-2193 (2015).</li>
<li>Satoh, H., Fukuda, Y., Anderson, D. K., Ferrans, V. J., Gillette, J. R., Pohl, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+studies+on+the+mechanism+of+halothane-induced+hepatotoxicity%3A+immunohistochemical+evidence+of+trifluoroacetylated+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Immunological studies on the mechanism of halothane-induced hepatotoxicity: immunohistochemical evidence of trifluoroacetylated hepatocytes.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 233 (3), 857-862 (1985).</li>
<li>Habeeb, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+free+amino+groups+in+proteins+by+trinitrobenzenesulfonic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Determination of free amino groups in proteins by trinitrobenzenesulfonic acid.</a> Analytical Biochemistry. 14 (3), 328-336 (1966).</li>
<li>Christen, U., Burgin, M., Gut, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Halothane+metabolism%3A+immunochemical+evidence+for+molecular+mimicry+of+trifluoroacetylated+liver+protein+adducts+by+constitutive+polypeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Halothane metabolism: immunochemical evidence for molecular mimicry of trifluoroacetylated liver protein adducts by constitutive polypeptides.</a> Molecular Pharmacology. 40 (3), 390-400 (1991).</li>
<li>Christen, U., Quinn, J., Yeaman, S. J., Kenna, J. G., Clarke, J. B., Gandolfi, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+dihydrolipoamide+acetyltransferase+subunit+of+the+human+pyruvate+dehydrogenase+complex+as+an+autoantigen+in+halothane+hepatitis.+Molecular+mimicry+of+trifluoroacetyl-lysine+by+lipoic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of the dihydrolipoamide acetyltransferase subunit of the human pyruvate dehydrogenase complex as an autoantigen in halothane hepatitis. Molecular mimicry of trifluoroacetyl-lysine by lipoic acid.</a> European Journal of Biochemistry. 223 (3), 1035-1047 (1994).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die Stärke dieses Protokolls liegt in seiner Reproduzierbarkeit; Daher ist es wichtig, sich an die vorgeschlagenen Schritte zu halten. Die Formulierung des Immunogens kann für einige eine Barriere sein; Wir haben unser Modell jedoch mit dem in unserem Dokument beschriebenen Epitop reproduziert, wodurch die Notwendigkeit, die S100-Fraktion der Leber zu isolieren, entfällt. Es ist wahrscheinlich, dass zusätzliche Epitope oder Proteine nach Impfungen verändert werden können und Hepatitis induzieren; Wir beschreiben jedoch d...

