Name: Intramucosal Impfung des Plattenepithelkarzinom Zellen in Mäusen für Tumor immun Profilierung und Behandlung Antwort Bewertung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Erfahren Sie die orthotope Implantation von Plattenepithelkarzinomzellen bei Mäusen zur Untersuchung des Tumormikromilieus und Behandlungsresistenzen. Dieses Modell zeigt klinisch relevante Symptome wie humane Erkrankungen.

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Alle tierische Verfahren wurden nach einem genehmigten institutionelle Tier Pflege und Verwendung Ausschuss (IACUC) Protokoll von der University of Colorado Denver (Protokoll Nr. 00250) durchgeführt.
1. Tumor Zellkultur
Hinweis: B4B8 und LY2 Zelllinien wurden zur orthotopen lokal Tumoren zu generieren: B4B8 Tumorzellen stammen aus Karzinogen-transformierten Schleimhaut Keratinozyten (von BALB/C Mäuse)11. LY2 Tumorzellen stammen aus Lymphknoten-Metastasen von einem spontan transformierte BALB/C Keratinozyten Linie (Pam 212)12,13. Beide Zelllinien wurden freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. Nadarajah Vigneswaran (UTHealth, Houston, TX, USA).
<ol><li>Verwendung Dulbecco geändert Adlers mittlere (DMEM) F/12 mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) und 1 % antimikrobielle Reagenz für die Zelle Linie Wartung ergänzt. Diese Zell-Linien in einem sterilen Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2zu erhalten. Zellen sollten für die Impfung vor mehr als 15 Passagen verwendet werden.</li>
	<li>Platte 2 x 106 bis 4 x 106 Zellen in 175 cm2 Zellkulturflaschen. Hinweis: Sicherzustellen, dass die Zellen weniger als 90 % Zusammenfluss, induzieren eine Stress-Reaktion zu vermeiden.</li>
	<li>Wenn die Zellen sind 70 % Zusammenfluss (~ 48 h), den Kolben aus dem Inkubator zu entfernen und waschen Sie die Zellen 3 X mit kalten Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS).</li>
	<li>Lösen Sie die Zellen aus der Flasche mit 0,25 % Trypsin, genug um die Oberfläche der Platte zu decken.<ol>
<li>Dazu 4 mL Trypsin in einem 175 cm2 Kolben mit 70 % konfluierende Zellen zu verzichten. Inkubation der Zellen mit Trypsin für 3 – 4 min. in die Zelle Kultur Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2.</li>
		<li>Visualisieren Sie die Zellen unter dem Mikroskop zu Zelle Loslösung zu gewährleisten.</li>
		<li>Fügen Sie 12 mL DMEM F/12 Medien mit FBS Trypsin Aktivität zu neutralisieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aspirieren Sie die Zellsuspension und legen Sie es in ein 50 mL konische Röhrchen.</li>
	<li>Schütteln Sie das Röhrchen mit der Zellen durch invertieren sie 3 x-4 X.</li>
	<li>Optional mischen Sie eine aliquote 10 µL Zellsuspension mit 10 µL Trypan blau in einem Microcentrifuge Schlauch und zählen Sie die Zellen mit einem Hemocytometer. Bestimmen Sie Zellviabilität durch Subtraktion der Zahl der Trypan-blau-positiven Zellen von der Gesamtzahl der Zellen zu und teilen Sie durch die Gesamtzahl der Zellen.</li>
	<li>Zentrifugieren der Zellsuspension bei 300 X g für 5 min bei 4 ° C.</li>
	<li>Aufschwemmen der Zellen in serumfreien und antibiotikafreien DMEM bei einem entsprechenden Volumen, so dass 1 x 106 Zellen in 50 µL Medien vorhanden sind. Hinweis: Basierend auf der in-vivo Zelle Zeile Aggressivität (empirisch ermittelt), 1 x 106 Zellen pro Injektionsstelle per Mausklick war angemessen für B4B8 und LY2 Zellen.</li>
	<li>Legen Sie das Fläschchen mit der Zellsuspension auf Eis.</li>
	<li>Legen Sie die vorher aufgetaut Basalmembran Matrix auf Eis. Hinweis: Die Basalmembran Matrix wurde bei 4 ° c über Nacht aufgetaut.</li>
</ol>(2) Zelle Injektion in Mäuse
<ol><li>Bereiten Sie eine 1:1 Mischung von Zellen: Keller Membran Matrix (50 µL).</li>
	<li>Zuerst die Zellen hinzufügen; dann allmählich pipette die Basalmembran-Matrix. Einführung von Luftblasen zu vermeiden. Stellen Sie sicher, dass die Mischung sofort vor den tierischen Injektion erfolgt. Hinzufügen von Zellen zu Basalmembran Matrix für einen längeren Zeitraum hinweg kann in Zelle der Matrix-Mischung, die die Mischung gründlich schütteln erschwert sich einleben führen. Dadurch wird eine erhebliche Variabilität in Größe des Tumors zwischen Mäusen.</li>
	<li>Mischen Sie vorsichtig. Stellen Sie sicher, dass alle Schritte mit Matrix auf Eis durchgeführt werden. Basalmembran Matrix wird bei Raumtemperatur polymerisieren.</li>
	<li>Inokulation Spritzen vorbereiten.</li>
	<li>0,5 mL Insulinspritzen (23 G) mit 100 µL der Zelle/Keller-Membran-Matrix-Lösung zu laden.</li>
	<li>Halten Sie die Spritzen auf Eis, Basalmembran Matrix Polymerisation zu vermeiden.</li>
	<li>Mäuse zu betäuben, indem man sie in eine Kammer mit Isofluran und Sauerstoff (2,5 %).</li>
	<li>Sicherstellen Sie, dass die Mäuse tief betäubt sind, vor der Durchführung der Injektion (dadurch ein Ausbleiben einer Reaktion auf eine Zehe Prise).</li>
