Name: Verbesserte Hefe One-Hybrid Screens, Transkriptionsfaktor Bindung an menschliche DNA-Sequenzen zu identifizieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: Lernen Sie das verbesserte Yeast One-Hybrid-Screening zur Identifizierung von Transkriptionsfaktoren, die an menschliche DNA-Sequenzen binden. Diese Hochdurchsatzmethode ermöglicht die gleichzeitige Analyse von über 1.000 TFs.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch die National Institutes of Health [R35-GM128625, J.I.F.B.].

1. Vorbereitungen
<ol><li>
SC −U −H Platten (150 mm Petrischalen) Hinweis: Diese Platten werden für den Anbau von DNA-Köder-Hefestämme verwendet werden.<ol>
<li>Auflösen der Drop-out-Mix, Hefe-Stickstoff-Basis (YNB), Adenin Hemisulfate und Ammoniumsulfat in 920 mL Wasser und pH 5.9 mit 5 M NaOH (ca. 1 mL pro Liter Medien; siehe Tabelle 2 für Komposition). Gießen Sie in eine 2 L Flasche und fügen Sie eine Stir Bar.</li>
		<li>In einem zweiten 2 L Kolben Agar zu 950 mL Wasser hinzufügen (fügen Sie eine Stir Bar Agar in den Autoklaven Überkochen führen wird).</li>
		<li>Autoklaven für 40 min bei 15 Psi auf einem flüssigen Zyklus.</li>
		<li>Gießen Sie sofort den Inhalt der ersten Flasche, einschließlich der Stir Bar in die Küvette mit Agar. Fügen Sie die Glukose, auch auf einem Teller rühren mischen und auf 55 ° C im Wasserbad abkühlen lassen.</li>
		<li>Fügen Sie das Leucin und Tryptophan zu den Medien. Gut auf einem Teller rühren mischen Sie und gießen Sie in sterile Petrischalen 150 mm (~ 80 mL pro Teller). Für 3 – 5 Tage bei Raumtemperatur, trocken in Plastiktüten wickeln und für bis zu 6 Monate bei Raumtemperatur lagern.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
YAPD rechteckigen Platten Hinweis: Diese Platten werden für den Anbau des Rasens für die DNA-Köder-Belastung und für die Paarung mit der TF-Array-Kollektion verwendet.<ol>
<li>Pulver (siehe Tabelle 3 für Komposition), mit Ausnahme von Agar, in 950 mL Wasser in eine 2 L Flasche auflösen und eine Bar unter Rühren hinzufügen.</li>
		<li>In einem zweiten 2 L Kolben Agar zu 950 mL Wasser hinzufügen (fügen Sie eine Stir Bar Agar in den Autoklaven Überkochen führen wird).</li>
		<li>Autoklaven für 40 min bei 15 Psi auf einem flüssigen Zyklus.</li>
		<li>Gießen Sie sofort den Inhalt der ersten Flasche, einschließlich der Stir Bar in die Küvette mit Agar.</li>
		<li>Fügen Sie die Glukose Mischung gut auf einen rühren Teller und Cool bis 55 ° C. Gießen Sie Medien in die rechteckigen Platten (siehe Tabelle der Materialien; ~ 70 mL pro Teller) mit einer peristaltischen Pumpe (5 mL/sec) und einen 6 mm Schlauch. Für 1 Tag bei Zimmertemperatur trocken in Plastiktüten wickeln und in den kalten Raum für bis zu 6 Monate zu speichern. Hinweis: Obwohl die vorgeschlagenen Medienlautstärke 70 mL pro Platte ist, kann 50-80 mL pro Platte verwendet werden. Die drei kritische Punkte zu beachten, wann Gießen Platten 1 sind), dass sie abgeglichen werden, so dass die Agar-Medien die gleiche Dicke in der Platte hat (ein flacher Tisch oder eine Oberfläche für Teller gießen und nicht im Stapel von mehr als sieben Platten Gießen) 2) Sicherstellung der Abwesenheit von Luftblasen im Agar Medien (Bläschen sollte sein tauchte mit einer sterilen Nadel) und 3) die Platten nur für einen Tag trocknen und verpacken die Platten in Plastiktüten zur Fehlervermeidung in Hefe anheften.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
SC −Trp und Sc −U −Trp rechteckigen Platten Hinweis: Diese Platten werden für den Anbau der TF-Array-Sammlung (Sc −Trp) und diploiden Hefe wählen nach der Paarung (Sc −U −Trp) verwendet werden.<ol>
<li>Auflösen der Drop-out-Mix, YNB, Adenin Hemisulfate und Ammoniumsulfat in 920 mL Wasser und pH 5.9 mit NaOH 5M (ca. 1 mL pro Liter Medien) (Zusammensetzung siehe Tabelle 4 ). Gießen Sie in eine 2 L Flasche und fügen Sie eine Stir Bar.</li>
		<li>In einem zweiten 2 L Kolben Agar zu 950 mL Wasser hinzufügen (fügen Sie eine Stir Bar Agar in den Autoklaven Überkochen führen wird).</li>
		<li>Autoklaven für 40 min bei 15 Psi auf einem flüssigen Zyklus.</li>
		<li>Gießen Sie sofort den Inhalt der ersten Flasche, einschließlich der Stir Bar in die Küvette mit Agar. Fügen Sie die Glukose, mischen und auf einem Teller rühren und kühlen bis 55 ° C.</li>
		<li>Fügen Sie das Leucin, Histidin und Uracil (weglassen der Uracil für den Sc −U −Trp Platten).</li>
		<li>Auch auf einem Teller rühren mischen und gießen Sie in rechteckigen Platten (~ 70 mL pro Teller) mit einer peristaltischen Pumpe (5 mL/sec) und 6 mm Schlauch. Für 1 Tag bei Raumtemperatur trocknen, die Platten in Plastiktüten wickeln und in den kalten Raum für bis zu 3 Monaten zu speichern.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
SC −U −H −Trp + 3AT + X-gal rechteckigen Platten Hinweis: diese Platten dienen als Anzeige Platten eY1H Assays.<ol>
<li>Die Drop-out-Mix, YNB, Adenin Hemisulfate und Ammoniumsulfat in 850 mL Wasser auflösen (Zusammensetzung siehe Tabelle 5 ). Tun Sie nicht pH. Gießen Sie in eine 2 L Flasche und fügen Sie eine Stir Bar.</li>