Der Zweck dieser Methode ist es, ein Mausmodell der medikamenteninduzierten Autoimmunhepatitis zu beschreiben, das sich in vivo entwickelt, und zu zeigen, wie es verwendet werden kann, um die molekularen, immunologischen und genetischen Grundlagen dieser Krankheit zu untersuchen. Das langfristige Ziel unserer Studien ist es, Mechanismen aufzudecken, die für die Entstehung chronischer Leberentzündungen und -verletzungen verantwortlich sind, indem wir DIH bei anfälligen Patienten untersuchen. Lebererkrankungen und Zirrhose stellen die sechsthäufigste Todesursache bei Erwachsenen zwischen 25 und 64 Jahren dar. Idiosynkratische DILI, manchmal auch als medikamenteninduzierte Autoimmunhepatitis (DIH) bezeichnet, ist die dritthäufigste Ursache für akutes Leberversagen in den Vereinigten Staaten. DIH ist der häufigste hepatische medikamenteninduzierte Hypersensibilisierungsprozess, der bei etwa 9 bis 12% der Patienten mit Autoimmunhepatitis1 beobachtet wurde. Die überwiegende Mehrheit der Patienten mit DIH sind Frauen 2,3,4. Eine Art von DIH entwickelt sich bei anfälligen Personen nach Verabreichung von halogenierten flüchtigen Anästhetika wie Isofluran, Sevofluran, Desfluran oder Halothan. Diese Anästhetika binden kovalent an Leberproteine mit reaktiven Produkten ihres Stoffwechsels und erzeugen so neuartige Autoantigene, die allergische oder Autoimmunreaktionen hervorrufenkönnen 5.
Die Untersuchung pathogener Mechanismen, die an der Entwicklung von Anästhetika und jeder Form von DIH beteiligt sind, wurde zuvor durch das Fehlen eines Tiermodells behindert, das die Induktion menschlicher Krankheiten genau nachahmt. Wir haben ein experimentelles murines Modell von DIH mit Merkmalen entwickelt, die immunvermitteltem DILI bei Patienten ähneln. Hepatitis wird durch Immunisierung mit einem von zwei Autoantigenen induziert, die kovalent durch den Trifluoracetylchlorid (TFA)-Metaboliten modifiziert wurden, der nach oxidativem Metabolismus des Anästhetikums durch das Enzym Cytochrom P450 2E1 (CYP2E1)5 gebildet wird. Ein Autoantigen ist die hepatische zytosolische S100-Leberfraktion, die eine Mischung aus mehreren Proteinen6 ist, und das zweite Autoantigen ist ein Epitop von CYP2E1, das von Seren bei Patienten mit immunvermitteltem Anästhesie-DILI7 erkannt wird. Durch die Verwendung von BALB/c-Mäusen, die relativ resistent gegen experimentelle Autoimmunhepatitis sind, unterscheiden wir unser Modell vom S100-induzierten Immunisierungsmodell der Autoimmunhepatitis bei C57Bl/6J-Mäusen8.
Aufgrund seiner vielfältigen klinischen Präsentationen ist das DIH bei Patienten schwer zu untersuchen. Translationale experimentelle Modelle bieten die Möglichkeit, die Pathogenese der Krankheit in vivo und in vitro zu bewerten. Derzeit gibt es keine anderen alternativen Methoden zur Induktion von DIH, die in vivo oder in vitro adaptive oder angeborene Immunantworten ohne den Einsatz von Tieren vollständig untersuchen. Da die Trifluoracetylierung von S-100 oder dem CYP2E1-Epitop kein irritierendes Immunogen zu produzieren scheint und wir DIH durch Immunisierung mit TFA-veränderten Proteinen induzieren, erhalten diese Tiere vor der Immunisierung oder anderen Verfahren keinen Ether, halogenierte Anästhetika, Barbiturat oder Alkohol, da diese Mittel die von uns untersuchten Parameter verändern können. Trotzdem haben wir unseren Mausverbrauch reduziert, indem wir Computersimulationen verwendet haben, um die Bindungspräferenzen unseres entdeckten CYP2E1-Epitops 9 zu bestätigen, und haben menschliches DIH gespiegelt, das weibliches Geschlecht impliziert, indem wir gezeigt haben, dass weibliche BALB / c-Mäuse einen schwereren DIH10 entwickeln.
Trotz vielfältiger Darstellungen von DIH bei Patienten und Herausforderungen bei der Erforschung klinischer Erkrankungen ist die posttranslationale Modifikation nativer Proteine durch reaktive Wirkstoffmetaboliten ein anerkannter Schlüsselmechanismus in der Pathogenese DIH, die auf halogenierte Anästhetika folgt11. Die Forscher akzeptieren auch, dass CYP2E1 ein wichtiges Autoantigen in diesem Prozessist 12,13. Die Rolle von Interleukin (IL)-4-upregulierten CD4+T-Zellen, die ein posttranslational modifiziertes CYP2E1 und andere Leberproteine erkennen, ist ein akzeptierter Initiator von anästhetischem DIH, indem sie Neutrophile, Eosinophile und Mastzellen in die Leber 14 lockt, und dieser Mechanismus wurde in vielen Formen von DIH 15,16 bestätigt. Induzierte FoxP3-exprimierende CD4+CD25+T-Zellen (Tregs) reduzieren den Schweregrad von DIH, und relative Mängel dieser Zellen in der Milz verschlimmern DIH 10,7. So wurden die meisten Fortschritte beim Verständnis von DIH durch die Verwendung von In-vivo-Mausmodellen ermöglicht, um die genetischen, metabolischen und immunologischen Mechanismen von DIH sowohl in vivo als auch in vitro zu bewerten.
Da wir und andere Forscher Rollen für IL-4, Neutrophile und Eosinophile bei der Initiierung von DIH mit verschiedenen Mausmodellen aufgedeckt haben, glauben wir, dass diese Beobachtung unsere Behauptung stützt, dass unabhängig vom verwendeten DIH-Modell Hepatitis und Verletzung durch IL-4 induziert werden. Die Stärke unseres Protokolls liegt in der Anwendung der In-vivo-Methodik, sowohl männlicher als auch weiblicher Mäuse, und der Wiederholung von Histologie, CD4+ T-Zell-Proliferationsassays und Zytokinen. Die Stärke unserer Verwendung von In-vitro-Studien besteht darin, dass sie die Anzahl der benötigten Mäuse reduzieren und gleichzeitig die Methodik zur Isolierung zellulärer Interaktionen bereitstellen, die DIH antreiben. Wir empfehlen die Verwendung von männlichen und weiblichen Mäusen, da dies die Möglichkeit einer unbewussten Verzerrung bei der Interpretation der Ergebnisse verringert und das Übersetzungspotenzial unserer Studien stärkt, da die Inzidenz, Prävalenz und Schwere von DIH bei Frauen17 höher ist. Wir empfehlen, dass Mäuse von einem einzigen Anbieter bezogen werden; Wenn dies jedoch nicht möglich ist, besorgen Sie sich Wurfpartnerkontrollen oder Wildtyp-Mäuse vom selben Anbieter wie die genetisch veränderten Mäuse.