	<li>Stechen Sie die Nadel in der rechten oder linken bukkal Region. Dies erfolgt durch den verfügbaren Freiraum auf beiden Seiten des Mundes.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass die Maus Zunge nicht im Weg ist. Hinweis: Es ist leicht auf die Zunge, stecken die Zunge Tumoren führt. Wenn nötig, verschieben Sie die Zunge auf die gegenüberliegende Seite.</li>
	<li>Halten Sie die Spritze parallel zu der bukkalen Bereich während innerhalb der Mundhöhle.</li>
	<li>Wenn Sie bereit sind, zu injizieren, ziehen Sie die Spritze zurück und legen Sie die Spritze langsam in einem Winkel von 10°.</li>
	<li>Injizieren von 100 µL der Zelle/Keller Membran Matrix Suspension über einen Zeitraum von 5 s.</li>
	<li>Halten Sie die Spritze für weitere 5 s, um das gesamte Material zu gewährleisten wird injiziert. Hinweis: Injizieren Sie eine Mischung aus serumfreie Medien und Matrix für Kontrolle Nontumor-tragenden Mäusen (wie oben beschrieben) ohne die Tumorzellen.</li>
	<li>Die Spritze vorsichtig zurückziehen.</li>
	<li>Das oben beschriebene Verfahren mit den übrigen Mäusen weiter.</li>
	<li>Für 1 Woche bis Tumoren beginnen zu grob erscheinen lassen (50-200 mm3 für B4B8 und LY2 Zellen).</li>
</ol>3. Überwachung der Maus
<ol><li>Führen Sie die erste Messung mit Bremssättel auf 1 Woche nach der Injektion Tumor Zelle. Um das Tumorvolumen mit externen Bremssättel zu berechnen, bestimmen Sie die größte längs-Durchmesser (Länge) und dem größten Querdurchmesser (Breite) und verwenden Sie die modifizierte Ellipsoid Formel14,15. <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/59195/59195eq1.jpg">
</li>
	<li>Weiterhin regelmäßige Bremssattel Messungen für Tumorvolumen (1 x-2 x pro Woche in regelmäßigen Abständen) ausführen.</li>
	<li>Messen Sie Tier Gewicht über die Auswirkungen des Tumorwachstums zu füttern.</li>
</ol>4. Ernte Tumoren
<ol><li>Wenn der experimentellen Endpunkt erreicht ist, einschläfern Sie die Tiere durch geeignete Maßnahmen (z. B. CO2 Erstickung, Enthauptung oder zervikale Dislokation). Hinweis: In dieser Studie wurde der Endpunkt erreicht, wenn die Mäuse moribund wurden (mit einem Gewichtsverlust von &gt; 15 % ihres ursprünglichen Gewichts, ein Mangel an Pflege, Kachexie) und/oder wenn die Größe des Tumors 1.000 mm3erreicht.</li>
	<li>
Zerlegen das Tier durch die Schaffung eines langen Schnitt durch die Mittellinie in der Hals-Region zu beginnen.
	<ol>
<li>Verwenden Sie stumpfe Pinzette zu greifen die Haut und einer scharfen Schere zum Schneiden der Haut.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Legen Sie die Schere vorsichtig unter die Haut über dem Tumor und schaffen Sie Lufteinschlüsse zu, indem man die Schere über und in die Haut.</li>
	<li>Sobald die Haut ausreichend abgetrennt aus dem Tumor ist, identifizieren Sie die drainierenden Lymphknoten (DLNs) und Verbrauchsteuern Sie, um zu vermeiden, dass das Tumorgewebe durch die Anwesenheit von Lymphknoten verwechselt. Hinweis: Große Tumoren können zu erreichen und/oder decken die DLN. Je nach Art des Tests, die durchgeführt wird unbedingt die Isolierung intakt Lymphknoten Auslaufen von Immunzellen in den Tumor zu vermeiden, die Schiefstellung der Untersuchungsergebnisse zur Folge.</li>
	<li>Die Grenzen des Tumors durchtrennt, bis das gesamte Volumen gelöst ist.</li>
</ol>(5) Tumor Verarbeitung für Downstream-Anwendungen
<ol><li>Legen Sie für die nachgeschalteten histologische Prüfung Tumoren in 10 % Formalin bei Raumtemperatur. Um Overfixation zu vermeiden, ersetzen Sie die Formalin mit 70 % Ethanol. Verarbeiten Sie für Flow-Zytometrie-Analyse die Tumoren wie unten beschrieben. Hinweis: Das Gewebe kann in Formalin für 72 h gehalten werden, bevor Overfixation für bestimmte Arten der Färbung problematisch werden kann.</li>
	<li>Den Tumor in 1 – 2 mm geschnitten-große Stücke mit einem sterilen Rasierklinge oder einem scharfen Schere.</li>
	<li>Legen Sie die Stücke geschnittenen Tumor in einem 50 mL konische Röhrchen mit Kollagenase III (4.250 Einheiten pro Probe), DNase I (0,1 mg pro Probe) und Trypsin-Inhibitor (1 mg pro Probe).</li>
	<li>Inkubation bei 37 ° C für 30 min mit schütteln alle 10 Minuten. Hinweis: Die Proben können in einem wiederverschließbaren Beutel mit 90 % Ethanol sterilisiert und in eine Zelle Kultur Inkubator platziert werden.</li>
	<li>Fügen Sie nach 30 min 20 mL Hank Salzlösung (HBSS) und Spin bei 300 X g für 5 min ausgeglichen. Hinweis: HBSS besteht aus Kaliumchlorid, Natriumchlorid, Natrium Bicarbonat, Diabas-Natriumphosphat, Natriumphosphat monobasic und Glukose.</li>
	<li>Den Überstand verwerfen und das Pellet in 2 – 3 mL Erythrozyten (RBC) Lysis Puffer Aufschwemmen. Pipette rigoros. Hinweis: RBC Lyse Puffer besteht aus Ammoniumchlorid, Natriumbicarbonat und Binatrium.</li>
	<li>2 min bei Raumtemperatur inkubieren. Hinweis: Längere Inkubationszeit kann giftig für andere Zell-Populationen.</li>