		<li>In einem zweiten 2 L Kolben Agar zu 850 mL Wasser hinzufügen (fügen Sie eine Stir Bar Agar in den Autoklaven Überkochen führen wird).</li>
		<li>Autoklaven für 40 min bei 15 Psi auf einem flüssigen Zyklus.</li>
		<li>Bereiten Sie 10 x BU Salze (1L vor) durch die Kombination von 900 mL Wasser, 70 g Na2HPO4∙7H2O und 34,5 g NaH2PO4∙H2O. Mix mit einer Rühren auflösen Pulver und passen den pH-Wert auf 7,0 mit 5 M NaOH. Fügen Sie Wasser, 1 L und Autoklaven zu bringen.</li>
		<li>Bereiten Sie die X-gal-Lösung durch eine 50 mL-Kunststoff-Rohr mit 42,5 mL Dimethyl Formamid 3,5 g X-gal-Pulver hinzufügen. Dimethyl Formamid, leichter aufzulösen X-gal-Pulver hinzufügen (Dies dauert 30 min). Halten Sie Stammlösung in der Dunkelheit (Verwendung opak 50 ml-Tube oder Abdeckung in Folie). Shop bei-20 ° C.</li>
		<li>Gießen Sie sofort den Inhalt der ersten Flasche, einschließlich der Stir Bar in die Küvette mit Agar. Fügen Sie die Glukose und 10 x BU Salze (siehe Tabelle 5 für Komposition), mischen und auf einem Teller rühren und kühlen bis 55 ° C.</li>
		<li>Fügen Sie das Leucin, 3AT und X-gal (Zusammensetzung siehe Tabelle 5 ).</li>
		<li>Nun auf einem Teller rühren mischen und gießen Sie die rechteckigen Platten (~ 70 mL pro Teller) mit einer peristaltischen Pumpe (5 mL/sec) und einen 6 mm Schlauch. Für 1 Tag bei Zimmertemperatur trocken in Plastiktüten wickeln, und speichern Sie in den kalten Raum in Alu-Folie abgedeckt (3AT und X-gal sind lichtempfindlich) für bis zu 1 Monat.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) Schmierblutungen ein TF-array
<ol><li>
Auftauen der TF-Beute-array
	<ol>
<li>Die Hefe Glycerin Lager Platten mit dem TF-Beute-Array auf Eis auftauen. Hinweis: TF-Beute-Arrays können als zuvor veröffentlichten10,12,13,18generiert werden.</li>
		<li>Aufzuwirbeln Sie die Hefe mit einer 12-Kanal-Pipette innerhalb von 1 – 3 min. vor dem nächsten Schritt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Entdecken die Hefe in Sc −Trp rechteckige Platten
	<ol>
<li>Im HDA-Roboter (siehe Tabelle der Materialien), wählen Sie Multi-well-96-Platten als Quelle, 96 Agarplatten als Ziel und 96 lange Pin-Pads. Hinweis: PIN-Pads sind nicht wiederverwendbar und müssen verworfen werden.</li>
		<li>Wählen Sie das Replizieren viele Programm, zwei Kopien pro 96-Well-Platte zu machen. Verwenden Sie den Papierkorb nicht oder überdenken Sie Optionen zur Vermeidung von hinteren Kontaminationen der gefrorenen Bestände zu.</li>
		<li>Wählen Sie die Option nach oben und unten in der Quelle, die Hefe mischen wirbeln.</li>
		<li>Das gefleckte Array Tasche und inkubieren Sie Agar-Seite bei 30 ° C für 2 – 3 Tage.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Erzeugung von 384 Kolonie Arrays in Sc −Trp rechteckigen Platten
	<ol>
<li>Wählen Sie in der Roboter 96 Agarplatten als Quelle, 384 Nährbodenplatte als Ziel und 96 kurze Pin-Pads.</li>
		<li>Wählen Sie die 1:4-Array -Programm. Auf diese Weise werden die vier 96 Kolonie Platten (jeweils eine unterschiedliche TF) in eine 384 Kolonie Platte konsolidiert. Verwenden Sie den Papierkorb nicht oder überdenken Sie Optionen zur Vermeidung von Kontaminationen zwischen verschiedenen Platten zu.</li>
		<li>Die Platten Tasche und inkubieren Sie die gefleckte 384-Kolonie Array Agar-Seite bei 30 ° C für 2 Tage.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Erzeugung von 1.536 Kolonie Arrays in Sc −Trp rechteckigen Platten Hinweis: Dadurch werden Arrays enthalten vier Kolonien für jedes TF-Beute.<ol>
<li>Wählen Sie in der Roboter 384 Agarplatten als Quelle, 1.536 Agarplatten als Ziel und 384 kurze Pin-Pads.</li>
		<li>Wählen Sie das 1:4 Assay single-Source-Programm. Ziel ist es, jede Kolonie in vier Kolonien Quadruplicates zu kopieren. Verwenden Sie den Papierkorb und überdenken Sie Optionen zu, da es beinhaltet vier Mal jede Kolonie zu kopieren.</li>
		<li>Die Platten Tasche und inkubieren Sie die gefleckte 1536-Kolonie Array Agar-Seite bei 30 ° C für 3 Tage.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Verstärkung der 1.536 Kolonie Array in Sc −Trp rechteckigen Platten
	<ol>
<li>Wählen Sie in der Roboter 1.536 Agarplatten als Quelle, 1.536 Agarplatten als Ziel und 1.536 kurze Pin-Pads.</li>
		<li>Wählen Sie das Replizieren viele Programm, 3 – 4 Kopien zu replizieren. Verwenden Sie den Papierkorb und überdenken Sie Möglichkeit zu, aber werfen Sie das Pad beim Umschalten auf eine andere Platte des Arrays um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.</li>
		<li>Die Platten Tasche und inkubieren der gefleckte 1536-Kolonie Array Agar-Seite sich bei 30 ° C für 3 Tage bis zur Paarung Schritte (siehe unten) verwenden. Danach halten Sie die Platten bei Raumtemperatur und Kopie wieder nach 7 Tagen für eine neue Runde des Screenings.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. eY1H Bildschirm
<ol><li>
DNA-Köder Sorte Rasen vorbereiten, Paarung
	<ol>
<li>Vor Ort die Hefe DNA-Köder-Stämme auf einer Sc −U −H Platte und wachsen für 3 Tage bei 30 ° C.</li>