<table><tbody><tr><td>0,1% 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure (TNBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>28997</td><td></td></tr><tr><td>AKP Substrat Kit</td><td>BioRad</td><td>172-1063</td><td></td></tr><tr><td>BALB/c Mäuse</td><td>Jackson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellTrace&trade; CFSE Zellproliferationskit</td><td>ThermoFisher</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>CFA H37Ra</td><td>Becton Dickinson (Difco Bacto)</td><td>231131</td><td></td></tr><tr><td>FcR Blockierungsreagenz</td><td>Milteyi</td><td>130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>Allgemeine Ergänzung</td><td>ThermoFisher</td><td>HPRG770</td><td></td></tr><tr><td>HepaRG&trade; Zellen kryokonserviert</td><td>ThermoFisher</td><td>HPR GC10</td><td></td></tr><tr><td>Lebend/tot fixierbar Aqua Dead Cell Färbeset&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>L34965</td><td></td></tr><tr><td>NaHC03</td><td>Millipore Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Percoll&reg;</td><td>Millipore Sigma</td><td>P1644-1L</td><td></td></tr><tr><td>Pertussis Toxin</td><td>Liste Biologicals</td><td>180</td><td></td></tr><tr><td>Phosphat gepufferte Kochsalzlösung pH 7,4</td><td>Verschiedenes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierce&Trade; Proteasehemmer Mini-Tabletten, EDTA-frei</td><td>ThermoFisher</td><td>88666</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumhydroxid</td><td>JT Baker</td><td>3140-01</td><td></td></tr><tr><td>S-Ethyltrifluorthioacetat (S-ETFA)</td><td>Millipore Sigma</td><td>177474</td><td></td></tr><tr><td>Slide-a-Lyzer Dialysekassetten (10 K, 12 ml)</td><td>ThermoFisher</td><td>66810</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure&trade; SDS-Lösung, 10%</td><td>ThermoFisher</td><td>24730020</td><td></td></tr><tr><td>Williams Media E, kein phenolrotes</td><td>ThermoFisher</td><td>A1217601</td><td></td></tr></tbody></table>

induktion der medikamenteninduzierten autoimmunhepatitis bei balb/c-mäusen zur untersuchung ihrer pathogenen mechanismen

Induction of Drug-Induced, Autoimmune Hepatitis in BALB/c Mice for the Study of Its Pathogenic Mechanisms