	<li>Fügen Sie 20 mL HBSS, die Wirkung der Lyse Puffer zu neutralisieren.</li>
	<li>300 X g für 5 min Zentrifugieren und den Überstand verwerfen.</li>
	<li>Das Pellet in 10 mL HBSS aufzuwirbeln.</li>
	<li>Übergeben Sie die Lösung durch einen 70 µm Nylon einschränkende und Zentrifuge bei 300 X g für 5 min. Überstands verwerfen.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 5,8 – 5.10 und übergeben Sie die Zellsuspension durch eine 40 µm Nylon Restrainer um sicherzustellen, dass jegliche zusätzliche Ablagerungen aus der Suspension entfernt wird.</li>
</ol>6. Zelle Färbung und Datenerfassung
<ol><li>Die Zelle Pellet in 1 mL HBSS aufzuwirbeln.</li>
	<li>Zählen der Zellen unter Verwendung einer Hemocytometer oder einem automatisierten Zelle Zähler, wie unter Schritt 1,7</li>
	<li>
Bestimmen Sie die gesamte Zellzahl und geeignete Konzentration zum Beizen. Hinweis: die ideale Zellkonzentration für Flow Cytometry Färbung ist 1 Million Zellen. Zum Beispiel wenn Färbung in einer 96-Well-Platte erfolgt, und es 10 Millionen Zellen gibt, Aufschwemmen der Probenmaterials in 1 mL und Platte 100 µL für 1 Million Zellen pro Bohrloch.</li>
	<li>
Fügen Sie Fc Block (CD16/CD32) in einer Konzentration von 1: 100, um Nonantigen-spezifische Bindung von Immunglobulinen, die FcγIII und FcγII-Rezeptoren zu verhindern. 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
	<ol>
<li>Zentrifugieren und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 100 µL Flow Cytometry Zelle Färbung Puffer (bestehend aus Kochsalzlösung mit 5 % FBS, 2 % EDTA und 1 % HEPES).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Durchführen Sie Zelloberfläche Färbung nach Lieferanten bereitgestellten Anweisungen (Hinzufügen von jeder Antikörper bei der entsprechenden Verdünnung). 60 min bei Raumtemperatur inkubieren.
	<ol>
<li>Zentrifugieren und die Zelle Pellet in 100 µL HBSS Aufschwemmen. Wiederholen Sie 2 X get rid of überschüssige Antikörper.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Laufen Sie auf eine entsprechende Durchflusszytometer Proben.
	<ol>
<li>Wenn intrazelluläre Marker (z. B. foxp3) zu analysieren, führen Sie Zelle Permeabilisierung und Färbung gemäß den Anweisungen des Lieferanten.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Bonner, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiotherapy+plus+cetuximab+for+locoregionally+advanced+head+and+neck+cancer%3A+5-year+survival+data+from+a+phase+3+randomised+trial%2C+and+relation+between+cetuximab-induced+rash+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Oncology%22%5BJournal%5D)">Radiotherapy plus cetuximab for locoregionally advanced head and neck cancer: 5-year survival data from a phase 3 randomised trial, and relation between cetuximab-induced rash and survival.</a> The Lancet Oncology. 11 (1), 21-28 (2010).</li>
<li>Bhatia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+EphB4-Ephrin-B2+Signaling+Enhances+Response+to+Cetuximab-Radiation+Therapy+in+Head+and+Neck+Cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Inhibition of EphB4-Ephrin-B2 Signaling Enhances Response to Cetuximab-Radiation Therapy in Head and Neck Cancers.</a> Clinical Cancer Research. 24 (18), 4539-4550 (2018).</li>
<li>Bhatia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+radiosensitization+in+EphB4+receptor-expressing+Head+and+Neck+Squamous+Cell+Carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Enhancing radiosensitization in EphB4 receptor-expressing Head and Neck Squamous Cell Carcinomas.</a> Scientific Reports. 6, 38792(2016).</li>
<li>Tang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+radiation+and+immunotherapy%3A+a+new+systemic+therapy+for+solid+tumors%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Combining radiation and immunotherapy: a new systemic therapy for solid tumors?</a> Cancer Immunology Research. 2 (9), 831-838 (2014).</li>
<li>Oweida, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+to+radiotherapy+and+PD-L1+blockade+is+mediated+by+TIM-3+upregulation+and+regulatory+T-cell+infiltration%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Resistance to radiotherapy and PD-L1 blockade is mediated by TIM-3 upregulation and regulatory T-cell infiltration.</a> Clinical Cancer Research. , (2018).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Genaue Analyse und Charakterisierung von Tumor Mikroumgebung repräsentieren eine wichtige Strategie für Verständnis Mechanismen der Tumorentstehung, Progression und Metastasen und für die Entwicklung von wirksamen Therapien. Kopf-Hals-Tumoren ist eine komplexe Erkrankung, die aus mehreren anatomischen Standorten innerhalb der Kopf-Hals-Region stammen kann. Ein wesentliches Hindernis für das Verständnis der Krankheitsmechanismen und Verbesserung der Therapie wurde ein Mangel an murine Maus-Zell-Linien, die die aggressive ...