		<li>Streifen Sie die Hefe in einem 15 cm Sc −U −H Platte mit einem sterilen Zahnstocher, so, dass jede Platte 12 – 16 verschiedene Stämme passt. Inkubieren Sie eines Tages bei 30 ° C.</li>
		<li>Streifen Sie die Hefe in einem 15 cm Sc −U −H Platte mit einem sterilen Zahnstocher, so, dass jede Platte 4 verschiedene Stämme passt. Eines Tages bei 30 ° c inkubieren</li>
		<li>Kratzen Sie die Hefe mit einem sterilen Zahnstocher, und achten Sie nicht auf Schaben Agar und in ein 1,5 Rohr mit 500 µL steriles Wasser.</li>
		<li>Fügen Sie 10 – 15 sterile Glasperlen auf einer rechteckigen Platte YAPD. Fügen Sie die Hefesuspension auf den Teller und kräftig schütteln Sie, in alle Richtungen für 1 min um sicherzustellen, dass die Hefe durch die Platte verteilt ist.</li>
		<li>Umkehren Sie die Platte sofort und tippen Sie auf, so dass die Perlen in den Deckel gehen. Entfernen und die Perlen zu recyceln.</li>
		<li>Die Platten Tasche und inkubieren Agar-Seite nach unten für 1 – 2 Tage bei 30 ° C. Dann fahren Sie mit der Paarung Schritt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Paarung von Hefe DNA-Köder und TF-Array-Stämme
	<ol>
<li>Übertragen Sie das TF-Array zu einer rechteckigen Platte YAPD mit dem Roboter. Wählen Sie die 1.536 Agarplatte als Quelle und Ziel und 1.536 kurze Pin-Pad. Wählen Sie das Replizieren viele Programm. Jeder TF-Array-Platte lässt sich auf 3 – 4 YAPD Platten (abhängig von der Anzahl der Platten in dem Array) zu übertragen. Die TF-Array-Platten verwendet für die Paarung müssen 2 – 3 Tage alt sein, aber nicht mehr als Paarung möglicherweise ineffizient.</li>
		<li>Übertragen Sie den Rasen eines DNA-Köder-Stamm auf die YAPD-Platten bereits mit dem TF-Array mit dem Roboter. Wählen Sie die 1.536 Agarplatte als Quelle und Ziel und 1.536 kurze Pin-Pad. Wählen Sie das Replizieren viele Programm. Verwenden Sie einen zufälligen Offset in der Quelle mit einem Radius von ~0.6 mm um zu vermeiden, Hefe von der gleichen Stelle und mischen auf Ziel Kontakt zwischen Hefestämme zu erleichtern. Verwenden Sie den Rasen mit den DNA-Köder-Stämme (Abschnitt 3.1) als Quelle und die YAPD-Platten mit der TF-Array in Schritt 3.2.1 als Ziel gesichtet.</li>
		<li>Die Platten Tasche und inkubieren Sie Agar-Seite bei 30 ° C für 1 Tag.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Auswahl der diploiden Hefe
	<ol>
<li>Übertragen Sie die begatteten Hefe aus den YAPD Platten auf Sc −U −Trp Platten mit dem Roboter. Wählen Sie die 1.536 Agarplatte als Quelle und Ziel und 1.536 kurze Pin-Pad. Wählen Sie das Programm zu replizieren . Mischen Sie auf Quelle und Ziel.</li>
		<li>Die Platten Tasche und inkubieren Sie Agar-Seite bei 30 ° C für 2 – 3 Tage (längere Inkubationszeit führt zu hohen Hintergrundaktivität Reporter).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Transfer zum Auslesen Platten
	<ol>
<li>Übertragen Sie die diploide Hefe aus den Sc −U −Trp Platten auf Auslesen rechteckigen Platten Sc −U −H −Trp + 5mM 3AT + 0,4 mM X-gal mit dem Roboter. Wählen Sie die 1.536 Agarplatten als Quelle und Ziel und 1.536 kurze Pin-Pad. Wählen Sie das Programm zu replizieren .</li>
		<li>Die Platten Tasche und inkubieren Sie Agar-Seite bei 30 ° C für bis zu 7 Tage.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Darstellung der Anzeige Platten
	<ol>
<li>Fotografieren Sie für DNA-Köder-Sorten mit hoher Hintergrundaktivität Reporter an den Tagen 2, 3 und 4. Andernfalls nehmen Sie Bilder bei Tag 4 und 7. Positive Interaktionen werden durch Wachstum und blaue Farbe der Hefe Kolonien identifiziert und manuell ermittelt werden, oder es kann ermittelt werden, mit Bildanalyse-Software.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Pruneda-Paz, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-scale+resource+for+the+functional+characterization+of+Arabidopsis+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A genome-scale resource for the functional characterization of Arabidopsis transcription factors.</a> Cell Reports. 8 (2), 622-632 (2014).</li>
<li>Burdo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Maize+TFome--development+of+a+transcription+factor+open+reading+frame+collection+for+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">The Maize TFome--development of a transcription factor open reading frame collection for functional genomics.</a> The Plant Journal. 80 (2), 356-366 (2014).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Der hier beschriebene stark Roboter eY1H Paarung Screening Ansatz erhöht den Durchsatz um den Satz von TFs zu identifizieren, die an eine DNA-Region, im Vergleich zu früheren Bibliothek Screening oder angeordneten Screening Ansätze beruhen auf Umwandlung zu binden. Weiter, die TF-DNA-Wechselwirkungen von eY1H, die Tests sehr reproduzierbar sind, da 90 % der Interaktionen erkannt sind positiv für alle vier Kolonien pro TF getestet, und 90 % der Interaktionen testen in einem unabhängigen Bildschirm des gleichen Hefe DNA-Kö...