Die medikamenteninduzierte Autoimmunhepatitis (DIH) ist der häufigste hepatische medikamenteninduzierte Hypersensibilisierungsprozess, der bei etwa 9 bis 12% der Patienten mit Autoimmunhepatitis beobachtet wurde. Die überwiegende Mehrheit der Patienten mit DIH sind Frauen. Die zugrunde liegenden Mechanismen dieser Geschlechtsunterschiede in der Prävalenz sind unklar, da Tiermodelle, die menschliche Krankheiten nachahmen, fehlen. Dennoch wird allgemein angenommen, dass zugrunde liegende Mechanismen mit menschlichen Leukozyten-Antigen-Haplotypen und Sexualhormonen in Verbindung gebracht werden. Im Gegensatz dazu haben wir mit einem DIH-Mausmodell herausgefunden, dass IL-4-initiierte CD4 + T-Zellen, die gegen ein Epitop von Cytochrom P450 2E1 gerichtet sind, den Zustrom von Neutrophilen, Makrophagen und Mastzellen in die Lebern weiblicher BALB / c-Mäuse induzieren. Mit diesem Modell haben wir auch gezeigt, dass IL-33-induzierte FoxP3+regulatorische T-Zellen Schutz gegen DIH bei weiblichen und männlichen Mäusen bieten. Dieses DIH-Modell wird durch die Immunisierung von Mäusen mit einem Epitop von CYP2E1 induziert, das kovalent mit einem Arzneimittelmetaboliten verändert wurde, der mit DIH assoziiert wurde. Dieses Epitop wird von Patienten mit DIH erkannt. Unsere Methode induziert robuste und reproduzierbare Hepatitis- und Autoantikörper, die zur Untersuchung der Pathogenese von DIH verwendet werden können. Während In-vivo-Studien bei Mäusen übermäßige Schmerzen und Leiden verursachen können, wenn sie unsachgemäß durchgeführt werden, besteht der Vorteil eines In-vivo-Modells in der Fähigkeit, die Krankheitserregung bei einer großen Anzahl von Mäusen zu bewerten. Zusätzlich können biologische Effekte der veränderten Leberproteine mit invasiven Verfahren untersucht werden. Die Ergänzung des experimentellen Designs um In-vitro-Studien ermöglicht eine schnelle Wiederholung und mechanistische Analyse auf zellulärer Ebene. So werden wir unser Modellprotokoll demonstrieren und wie es verwendet werden kann, um In-vivo- und In-vitro-Mechanismen von DIH zu untersuchen.

Der in Abbildung 1 gezeigte Impfplan, der zur Induktion von DIH verwendet wird, stellt die beiden Impfungen dar, die an der Basis des Halses (Tag 0) und an der Basis des Schwanzes (Tag 7) erforderlich sind. Abbildung 2 zeigt repräsentative Proliferationsdaten, die am Tag 14 unter Verwendung von CFSE als Reaktion auf CYP2E1, JHDN5, das CYP2E1-Epitop und den Trifluoracetyl (TFA)-Metaboliten der Anästhetika erhalten wurden. Abbildung 3...

Wir beschreiben ein in vivo Immunisierungs-, translationales Hepatitis-Modell bei BALB / c-Mäusen, das verwendet werden kann, um die Pathogenese der medikamenteninduzierten Autoimmunhepatitis einschließlich der bei dieser Krankheit beobachteten Geschlechtsunterschiede zu untersuchen. Wir werden beschreiben, wie dieses Modell reproduzierbare Analysen mit experimentellen In-vivo- und In-vitro-Techniken demonstriert.

Induktion der medikamenteninduzierten Autoimmunhepatitis bei BALB/c-Mäusen zur Untersuchung ihrer pathogenen Mechanismen

Drug-induced autoimmune hepatitis (DIH) is the most common hepatic drug-induced hypersensitization process observed in approximately 9 to 12% of patients ...