LOKAL ist die fünft häufigste Malignom weltweit, mit über 600.000 Patienten diagnostiziert jährlich1. Trotz der aggressiven Behandlung mit Chemotherapie und Strahlentherapie (RT) bleibt die allgemeine Überlebensrate (OS) für lokal Patienten ohne human Papilloma Virus (HPV) Infektion unter 50 % nach 5 Jahren2. Dies ist weitgehend auf eine hochkomplexe Tumor Mikroumgebung zurückzuführen, wie Tumoren ihren in mehreren unterschiedlichen anatomischen Standorten innerhalb der Kopf-Hals-Region Ursprung können, einschließlich bukkale Schleimhaut, Zunge, Boden des Mundes, Nasenhöhle, Mundhöhle, Rachen, Oropharynx und Hypopharynx. Darüber hinaus die Kopf-Hals-Bereich ist stark durchblutet und enthält fast die Hälfte aller Lymphknoten im Körper3. Ein Großteil der Studien zur Untersuchung von Kopf und Hals Tumorbiologie setzen auf Tumormodellen im Großraum Flanke. Solche Modelle bieten Einblick in Tumor-inneren Mechanismen, aber der Mangel an einheimischen Kopf- und Halskrebs Mikroumgebung kann die translationale Potenzial solcher Befunde erheblich beeinträchtigen. Eine Methode, die verwendet wurde, um orale Tumoren induzieren ist durch den Kontakt mit dem Karzinogen 9,10-Dimethyl-1,2-Benzanthracene (DMBA)4. Jedoch diese Methode zugeordnet ist ein langwieriger Prozess, induziert Tumoren bei Ratten und Hamster, aber nicht bei Mäusen, und die daraus resultierenden Tumoren besitzen nicht viele der histologischen Merkmale von differenzierten SCCs5,6. Die Einführung der carcinogen4-Nitroquinoline 1-oxid (4-Blessings), ein wasserlösliches Chinolon-Derivat, Maus orale Tumoren bei mündlich ergab aber auch litt lange Belichtungszeiten (16 Wochen) und eine begrenzte nehmen Rate innerhalb und zwischen den einzelnen Chargen von Mäusen7,8,9. Mehrere Gruppen genutzt um klinisch relevante Modelle zu entwickeln, gentechnisch hergestellten Modelle mit der Manipulation der Fahrer Onkogene oder Tumor-Suppressor-Gene, darunter TP53, TGFB, KRAS, HRAS und SMAD410. Diese Modelle bieten Einblick in Tumoren mit bekannten Fahrer Gene aber nicht rekapitulieren die komplexen Heterogenität des menschlichen HNSCCs.
In dieser Arbeit zeigen wir Ihnen die Möglichkeit der Durchführung einer intramucosal Impfung Plattenepithelkarzinom Zellen in Mäusen. Beimpfte Zellen entwickeln sich zu aggressive Tumoren innerhalb 1 Woche nach der Injektion. Ähnlich wie bei menschlichen HNSCCs, die Tumoren metastasieren in die regionalen Lymphknoten. Wir charakterisieren histologischen und klinischen Merkmale der Krankheit und geben Einblick in den Tumor immun Mikroumgebung. Wir schlagen vor, dass dieses orthotopen Modell der lokal Anwendungen in der Krebsbiologie, Tumorimmunologie und präklinischen Studien hat. Mechanismen des Immunsystems ausweichen, Tumorprogression, Therapieresistenz und Metastasen repräsentieren Bereiche von klinischer Bedeutung, der über das vorgeschlagene Modell angesprochen werden können.