Ein zentrales Problem im Bereich Biomedizin ist die Mechanismen Bestimmung jedes menschliche gen geregelt. Transkription ist der erste Schritt bei der Kontrolle der gen-Expression-Ebenen, und es wird durch Sätze von Transkriptionsfaktoren (TFs), die einzigartig für jedes Gen reguliert. Angesichts der Tatsache, dass Menschen für kodieren > 1.500 TFs1,2, Ermittlung des vollständigen Satzes von TFs, die der Tätigkeit des einzelnen Gens Steuern bleibt eine offene Herausforderung.
Zwei Arten von Methoden können verwendet werden, um TF-DNA-Wechselwirkungen Karte: TF-zentriert und DNA-zentrierten Methoden3 (Abbildung 1A). In TF-zentrierten Methoden ist eine TF von Interesse für die Bindung genomische DNA-Regionen oder seine DNA-Bindung Spezifität zu ermitteln sondiert. Diese Methoden umfassen Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) gefolgt von Hochdurchsatz-Sequenzierung, Protein Bindung Microarrays und SELEX4,5,6. In DNA-zentrierten Methoden ist eine DNA-Sequenz des Interesses sondiert, um den Satz von TFs zu bestimmen, die an der DNA-Sequenz binden. Die am häufigsten angewandte solcher Methoden ist Hefe One-Hybrid (Y1H) Tests, in denen, die Interaktionen zwischen TFs und DNA-Regionen im Milieu der Nucleus Hefe mit Reporter Gene7,8,9getestet werden.
Y1H-Assays umfassen zwei Komponenten: als "DNA-Köder" (z.B., Promotoren, Enhancer, Schalldämpfer, etc.) und eine "TF-Beute," die Reporter-Gen Aktivierung9,10 (Abbildung 1 b) gezeigt werden kann. Der DNA-Köder wird geklont, stromaufwärts von zwei Reporter Gene (LacZ und HIS3) und beide DNA-bait::reporter-Konstrukte sind integriert Hefegenoms generieren chromatinized "DNA-Köder Stämme." Die TF-Beute, codiert in ein Plasmid, das einen TF verschmolzen mit der Aktivierungsdomäne (AD) der Hefe Gal4 TF ausdrückt wird in die DNA-Köder Sorte Fisch für TF-DNA-Wechselwirkungen eingeführt. Wenn die TF-Beute an die DNA-Köder-Sequenz bindet, wird die Anzeige in der TF-Beute vorhanden zur Aktivierung der beiden Reporter-Gene führen. Infolgedessen, können Zellen mit einem positiven Interaktion für Wachstum auf Tellern Histidin fehlt, als auch als kompetitiver Inhibitor, 3-Amino-1,2,4-Triazol (3-AT) die Überwindung ausgewählt und als blauen Kolonien im Beisein von X-gal visualisiert werden. Weil die potente Hefe Gal4 AD dient, Y1H Assays können Interaktionen mit transcriptional Aktivatoren sowie Repressoren erkennen. Darüber hinaus angesichts der Tatsache, dass TF-Beute aus einem starken Hefe-Promotor (ADH1) ausgedrückt werden, können Wechselwirkungen auch für TFs erkannt werden, die geringe endogene Expression Ebenen, die herausfordern, um von ChIP11,12zu erkennen.
Die meisten veröffentlichten Protokolle für die Durchführung von Y1H Assays basieren auf DNA-Köder Hefestämme TF-Beute einzuführen, durch die Umwandlung von gepoolter TF-Beute-Bibliotheken, gefolgt von Auswahl, Kolonie, die Kommissionierung und Sequenzierung den interagierenden TF identifizieren, oder durch Umwandlung einzelner klont8,9. Dies sind zeitraubende Protokolle, Beschränkung der Anzahl von DNA-Sequenzen, die pro Forscher getestet werden können. Eine jüngste Verbesserung der Y1H-Assays, genannt verstärkt Y1H (eY1H), die Screening-Durchsatz mit einer high-Density Arrays (HDA) Roboterplattform Hefestämme DNA-Köder mit einer Sammlung von Hefestämme jeweils mit dem Ausdruck einer anderen Paaren sprunghaft angestiegen TF-Beute10,13 (Abbildung 1). Diese Bildschirme beschäftigen ein 1.536 Kolonie Format erlaubt, die meisten menschlichen TFs in vervierfacht mit nur drei Platten zu testen. Weiter, angesichts der Tatsache, dass TF-DNA-Wechselwirkungen in gewissem Sinne paarweise getestet werden, ermöglicht dieser Ansatz für den Vergleich von Interaktionen zwischen DNA-Köder (z. B. zwei forensisches Einzel-Nukleotid-Varianten) und zwischen verschiedenen TFs oder TF Varianten11,12 ,14.