Lebererkrankungen und Leberzirrhose sind die sechsthäufigste Todesursache bei Erwachsenen zwischen 25 und 64 Jahren. Idiosynkratische DILI, manchmal auch als medikamenteninduzierte, autoimmune oder immunvermittelte Hepatitis bezeichnet, ist die dritthäufigste Ursache für akutes Leberversagen in den Vereinigten Staaten und der häufigste medikamenteninduzierte Hyposensibilisierungsprozess in der Leber. Dieser Prozess tritt bei etwa 9 bis 12 % der Patienten mit Autoimmunhepatitis auf, und diese Form der Hepatitis ist der häufigste Grund, warum ein Medikament vom kommerziellen Markt genommen wird.Die überwältigende Mehrheit der Patienten mit medikamenteninduzierter Hepatitis sind Frauen. Dieses Protokoll beschreibt kritische Merkmale, die bei Patienten beobachtet werden, wie Hepatitis, Autoantikörper und Geschlechtsunterschiede. Der Hauptvorteil dieser Technik ist ihre Reproduzierbarkeit in einem In-vivo-Mausmodell, die den Wissenschaftlern die Möglichkeit gibt, die Entwicklung der Krankheit und ihre Folgen zu beobachten.Mit Hilfe dieses Protokolls entdeckten wir ein gemeinsames Epitop bei Anästhesie- und Virushepatitis, das bei Patienten mit Anästhesiehepatitis ein dominantes Epitop ist und bei Patienten mit Virushepatitis signifikant mit Fibrose assoziiert ist. Wir glauben, dass diese Informationen verwendet werden können, um spezifische diagnostische Tests für medikamenteninduzierte oder virale Hepatitis oder damit verbundene Fibrose zu entwickeln, die hoffentlich Personen mit einem Risiko für die Entwicklung dieser Krankheit oder ihrer Folgen vorhersagen können. Die schriftlichen Techniken können überwältigend sein, da wir immer mehrere Kontrollen und Abwägungen verwenden, um die Reproduzierbarkeit unserer Ergebnisse zu gewährleisten.Wenn Sie das erste Mal das Experiment durchführen, nehmen Sie sich genügend Zeit. Nach dem ersten Durchlauf geht es ziemlich schnell. Nach der Euthanasie der BALB/c-Maus wird der intraabdominale Inhalt mit einer mikrochirurgischen Schere durch einen Mittellinienschnitt freigelegt und ein kleiner Schnitt in der unteren Hohlvene gemacht, um das Blut zu entfernen.Legen Sie dann einen 24-Gauge-Angiokatheter in die Pfortader. Halten Sie das PBS in einem Wasserbad bei vier Grad Celsius und verwenden Sie eine Schlauchpumpe, um die Leber mit 40 Millilitern PBS mit einer Geschwindigkeit von 10 Millilitern pro Minute zu überschwemmen. Lösen Sie die Leber vorsichtig mit einer Mikroschere aus dem Bauch und wiegen Sie die Leber auf einem tarierten Waagschiffchen.Schneide die Leber in kleine 10 bis 15 Millimeter große Stücke. Geben Sie die Leberproben sowie den Homogenisierungspuffer, der viermal so schwer ist wie eine Mausleber, in ein 15-Milliliter-Polypropylen-Röhrchen und ergänzen Sie es mit vollständigen Proteasehemmer-Cocktailtabletten, wie es im Manuskript heißt. Verwenden Sie einen allgemeinen Laborgewebehomogenisator bei mittlerer Geschwindigkeit, um die Proben auf Eis glatt zu homogenisieren.Zentrifugieren Sie die Leberhomogenate bei 1.500 mal G für 10 Minuten und gießen Sie dann das überstehende zytosolische S100 ab. Nach erneuter Zentrifugation bei 100.000 x G frieren Sie das überstehende zytosolische S100 in Trockeneis ein und frieren das Röhrchen bei minus 80 Grad Celsius ein. Um mit der Trifluoracetylierung zu beginnen, tauen Sie den S100 bei Raumtemperatur auf. Dann werden in einem Erlenmeyerkolben 20 Milligramm Maus-S100 bis 10 Milliliter mit entionisiertem Wasser verdünnt.Stellen Sie mit dem pH-Messgerät den pH-Wert mit 1-normalem Kaliumhydroxid auf 10 ein. Geben Sie in einem Abzug 4,7 Millimol S-ETFA in die Lösung. Halten Sie den pH-Wert zwischen 9,9 und 10,0, indem Sie etwa eine Stunde lang 1-normales Kaliumhydroxid in Tröpfchenform verabreichen.Notieren Sie das Gesamtvolumen von Kaliumhydroxid für jede Reaktion. Übertragen Sie die Lösungen in separate Dialysekassetten. Legen Sie die Kassetten in vier Liter entionisiertes Wasser, um 72 Stunden lang mit drei Wechseln pro Tag zu dialysieren.Nach der Dialyse ist das endgültige Volumen des trifluoracetylierten S100 aufzuzeichnen und dann in markierte Röhrchen zu aliquotieren. Die Röhrchen in Trockeneis einfrieren und bei minus 80 Grad Celsius lagern. Wenn die Proteinkonzentration gemäß dem Manuskript bestimmt ist und größer als ein Milligramm pro Milliliter ist, wird ein Milligramm jedes nativen und TFA-veränderten Proteins zu einem Milliliter deionisiertem Wasser in separaten Kugelröhrchen hinzugefügt.Bereiten Sie eine Platzpatrone im Geschossrohr mit einem Milliliter entionisiertem Wasser vor. Geben Sie in eine 96-Well-Platte jeweils 50 Mikroliter des blinden, nativen und veränderten Proteins in doppelter Ausführung. Geben Sie dann 50 Mikroliter 4%ige Natriumbicarbonatlösung, gefolgt von 50 Mikrolitern 0,1%2, 4, 6-Trinitrobenzolsulfonsäure in jede Vertiefung.Inkubieren Sie die Platte zwei Stunden lang bei 40 Grad Celsius. Nach der Inkubation