<table><tbody><tr><td>Kollagenase III</td><td>Worthington Biochemical Corp.</td><td></td><td></td>LS004183</tr><tr><td>DNase I</td><td>Worthington Biochemical Corp.</td><td></td><td></td>LS006328</tr><tr><td>Fc Block (CD16/32)</td><td>BD Biosciences</td><td>553141</td><td>&nbsp; Klon 2.4G2&nbsp;</td></tr><tr><td>Färbepuffer für die Durchflusszytometrie</td><td>eBioscience</td><td>00-4222-26</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14175079</td><td>kein Kalzium, kein Magnesium, kein Phänorot</td></tr><tr><td>Helois-Massenzytometer</td><td>Fluidigm</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Membranmatrix</td><td>Corning&nbsp;</td><td>CB-40234B</td><td></td></tr><tr><td>MRT-Scanner</td><td>Bruker</td><td>NA</td><td>7,4 Tesla</td></tr><tr><td>Erythrozyten-Lysepuffer</td><td>BioLegend</td><td>420301 Trypsin-Inhibitor</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Worthington Biochemical Corp.</td><td></td><td></td>LS002830</tr></tbody></table>

intramucosal impfung des plattenepithelkarzinom zellen in mäusen für tumor immun profilierung und behandlung antwort bewertung

Intramucosal Inoculation of Squamous Cell Carcinoma Cells in Mice for Tumor Immune Profiling and Treatment Response Assessment

Kopf und Hals Squamous Zelle Krebsgeschwür (lokal) ist eine schwächende und tödliche Krankheit mit einer hohen Prävalenz von Wiederholung und Therapieversagen. Um bessere therapeutische Strategien zu entwickeln, Verständnis Tumor microenvironmental Faktoren, die die Therapieresistenz ist wichtig. Ein wesentliches Hindernis für das Verständnis der Krankheitsmechanismen und Verbesserung der Therapie wurde ein Mangel an murine Zell-Linien, die die aggressive und metastasierten Natur des menschlichen HNSCCs ähneln. Darüber hinaus ein Großteil der murinen Modellen beschäftigen subkutane Implantationen von Tumoren, die wichtige physiologische Funktionen der Kopf-Hals Region, einschließlich hohe Gefäßdicke, umfangreiche lymphatischen Gefäßsystem und resident Schleimhaut Flora fehlen. Der Zweck dieser Studie ist, zu entwickeln und eine Orthotopic Modell der lokal zu charakterisieren. Wir beschäftigen zwei genetisch unterschiedliche murinen Zelllinien und etablierten Tumoren in der bukkale Schleimhaut von Mäusen. Wir optimieren Kollagenase-basierte Tumor-Verdauung-Methoden für die optimale Verwertung von Einzelzellen aus etablierten Tumoren. Die hier vorgestellten Daten zeigen, dass Mäuse stark vaskularisierte Tumoren entwickeln, die in regionalen Lymphknoten metastasieren. Einzellige multiparametric Masse Zytometrie Analyse zeigt die Anwesenheit von verschiedenen immun Bevölkerungsgruppen mit myeloische Zellen repräsentieren den Großteil aller Immunzellen. Das Modell in dieser Studie vorgeschlagen hat Anwendungen in der Krebsbiologie, Tumorimmunologie und präklinischen Entwicklung neuer Therapeutika. Die Ähnlichkeit des orthotopen Modells zur klinischen Merkmale menschlicher Erkrankungen bieten eine Tool für verbesserte Übersetzung und verbesserte Behandlungsergebnisse.