Mit eY1H-Assays, haben wir den größten menschlichen und Caenorhabditis Elegans DNA-zentrierten TF-DNA-Wechselwirkungen Netzwerke bis dato abgegrenzt. Insbesondere haben wir 2.230 Interaktionen zwischen 246 menschlichen Entwicklungs-Enhancer und 283 TFs12gekennzeichnet. Darüber hinaus haben wir eY1H Assays aufzudecken veränderten TF Bindung an 109 Einzel-Nukleotid forensisches Varianten zugeordnet Erbkrankheiten wie Entwicklungsstörungen Fehlbildungen, Krebs und neurologische Erkrankungen eingesetzt. Vor kurzem haben wir eY1H ein Netzwerk bestehend aus 21.714 Interaktionen zwischen 2.576 C. Elegans gen Promotoren und 366 TFs11abzugrenzen. Dieses Netzwerk wurde die funktionale Rolle der Dutzende von C. Elegans TFs aufzudecken.
Die Protokolle zum DNA-Köder Flecken zu generieren und die Ebenen der Reporter Hintergrundaktivitäten zu bewerten gewesen berichtet an anderer Stelle15,16,17. Hier beschreiben wir eine eY1H-Pipeline, die verwendet werden kann, menschlichen genomische DNA-Region gegen eine Reihe von 1.086 menschlichen TFs auf den Bildschirm. Sobald eine Hefe DNA-Köder Belastung entsteht und eine TF-Beute-Array wird auf die entsprechenden Platten entdeckt, kann das gesamte Protokoll innerhalb von zwei Wochen (Tabelle 1) durchgeführt werden. Noch wichtiger ist, kann das Protokoll parallelisiert werden, so dass ein einzelner Forscher 60 DNA-Köder-Sequenzen gleichzeitig Bildschirm kann. Um das Protokoll zu demonstrieren, haben wir die Veranstalter der beiden Zytokin-Gene CCL15 und IL17F überprüft. Darüber hinaus zeigen wir Ergebnisse aus gescheiterten Bildschirme zu veranschaulichen die Arten von Problemen, die auftreten können, bei der eY1H-Assays und wie sie zu beheben.

<table><tbody><tr><td>3-Amino-1,2,4-triazol (3AT) ~95 % TLC</td><td>Sigma</td><td>A8056-100G</td><td>Kompetitiver Inhibitor für Produkte des HIS3-Gens</td></tr><tr><td>Adeninsulfat (Hemisulfat), Dihydrat</td><td>US Biologicals</td><td>A0865</td><td>Erforderlich für ein ordnungsgemäßes Hefewachstum</td></tr><tr><td>Agar Hohe Gelstärke - Bakteriologische Qualität</td><td>American International</td><td>Chemical AGHGUP</td><td>Nährmedien für das Hefewachstum</td></tr><tr><td>Ammoniumsulfat</td><td>US Biologicals</td><td>A1450</td><td>Stickstoffquelle in synthetischen Hefemedien</td></tr><tr><td>D+ Glukose wasserfrei</td><td>US Biologicals</td><td>G3050</td><td>Erforderlich für das Hefewachstum</td></tr><tr><td>Drop-Out-Mix minus His, Leu, Tryp und Uracil, adeninreich ohne Hefestickstoffbasis</td><td>US Biologicals</td><td>D9540-02</td><td>Synthetisches komplettes Medium für Hefewachstumsrand</td></tr><tr><td>erforderlich Multiparameter-pH-Messgerät</td><td>Hanna Instruments</td><td>HI2020-01</td><td>Zur Messung des pH-Werts von selektiven Medien</td></tr><tr><td>Flache Zahnstocher 750 ct</td><td>Diamant</td><td></td><td>Zum Streifen von Hefen auf Petrischalen</td></tr><tr><td>Glasperlen</td><td>Walter Stern</td><td>100C</td><td>Zum Vernichten von Hefe bei der Herstellung von Rasen</td></tr><tr><td>Glycerin &ge; 99%</td><td>Millipore Sigma</td><td>G9012-1L</td><td>Erforderlich für die Herstellung von gefrorenen Hefebrühen</td></tr><tr><td>L-Histidin</td><td>US Biologicals</td><td>H5100</td><td>Für die Selektion des Hefewachstums in selektiven</td></tr><tr><td>Medien L-Leucin</td><td>US Biologicals</td><td>L2020-05</td><td>Für die Selektion des Hefewachstums in selektiven</td></tr><tr><td>Medien L-Tryptophan</td><td>Sigma</td><td>T-0254</td><td>Für die Selektion des Hefewachstums in selektiven</td></tr><tr><td>Medien N, N-Dimethylformamid</td><td>Sigma</td><td>319937-1L</td><td>Zur Herstellung von X-Gal-Lösung</td></tr><tr><td>Omnipense Elite</td><td>Wheaton</td><td>W375030-A</td><td>Zum Dosieren präziser Medienmengen in Singer-Platten</td></tr><tr><td>Pepton, bakteriologisch</td><td>American International Chemical</td><td>PEBAUP</td><td>Proteinquelle, die für das Hefewachstum erforderlich</td></tr><tr><td>ist Petrischale, 150 mm x 15 mm</td><td>VWR</td><td>10753-950</td><td>Für den Anbau von Hefeködern für </td></tr><tr><td>Siebung PlusPlates</td><td>Singer Instruments</td><td>PLU-003</td><td>Zur Herstellung von rechteckigen Agarplatten zur Verwendung mit dem Singer Robot</td></tr><tr><td>Precision Niedertemperatur-BSB-Kühlinkubator</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>PR205745R</td><td>Zur Inkubation von Hefeplatten bei konstanter Temperatur</td></tr><tr><td>RePads 1.536 kurz</td><td>Singer