geben Sie 50 Mikroliter 10 % SDS in jede Vertiefung, gefolgt von 25 Mikrolitern 1-normaler Salzsäure. Nach der Immunisierung und Anästhesierung der Maus legen Sie die intraabdominale Höhle mit einer mikrochirurgischen Schere frei.Identifiziere die Milz. Schneiden Sie die Milz am Stiel ab und legen Sie sie in eine Petrischale mit PBS mit 2% fötalem Kälberserum. Um die Zellen zu lösen, klemmt man die Milz zwischen zwei Milchglas-Objektträger und reibt sie aneinander.Verwenden Sie eine elektronische Pipette, um die Zellen in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen aus Polypropylen zu übertragen. Zum Waschen geben Sie PBS mit 2 % FCS in das Röhrchen, um ein Volumen von 50 Millilitern zu erreichen, und zentrifugieren Sie mit einer gekühlten Tischzentrifuge bei 335 mal G. Gießen Sie den Überstand ab und wiederholen Sie den Waschschritt.Geben Sie einen Milliliter ACK-Lysingpuffer in das Röhrchen, um es eine Minute lang zu waschen, um rote Blutkörperchen zu entfernen. Wiederholen Sie dann den FCS-ergänzten PBS-Waschschritt. Nachdem Sie die Zellen 30 Minuten lang mit CFSE markiert haben, fügen Sie 10 Mikrogramm pro Milliliter Cytochrom-P450 2E1, JHDN5 oder trifluoracetyliertes Ovalbumin hinzu, um die markierten Zellen 72 Stunden lang bei 37 Grad Celsius im Inkubator zu stimulieren.Nach der Inkubation färben Sie die Zellen mit CD4, das mit Allophycocyanin markiert ist, im Verhältnis 1:100 für 30 Minuten auf Eis. Nach der Laparotomie der immunisierten Maus, wie im Manuskript beschrieben, wird die Pfortader mit einer 25-Gauge-Nadel kanüliert und dann die untere Hohlvene unterhalb der Nierenvenen durchtrennt. In einem 37 Grad Celsius heißen Wasserbad perfundieren Sie jede Leber mit 40 Millilitern PBS bei einer Durchflussrate von 10 Millilitern pro Minute.Schneiden Sie nach der Perfusion mit einer mikrochirurgischen Schere die Leber am Leberstiel, entfernen Sie die Gallenblase und schneiden Sie dann die Leber am Hilum. Verwenden Sie auf einem 300-Mesh-Edelstahlsieb einen sterilen 20-Milliliter-Spritzenstößel und kaltes PBS, um die Leber zu zerkleinern. Mit dem Sieb filtrieren Sie die resultierende Zellsuspension in vorsterilisierte 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.Bringen Sie jede Suspension mit kaltem PBS auf 50 Milliliter und waschen Sie die Suspension dann 10 Minuten lang durch Zentrifugation bei 370 mal G. Entsorgen Sie den Überstand und mischen Sie dann die Pellets durch Behandlung in neue 50-Milliliter-Röhrchen. Suspendieren Sie die kombinierten Pellets in 45 Millilitern 35% Percoll in PBS und 100 internationalen Einheiten pro Milliliter Heparin. Drehen Sie dann jedes Röhrchen 10 Minuten lang bei 20 Grad Celsius mit dem 500-fachen G.Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in fünf Millilitern PBS und fügen Sie dann jedem Pellet einen Milliliter ACK-Lysingpuffer hinzu und lagern Sie es 10 Minuten lang auf Eis. Nach erneutem Waschen mit PBS durch Zentrifugation bei 370 mal G verwerfen Sie den Überstand und waschen Sie dann die Zellen mit FCS-ergänztem PBS durch Zentrifugation für 10 Minuten bei 370 mal G. Verwenden Sie ein elektronisches Hämozytometer, um die Zellen zu zählen. In diesem Experiment wurden die CD4+T-Zell-Immunantworten mittels Durchflusszytometrie bestimmt.Repräsentative Proliferationsdaten wurden an Tag 14 mittels CFSE als Reaktion auf den Trifluoracetylmetaboliten Cytochrom-P450 2E1 und das Cytochrom-P450 2E1-Epitop JHDN5 gewonnen. Als Kontrollen wurden Vertiefungen ohne Antigen verwendet. Im Vergleich zur Kontrolle entwickelten BALB/c-Mäuse eine Proliferation als Reaktion auf trifluoracetyliertes Ovalbumin und Cytochrom-P450 2E1, aber nicht auf JHDN5.Drei Wochen nach der TFA-Emulgation in der vollständigen Freund-adjuvanten Immunisierung entwickelten weibliche BALB/c-Mäuse im Vergleich zu männlichen BALB/c-Mäusen eine stärker medikamenteninduzierte Autoimmunhepatitis. Auch die histologische Analyse des Lebergewebes zeigt bei weiblichen Mäusen eine schwerere Hepatitis-Entzündung als bei männlichen Mäusen. Die Anzahl der hepatischen CD4+CD8+NK+- und NKT+-Zellen war bei Frauen signifikant höher als bei Männern.Obwohl es keine Unterschiede in den B-Zellen zwischen diesen Mäusen gab Denken Sie daran, dass diese Formulierung trotz eines langen Tages lange hält. Dieses Verfahren kann auch durchgeführt werden, um das Epitop zu trifluoracetylieren. Dieses Verfahren ermöglichte es den Forschern, den zeitlichen Verlauf der Entwicklung von Lebererkrankungen zu analysieren und das Potenzial für neue Entdeckungen von Proteinen und Signalwegen zu erhöhen.S-Ethyltrifluorthioacetat ist giftig und sollte in einem Abzug gehandhabt werden. Darüber hinaus werden gute Laborpraktiken und -techniken dringend empfohlen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video zeigt, wie autoimmune Hypophysitis in SJL Mäusen und wie sie ihre Strenge durch Histopathologie beurteilen zu induzieren.