Die in-vitro-Beurteilung der Zellproliferation LY2 und B4B8 haben gezeigt, dass beide Zelllinien ähnliche Verdoppelung Zeiten (21 h und 23 h, beziehungsweise). In-vivo, beide Zelllinien gebildet eine einzelne, sichtbare und fühlbar Masse innerhalb 1 Woche nach der Impfung (Abbildung 1A). Bei Mäusen mit LY2 Tumoren wurde der Kiefer von 3 Wochen wegen Tumorlast (Abbildung 1A) abgelöst. Kontroll-Mäusen, die keine Tumorzellen erhielt...

Hier präsentieren wir eine reproduzierbare Methode für die Entwicklung einer orthotopen Mausmodell von Kopf und Hals Squamous Zelle Krebsgeschwür. Tumoren zeigen klinisch relevante histopathologischen Merkmale der Krankheit, einschließlich der Nekrose, schlechte Differenzierung und Knotenpunkte Metastasen immun Infiltration. Tumor-tragenden Mäusen Symptome klinisch relevante wie Dysphagie, Kiefer Verschiebung und Gewichtsverlust.

Intramucosal Impfung des Plattenepithelkarzinom Zellen in Mäusen für Tumor immun Profilierung und Behandlung Antwort Bewertung

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is a debilitating and deadly disease with a high prevalence of recurrence and treatment failure. To develop ...