Instruments</td><td>REP-005</td><td>Zur Übertragung des TF-Beute-Arrays, der Paarung der Hefe und der Übertragung der Hefe auf diploide Selektions- und Ausleseplatten</td></tr><tr><td>RePads 384 kurz</td><td>Singer Instruments</td><td>REP-004</td><td>Zur Übertragung des TF-Beute-Arrays von 384 auf das 1.536er Kolonieformat</td></tr><tr><td>RePads 96 lang Singer</td><td>Instruments</td><td>REP-001</td><td>Zur Übertragung des TF-Beute-Arrays vom Glycerinstamm auf die Agarplatte</td></tr><tr><td>RePads 96 kurz</td><td>Singer Instruments</td><td>REP-002</td><td>Zum Transfer von TF-Beute-Arrays vom Kolonieformat 96 auf 384</td></tr><tr><td>Singer HDA RoToR-Roboter</td><td>Singer Instruments</td><td></td><td>Für den Transfer von Hefe im Hochdurchsatz</td></tr><tr><td>Natriumhydroxid (Pellets/Certified ACS)</td><td>Fisher</td><td>S318-1</td><td>Zur Einstellung des pH-Werts von selektiven Medien</td></tr><tr><td>Natriumphosphat zweibasisches Heptahydrat</td><td>Santa Cruz Biotechnologie</td><td>sc-203402C</td><td>Erforderlich für die LacZ-Reporteraktivität auf X-gal&nbsp;</td></tr><tr><td>Monobasisches Natriumphosphat-Monohydrat</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-202342B</td><td>Erforderlich für die LacZ-Reporteraktivität auf Röntgen</td></tr>;<tr><td>Uracil</td><td>Sigma</td><td>U0750-100G</td><td>Für die Selektion des Hefewachstums in selektiven Medien</td></tr><tr><td>X-gal (5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-beta-Dgalactopyranosid)</td><td>Gold Biotechnology</td><td>X4281C100</td><td>&beta;-Galactosidase färbt farbloses X-Gal blau, um Protein-DNA-Wechselwirkungen zu erkennen</td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>US Biologicals</td><td>Y2010</td><td>Nahrhaftes Medium für das Wachstum und die Vermehrung von Hefe</td></tr><tr><td>Hefe Stickstoff Base (Pulver) ohne AA, Kohlenhydrate und ohne AS&nbsp;</td><td>US Biologicals</td><td>Y2030</td><td>Erforderlich für ein kräftiges Hefewachstum</td></tr></tbody></table>

verbesserte hefe one-hybrid screens, transkriptionsfaktor bindung an menschliche dna-sequenzen zu identifizieren

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

Die Sätze von Transkriptionsfaktoren (TFs), die jedem menschlichen Gens regulieren zu identifizieren, ist eine schwierige Aufgabe, die erfordert zahlreiche experimentelle und rechnerische Ansätze zu integrieren. Eine solche Methode ist die Hefe ein-Hybrid (Y1H) Assay, in welche, die Wechselwirkungen zwischen TFs und DNA-Regionen im Milieu der Nucleus Hefe mit Reporter-Gene getestet werden. Y1H-Assays umfassen zwei Komponenten: als "DNA-Köder" (z.B.., Promotoren, Enhancer, Schalldämpfer, etc.) und eine "TF-Beute," die auf Reporter Genaktivierung untersucht werden kann. Die meisten veröffentlichten Protokolle für die Durchführung von Y1H-Bildschirme basieren auf TF-Beute Bibliotheken oder Arrays in DNA-Köder Hefestämme zu verwandeln. Hier beschreiben wir eine Pipeline, verbesserte Y1H genannt (eY1H) Tests, wo TF-DNA-Wechselwirkungen verhört werden, bei der Paarung DNA-Köder-Stämme mit einer angeordneten Sammlung von TF-Beute Stämme mit einem high-Density-Array (HDA) Roboter-Plattform, mit der Vorführung in einem 1.536 Kolonie-Format. Dies ermöglicht eine drastische Zunahme der Durchsatz (60 DNA-Köder-Sequenzen gegen > 1.000 TFs dauert zwei Wochen pro Forscher) und Reproduzierbarkeit. Wir illustrieren die verschiedenen Arten von erwarteten Ergebnissen von Tests menschlichen Promotorsequenzen gegen eine Reihe von 1.086 menschlichen TFs, sowie Beispiele für Probleme, die während der Bildschirme und wie man sie beheben können.

Drei wesentliche Faktoren berücksichtigt werden, wenn Analyse ergibt sich aus eY1H Assays: Reporter Hintergrundaktivität des DNA-Köder-Stammes, die Stärke der Reporter Aktivität entsprechend TF-DNA-Wechselwirkungen und die Anzahl der positiven Kolonien. Der Reporter Hintergrundaktivität (d. h. Autoactivity) der DNA-Köder Belastung bezieht sich auf das Wachstum und die Farbe der Hefe Kolonien auf der Platte auslesen, auch in Abwesenheit des TF-Beute. Im Idealfall nicht Autoactive Stämme zeigen eine weiße oder helle braune...

Hier präsentieren wir Ihnen eine erweiterte Hefe One-Hybrid screening Protokoll um den Transkriptionsfaktoren (TFs) zu identifizieren, die an einer menschlichen DNA-Region of Interest binden können. Diese Methode nutzt eine Hochdurchsatz-Screening-Pipeline, die die Bindung von Verhören kann > 1.000 TFs in einem einzigen Experiment.