Induktion der experimentellen autoimmunen Hypophysitis in SJL Mäuse

Infektion von Mäusen mit einem Adenovirus, welches das wesentliche humane Autoantigen Cytochrom P450 2D6 (hCYP2D6) durch Seren von Patienten mit Typ-2-Autoimmun-Hepatitis führt zu einer persistierenden Form der Autoimmun-vermittelten Lebererkrankung, die durch umfangreiche Hepatitis, Fibrose und Erzeugung eines CYP2D6 gekennzeichnet anerkannt -spezifische Immunantwort.

Die CYP2D6-Tiermodell: Wie Autoimmune Hepatitis in Mäusen zu induzieren

Das Video zeigt die Induktion einer experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis in einem Mausmodell durch Injektion einer Kombination aus Myelin-Oligodendrozyten-Glykoproteinen und inaktiviertem Mycobacterium tuberculosis. Das Modell ermöglicht es Forschenden, Krankheitsmechanismen zu untersuchen und therapeutische Interventionen zu testen.

Induktion einer experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis im Mausmodell

In diesem Video wird ein Mausmodell für Multiple Sklerose mit Hilfe der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) erstellt. Der Maus wird eine Emulsion injiziert, die ein neuronales Peptid und ein Adjuvans enthält, wodurch eine Immunantwort ausgelöst wird, die autoreaktive T-Zellen aktiviert. Darauf folgt eine Injektion von Pertussis-Toxin (PTX), um die Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke zu erhöhen, so dass die autoreaktiven T-Zellen das Gehirn infiltrieren können. Diese...