Krebserkrankungen in der Kopf- und Nackenregion werden immer häufiger. Dennoch gibt es ein begrenztes Verständnis der Tumormikroumgebung und der Mechanismen der Behandlungsresistenz in dieser Region. Diese Technik kann verwendet werden, um die native Mikroumgebung von Kopf-Hals-Tumoren auf zugängliche Weise zu rekapitulieren und produziert klinische Manifestationen ähnlich denen beim Menschen.Wenn die Tumorzellkultur 70% Konfluenz erreicht hat, waschen Sie die Zellen dreimal mit kalten PBS pro Waschgang und befestigen Sie die Zellen mit genügend 0,25% Trypsin, um die untere Oberfläche des Kulturkolbens zu bedecken. Nach drei bis vier Minuten im Zellkultur-Inkubator die Ablösung unter einem Lichtmikroskop bestätigen und das Trypsin mit 12 MilliliterDM F12 Medium neutralisieren, ergänzt durch fetales Rinderserum. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 50 Milliliter konisches Rohr und mischen Sie die Zellen drei- bis viermal durch Inversion.Dann sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und setzen Sie das Pellet in Serum und antibiotikafreies DMEM bei einem mal 10 bis sechsten Tumorzelle pro 50 Mikroliter mittlerer Konzentration auf Eis wieder auf. Unmittelbar vor der Injektion mischen Sie die Zellen bei einer Eins-zu-Eins-Tumorzellensuspension zu Keller-Membran-Matrix-Verhältnis auf Eis. Laden Sie eine 0,5-Milliliter-Spritze mit einer 23-Spur-Nadel mit 100 Mikroliter Zellen pro Empfängertier.Legen Sie die Spritzen auf Eis und bestätigen Sie eine mangelnde Reaktion auf Zehenkneifen in einer anästhesierten Maus. Als nächstes legen Sie die Nadel in den rechten oder linken bukkalen Bereich durch den verfügbaren offenen Raum auf beiden Seiten des Mundes, wobei die Spritze parallel zum bukkalen Bereich gehalten wird, während sie sich in der Mundhöhle befindet, um die Injektion des vollen 100-Mikroliter-Volumens der Zellkeller-Membranmatrixsuspension über einen Zeitraum von fünf Sekunden zu erleichtern. Bewahren Sie die Spritze weitere fünf Sekunden an, um sicherzustellen, dass das gesamte Material injiziert wurde, bevor Sie die Spritze vorsichtig zurückziehen.Die Tumore werden in etwa einer Woche stark sichtbar. Eine Woche nach der Injektion verwenden Sie Sättel, um die Länge und Breite jedes Tumors zu messen, um das Tumorvolumen ein- bis zweimal pro Woche zu bestimmen. Und messen Sie das Gewicht jedes Tieres, um die Auswirkungen des Tumorwachstums auf die Fütterung zu bewerten.Verwenden Sie am entsprechenden experimentellen Endpunkt scharfe Scheren und stumpfe Zangen, um einen Hautschnitt durch die Mittellinie im Hals zu machen. Und legen Sie die Schere sanft unter die Haut, die den Tumor bedeckt, um Lufttaschen zu schaffen, indem Sie die Schere über und in die Haut drücken. Sobald die Haut ausreichend vom Tumor getrennt ist, verbrauchen Sie die entwässernden Lymphknoten, um zu vermeiden, dass das Tumorgewebe durch das Vorhandensein von Lymphgewebe verwirrt und durch die Ränder des Tumors geschnitten wird, bis das gesamte Volumen abgetrennt ist.Um den Tumor für die nachgeschaltete Analyse zu verarbeiten, schneiden Sie den Tumor in ein bis zwei Millimeter große Stücke und legen Sie die Stücke in eine 50 Milliliter konische Röhre mit Kollagenase drei, DNAs eins und Trypsin-Inhibitor. Nach der Inkubation der Tumorstücke bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten, mit Schütteln alle 10 Minuten, fügen Sie 20 Milliliter HBSS in die Röhre und übergeben Sie die Suspension mit den Tumorstücken durch ein 70 Mikrometer Gießen Nylon Sieb. Verwenden Sie einen Fünf-Milliliter-Spritzenkolben, um die Tumorstücke im Sieb zu zermahlen und zusätzlich 10 Milliliter HBSS durch das Sieb hinzuzufügen.Drehen Sie die Zellen durch Zentrifugation nach unten. Das Pellet in zwei bis drei Milliliter roter Blutzelllysepuffer mit strenger Pipettierung wieder aufhängen und die Lyse mit 20 Millilitern frischem HBSS nach zwei Minuten bei Raumtemperatur neutralisieren. Dann setzen Sie die Zellen in weiteren 20 Milliliter N.B. HBSS für eine weitere Zentrifugation wieder auf und belasten sie die Zellen durch einen 40-Mikrometer-Gießfilter, um den letzten Schmutz aus der Tumorzellsuspension zu entfernen.LY2-Tumoren wachsen mit einer höheren Rate, im Vergleich zu B4B8-Tumoren. Und Mäuse, die Kieferverschiebung zeigen, entwickeln schnell Gewichtsverlust, aufgrund von Dysphagie. Das mediane Überleben bei LY2-Mäusen ist ebenfalls weniger als halb so hoch wie bei B4B8-Tumor-tragenden Mäusen.Die Magnetresonanztomographie von tumortragenden Mäusen zeigt gut abgegrenzte Tumoren, die sich in die innere Schicht der bukkalen Schleimhaut ausdehnen, aber nicht in die Zunge oder andere nahe gelegene Organe. Die histologische Untersuchung zeigt, dass alle LY2-Tumor-tragenden Mäuse ein schlecht differenziertes Plattenepithelkarzinom entwickeln, während Mäuse mit B4B8-Tumoren ein mäßig differenziertes Plattenepithelkarzinom entwickeln. Alle LY2-Tumor tragenden Mäuse haben auch histologisch bestätigte Nekrose, wobei die Mehrheit eine mittelschwere bis schwere Nekrose zeigt.In diesem repräsentativen Experiment wurde ein LY2-Tumor geerntet und drei Wochen nach der Injektion von bukkalen Tumorzellen verarbeitet, wie gezeigt. CD45-positive Immunzellen machten 7,3% der gesamten Tumorzellpopulation aus. CD11b-positive myeloide Zellen stellten 37,8% aller CD45-positiven Zellen dar, von denen die Mehrheit als F480-positive Makrophagen bestimmt wurde, wobei auch kleine Populationen von Neutrophilen und myeloiden suppressorischen Suppressorzellen beobachtet wurden.T-Zellen machten 15,9 % der CD45-positiven Immunzellpopulation aus, davon 53,4 % CD4-positive FoxP3-positive regulatorische T-Zellen. Natürliche Killerzellen machten weniger als 2% aller CD45-positiven Zellen aus. Es ist wichtig, Injektion zu üben, um Vertrauen und Komfort im Halten der Nadel und der Empfängermaus und bei der Exposition des Mundes des Tieres zu entwickeln.Sobald das Verfahren erfolgreich durchgeführt wurde, können Experimente durchgeführt werden, die die Beurteilung der Tumorreaktion auf die Therapie oder die Bewertung der Tumor intrinsischen und mikroökologischen Faktoren beinhalten. Diese Technik hat den Weg für die Entwicklung einer vom Forscher initiierten klinischen Studie geebnet, in der die Auswirkungen der Kombination von Strahlentherapie und Anti-PL1-Therapie bei Kopf- und Nackenkrebspatienten bewertet wurden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Einem orthotopen Modell des seröse Ovarialkarzinom in immunkompetenten Mäusen für In vivo Tumor Imaging und Überwachung der Tumor Immunantworten

Einen umfassenden Überblick über die Techniken bei der Erzeugung von einem Maus-Modell von Mundkrebs und quantitative Überwachung der Tumorinvasion in die Zunge durch Multi-Photonen-Mikroskopie markierter Zellen beteiligt wird vorgestellt. Dieses System kann als eine nützliche Plattform für die molekulare Beurteilung und Wirksamkeit von Medikamenten von anti-invasive Verbindungen dienen.