Verbesserte Hefe One-Hybrid Screens, Transkriptionsfaktor Bindung an menschliche DNA-Sequenzen zu identifizieren

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

Das Ziel verbesserter Hefe-Ein-Hybrid-Assays ist die Identifizierung der Transkriptionsfaktoren, die an eine DNA-Sequenz von Interesse binden. Der Vorteil dieser Technik ist, dass verbesserte Hefe-Ein-Hybrid-Assays mehr als 1000 Transkriptionsfaktoren in einem einzigen Experiment bewerten können. Umgekehrt wertet die Chromatin-Immunpräzipitation jeweils nur einen Transkriptionsfaktor aus.Diese Methode stellt ein Schlüsselinstrument für die funktionelle Genomik dar, um das Repertoire an Transkriptionsfaktoren zu identifizieren, die an Genpromotoren und Enhancer binden, und um veränderte Transkriptionsfaktoren zu identifizieren, die an nicht-kodierende Varianten binden. Demonstrieren datär das Verfahren wird Dr.Xing Liu ein Postdoc aus meinem Labor sein. Die Hefeglycerin-Stockplatten mit dem TF-Beutearray auf Eis auftauen.Setzen Sie die Hefe mit einer 12-Kanal-Pipette wieder auf und fahren Sie innerhalb von 1 bis 3 Minuten mit dem nächsten Schritt fort. Um die Hefe in Sc minus Tryptophan rechteckige Platten zu erkennen, verwenden Sie einen High-Density-Array-Roboter, um Multiwell 96 Platten als Quelle, 96 Agar-Platten als Ziel und 96 lange Pin-Pads auszuwählen. Pinpads sind nicht wiederverwendbar und sollten verworfen werden.Wählen Sie das Spot Many-Programm, um zwei Kopien pro 96 Well-Platte zu machen. Verwenden Sie die Recycling- oder Wiederaufsuchungsoptionen nicht, um eine Rückkontamination der gefrorenen Bestände zu vermeiden. Wählen Sie außerdem die Option zum Auf- und Abwirbeln in der Quelle aus, um die Hefe zu mischen.Befolgen Sie die Anweisungen, wo und wann die Platten zu platzieren und lassen Sie den Roboter die Hefe in Sc minus Tryptophan rechteckige Platten zu erkennen. Sack das gefleckte Array und bebrüten es Agar Seite bis bei 30 Grad Celsius für 2 bis 3 Tage. Um 384 Kolonie-Arrays in Sc minus Tryptophan rechteckigen Platten zu generieren, wählen Sie 96 Agar-Platten als Quelle, 384 Agar-Platte als Ziel und 96 kurze Pin-Pads.Wählen Sie dann das 1:4-Array-Einzelquellprogramm aus. Auf diese Weise werden vier 96 Kolonieplatten zu einer 384 Kolonieplatte zusammengefasst. Verwenden Sie nicht die Recycling- oder Wiederaufsuchoptionen, um Eine Kontamination zwischen verschiedenen Platten zu vermeiden.Sack die Teller und bebrüten die gefleckte 384 Kolonie Array Agar Seite bis bei 30 Grad Celsius für 2 Tage. Um 1536 Kolonie-Arrays in Sc minus Tryptophan rechteckigen Platten zu generieren, wählen Sie 384 Agar-Platten als Quelle, die 1536 Agar-Platten als Ziel und 384 kurze Pin-Pads. Wählen Sie dann das 1:4-Assay-Einzel-Quellprogramm aus.Das Ziel ist es, jede Kolonie in vier Kolonien zu kopieren, um Vierbeiner zu erhalten. Verwenden Sie die Recycling- und Wiederholungsoptionen, da dies das Kopieren jeder Kolonie 4 Mal beinhaltet. Folgen Sie den Anweisungen des Roboters und lassen Sie den Roboter die Hefe in die Platten vor dem Absacken und Inkubieren der gefleckten 1536 Kolonie Array Agar Seite bis zu 30 Grad Celsius für 3 Tage zu erkennen.Um das Kolonie-Array von 1536 in Sc minus Tryptophan-Rechteckplatten zu verstärken, wählen Sie 1536 Agarplatten als Quelle, 1536 Agarplatten als Ziel und 1536 kurze Pin-Pads. Wählen Sie das Programm "Viele replizieren", um 3 bis 4 Kopien zu replizieren. Verwenden Sie die Option "Recycling und Erneutbesuch", aber werfen Sie das Pad heraus, wenn Sie zu einer anderen Platte des Arrays wechseln, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.Erlauben Sie dem Roboter, das 1536 Kolonie-Array in Sc minus Tryptophan rechteckige Platten zu verstärken. Schließlich packen Sie die Teller und inkubieren Sie die gefleckte 1536 Kolonie Array Agar Seite bis bei 30 Grad Celsius für 3 Tage für die Paarung Schritte zu verwenden. Um die DNA-Köder-Rasen für die Paarung vorzubereiten, erkennen Sie die DNA-Hefeköderstämme auf einem Sc minus Uracil und Histidin-Platte und wachsen für 3 Tage bei 30 Grad Celsius.Die Hefe mit einem sterilen Zahnstocher in einen 15 Zentimeter großen Sc minus Uracil und seine Tidinplatte einstreichen lassen, so dass jede Platte 12 bis 16 verschiedene Sorten anpasst. Bebrüte die Platte eines Tages bei 30 Grad Celsius. Am nächsten Tag, streifen Sie die Hefe in eine 15 Zentimeter Sc minus Uracil und Histidin Platte mit einem sterilen Zahnstocher, so dass jede Platte passt 4 verschiedene Stämme.Bebrüte die Platte für einen Tag bei 30 Grad Celsius. Nach der Inkubation, kratzen Sie die Hefe mit einem sterilen Zahnstocher, um sicherzustellen, dass kein Agar kratzen. Fügen Sie die Hefe in eine 1,5 Milliliter Tube mit 500 Mikroliter sterilem Wasser.Fügen Sie nun 10 bis 15 sterile Glasperlen und die Hefesuspension auf eine yAPD rechteckige Platte. Schütteln Sie gründlich in alle Richtungen für eine Minute, um sicherzustellen, dass die Hefe über die Platte verteilt ist. Umkehren Sie die Platte sofort, und tippen Sie, so