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Induktion von Dickdarmentzündungen bei Mäusen durch adoptiven Transfer von syngenen CD4+CD45RBhohen T-Zellen in T- und B-Zell-defiziente Empfänger. Klinische und histopathologische Merkmale ahmen entzündliche Darmerkrankungen beim Menschen nach. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung des Beginns von Dickdarmentzündungen und des Fortschreitens der Krankheit.

Die Induktion von Murine Darmentzündungen durch adoptiven Transfer von Effektor CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Hoch</sup&gt; T-Zellen in immundefizienten Mäusen

Der Transfer von bm12-Lymphozyten in einen C57BL/6-Empfänger ist ein etabliertes Modell des systemischen Lupus erythematodes. Hier beschreiben wir, wie man mit diesem Modell eine Krankheit auslösen kann und wie man T-follikuläre Helferzellen, Keimzentrum-B-Zellen und Plasmazellen mittels Durchflusszytometrie charakterisiert.

Das BM12 Inducible Modell des systemischen Lupus erythematodes (SLE) in C57BL / 6-Mäuse

Dieses Manuskript beschreibt die Methoden zur Induktion und Bewertung des experimentellen Modells der autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE), zusammen mit der Beurteilung der Immunzellverteilung und der mRNA-Zytokinspiegel in Lymphknoten, Milz, Blut und Rückenmark mittels Durchflusszytometrie bzw. quantitativer PCR in verschiedenen Krankheitsstadien.

Die Induktion der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis bei Mäusen und die Auswertung des Krankheitsabhängige Verteilung von Immunzellen in verschiedenen Geweben

Hier zeigen wir eine enzymatische Annäherung an primären Hepatozyten aus erwachsenen Mäusen zu isolieren, und wir beschreiben die Quantifizierung einer Entzündungsreaktion mittels ELISA und real-time PCR.

Die Induktion einer entzündlichen Reaktion in der Primär Hepatozyten-Kulturen von Mäusen

Hier wird ein Protokoll zur wirksamen Unterdrückung der Hepatitis-B-Virus -Replikation (HBV) bei Mäusen unter Verwendung des Adoptivzelltransfers (ACT) von Stammzell-abgeleitetem viralem Antigen (Ag)-spezifischen T-Lymphozyten vorgestellt. Dieses Verfahren kann für eine mögliche ACT-basierte Immuntherapie der HBV-Infektion angepasst werden.

Stammzell-abgeleitete virale Ag-spezifische T-Lymphozyten unterdrücken HBV-Replikation bei Mäusen

In diesem Protokoll wird ein Darmmikrobiota-Antigen-spezifisches T-Zell-Adoptivtransfer-Kolitis-Modell beschrieben. CD4+ T-Zellen werden aus transgenen CBir1 TCR-Mäusen isoliert. Diese sind spezifisch für ein immundominantes Darmmikrobiota-Antigen CBir1 Flagellin, das in Empfänger-Rag1-/- Mäuse übertragen wird, was zu einer Darmentzündung führt.

Induktion von Darmentzündungen durch adoptive Übertragung von CBir1 TCR transgenen CD4+ T-Zellen auf immundefiziente Mäuse

Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis ist eines der am weitesten verbreiteten murinen Modelle der Multiplen Sklerose. Im aktuellen Protokoll werden C57BL/6J-Mäuse beiderlei Geschlechts mit dem Myelin-Oligodendrozyten-Glykoproteinpeptid immunisiert, was hauptsächlich zu einer aufsteigenden Parese des Schwanzes und der Gliedmaßen führt. Hier besprechen wir das Protokoll der EAE-Induktion und -Auswertung.

Modellierung der Multiplen Sklerose bei beiden Geschlechtern: MOG35-55-induzierte experimentelle Autoimmunenzephalomyelitis

Erfahren Sie die Induktion einer medikamenteninduzierten Autoimmunhepatitis bei BALB/c-Mäusen zur Untersuchung pathogener Mechanismen und Geschlechtsunterschiede. Dieses reproduzierbare In-vivo-Modell ermöglicht die Analyse von Leberpathologie und Immunantworten.

Induktion der medikamenteninduzierten Autoimmunhepatitis bei BALB/c-Mäusen zur Untersuchung ihrer pathogenen Mechanismen

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