dass die Perlen auf den Deckel gehen.Entfernen und recyceln Sie die Perlen. Sack die Teller und bebrüten sie Agar Seite nach unten für 1 bis 2 Tage bei 30 Grad Celsius. Fahren Sie dann mit dem Paarungsschritt fort.Um die Hefe-DNA-Köder und TF-Array-Stämme zu paaren, übertragen Sie das TF-Array mit dem Roboter auf eine rechteckige YAPD-Platte. Wählen Sie die 1536 Agar-Platte als Quelle und Ziel und das kurze Pin-Pad 1536 aus. Wählen Sie das Programm Viele replizieren aus.Wählen Sie 4 Quellplatten und die Recycling- und Revisit-Optionen aus. Jede TF-Arrayplatte kann verwendet werden, um 3 bis 4 YAPD-Platten zu übertragen. Die TF-Arrayplatten, die zur Paarung verwendet werden, müssen 2 bis 3 Tage alt sein, aber nicht mehr, da die Paarung ineffizient sein kann.Um den Rasen eines DNA-Köderstamms auf die YAPD-Platten zu übertragen, die bereits das TF-Array enthalten, wählen Sie die 1536 Agar-Platte als Quelle und Ziel und das 1536 kurze Pinpad aus. Wählen Sie das Programm Viele replizieren aus. Verwenden Sie einen zufälligen Offset in der Quelle mit einem Radius von etwa 0,6 Millimetern, um zu vermeiden, dass Hefe von derselben Stelle genommen wird, und wählen Sie Mix on Target aus, um den Kontakt zwischen Hefestämmen zu erleichtern.Verwenden Sie den Rasen mit den DNA-Köderstämmen als Quelle und die YAPD-Platten, die das gefleckte TF-Array enthalten, als Ziel, bevor Sie die Platten einsacken und sie einen Tag lang bei 30 Grad Celsius auf der Agarseite bebrüten. Für die Auswahl der diploiden Hefe wählen Sie die 1536 Agar-Platte als Quelle und ziel, und wählen Sie das 1536 kurze Pin-Pad. Wählen Sie das Replikationsprogramm aus.Wählen Sie Mix auf Quelle und auf Ziel. Erlauben Sie dem Roboter, die gepaarte Hefe von den YAPD-Platten auf die Sc minus uracil und Tryptophan-Platten zu übertragen, bevor er die Platten absackt und sie 2 bis 3 Tage lang bei 30 Grad Celsius auf der Agarseite bebrütet. Wählen Sie nun die 1536 Agarplatten als Quelle und Ziel und das 1536 kurze Pinpad aus.Wählen Sie das Replikationsprogramm aus. Übertragen Sie die diploide Hefe von den Sc minus uracil und Tryptophan Platten auf die auslesenrechteckigen 3-AT und X-gal enthaltenplatten mit dem Roboter. Sack die Teller und bebrüten sie Agar Seite bis bei 30 Grad Celsius für bis zu 7 Tage.Für DNA-Köderstämme mit hoher Hintergrund-Reporteraktivität, fotografieren Sie an den Tagen 2, 3 und 4. Ansonsten fotografieren Sie an den Tagen 4 und 7. Bewahren Sie die TF-Arrayplatten bei Raumtemperatur auf und kopieren Sie sie nach 7 Tagen erneut für eine neue Screening-Runde.Um die Art der Ergebnisse zu veranschaulichen, die mit verbesserten Ein-Hybrid-Assays für Hefe erzielt werden können, wurden die Promotorregionen der Gene CCL15 und IL17F mit einer Reihe von 1086 menschlichen TFs abgeschirmt. Der CCL15-Promotor ist ein Beispiel für einen nicht-autoaktiven DNA-Köder, bei dem Wechselwirkungen, auch schwache, leicht erkannt werden können. Der IL17F-Promoter ist ein Beispiel für einen autoaktiven DNA-Köder mit ungleichmäßiger Hintergrundreporteraktivität, bei dem einige Interaktionen nachgewiesen werden können, während bei mehreren TFs ungewiss ist, ob die Reporteraktivität höher als der Hintergrund ist.Es gibt mehrere Probleme, die auftreten können, wenn verbesserte Hefe-Ein-Hybrid-Assays durchführen. In diesem Fall sind Kolonien zu klein und konnten nicht übertragen werden. In der Regel weisen etwa 95 % der TF-Beutekolonien ein normales Wachstum auf.In diesem Beispiel gibt es kein Hefewachstum in einem Teil der Platte. Dieses Problem hängt in der Regel mit einem Fehler im Paarungsschritt zusammen, wenn das 1536-Pinpad keinen Kontakt mit der Hefe im DNA-Köder-Stammrasen, im TF-Array oder in der Steckplatte herstellen kann. In diesen beiden Beispielen werden keine Interaktionen erkannt.Dieses Problem hängt oft mit unbeabsichtigten inaktivierenden Mutationen in den Reportergenen, insbesondere LacZ, oder mit zu hoher Autoaktivität zusammen, die Wechselwirkungen maskiert. In diesem Fall zeigt die Platte zufällige blaue Flecken, die oft mit bakteriellen Verunreinigungen zusammenhängen. Das Wichtigste ist die richtige Plattenvorbereitung.Stellen Sie sicher, dass alle Komponenten hinzugefügt werden und dass die Agarhöhe einheitlich ist, da alle nachfolgenden Schritte davon abhängen. Obwohl die meisten Reagenzien nicht gefährlich sind, ist es wichtig, jederzeit Handschuhe zu tragen, um eine Kontamination der Proben und Platten zu vermeiden. Wie bei jedem DNA-Bindungstest ist es wichtig, die identifizierten Wechselwirkungen mit funktionellen Assays wie Reporter-Assays, Transkriptionsfaktor-Knockdown oder Knockout zu validieren, gefolgt von der Messung der Expression des Zielgens.Diese Methode ermöglichte die Identifizierung von Transkriptionsfaktoren, die Gene regulieren, die an bestimmten biologischen Prozessen beteiligt sind, sowie Transkriptionsfaktoren mit alternativer Bindung an nicht-kodierende krankheitsassoziierte Varianten.

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