Multi-Photonen-Imaging der Tumorzellinvasion in einem orthotopen Mausmodell des oralen Plattenepithelkarzinoms

In diesem Video entwickeln wir ein orthotopes Modell für Kopf- und Halskrebs bei Mäusen durch intramukosale Inokulation der Plattenepithelkarzinom-Zelllinie. Die tumortragende Maus würde Ähnlichkeit mit klinisch relevanten Symptomen menschlicher Krankheiten aufweisen und könnte somit zur Untersuchung des Fortschreitens von Krebs und zur Entdeckung neuer therapeutischer Strategien verwendet werden.

Intramukosale Inokulation von Krebszellen im Mausmodell: Ein Verfahren zur Etablierung eines orthotopen Mausmodells für Kopf- und Halskrebs

Dieses Video zeigt einen zellbasierten Tumorimpfassay. Eine Maus, der intradermal B16-F10-Melanomzellen zur Tumorbildung injiziert wurden, wird mit B16-F10-Zellen geimpft, die Flt3L-Zytokin in der Nähe des entwickelten Tumors sezernieren. Das aus dem Impfstoff sezernierte Flt3L fördert die Reifung und Proliferation von dendritischen Zellen, die dann Tumorantigene an T-Zellen in Lymphknoten abgeben und so eine gezielte Anti-Tumor-Immunantwort auslösen.

Tumorimplantation und Injektion eines Tumorimpfstoffs in einem Mausmodell

Ein N-Butyl-N-(4-Hydroxybutyl) Nitrosamin-induzierten Blasenkrebs Modell wurde in menschlichen Mucin-1 (MUC1) transgenen Mäusen zur Prüfung MUC1-gerichtete Immuntherapie entwickelt. Nach Verabreichung eines MUC1-Peptid-Impfstoff gezielt wurde eine zytotoxische T-Lymphozyten-Reaktion auf MUC1 durch Messung Serum Cytokinspiegel und T-Zell-spezifische Aktivität bestätigt.

Induktion von Invasive Transitional Handy Blasenkarzinom in Immune intakte menschliche MUC1 transgenen Mäusen: Ein Modell für Immuntherapie Entwicklung

Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von murinen orthotope Blasentumoren in weiblichen C57BL / 6J-Mäusen und für die Überwachung des Tumorwachstums.

Ein Murine Orthotopische Blasentumormodell und Tumor Detection System

Hier stellen wir ein Tumortransplantationsprotokoll zur Charakterisierung von tumorinhärenten und peripherieabgeleiteten tumorinfiltrierten Lymphozyten in einem Maustumormodell vor. Die spezifische Verfolgung des Zustroms von Empfänger-abgeleiteten Immunzellen mit Durchflusszytometrie zeigt die Dynamik der phänotypischen und funktionellen Veränderungen dieser Zellen während der Antitumor-Immunantwort.

Tumortransplantation zur Beurteilung der Dynamik tumorinfiltrierender CD8+ T-Zellen in Mäusen

Die Translation von Befunden der Intravitalmikroskopie wird durch das geringe Eindringen in das Gewebe erschwert. Hier beschreiben wir ein Mausmodell mit dorsaler Fensterkammer, das die Co-Registrierung der Intravitalmikroskopie und klinisch anwendbarer Bildgebungsmodalitäten (z. B. CT, MRT) für eine direkte räumliche Korrelation ermöglicht und so die klinische Translation von Befunden der Intravitalmikroskopie möglicherweise rationalisiert.

Ein Mausmodell eines dorsalen Hautfaltenfensterkammertumors für die kombinierte Intravitalmikroskopie und Magnetresonanztomographie in der translationalen Krebsforschung

Diese Arbeit konzentriert sich auf die in vivo subkutane Induktion von lumineszierenden kolorektalen Karzinomzellen in einem Mausmodell und die anschließende Lumineszenzmessung mit Hilfe eines bildgebenden Systems. Das Verfahren zielt darauf ab, ein reproduzierbares Tumorwachstumsmodell für das Echtzeit-Monitoring und die therapeutische Bewertung zu etablieren.

Subkutane Injektion von humanen Darmkrebszellen in athyme Nacktmäuse zur Bewertung der Wirksamkeit von Antitumoren

Eine einzigartige Methode zur chirurgischen Entfernung von oralen Plattenepithelkarzinomtumoren, die in der Mundhöhle etabliert wurden, wird hier gezeigt.

Translational relevantes Tumorresektionsmodell für murine präklinische Modelle des oralen Plattenepithelkarzinoms

Mit dem wachsenden Interesse an intratumoraler Immuntherapie ist es unerlässlich, Tumormodelle auszuwählen, die zugänglich und praktisch sind. Subkutane Tumore sind leicht zu etablieren, aber schwer zu visualisieren und zu manipulieren. In diesem Protokoll beschreiben wir Methoden zur Erzeugung von intradermalen Tumoren, die eine verbesserte Sichtbarkeit und Zugänglichkeit bieten.

Intradermale Tumorimplantation als robustes Modell für Studien zur intratumoralen Immuntherapie bei Murinkrebs

Erfahren Sie die orthotope Implantation von Plattenepithelkarzinomzellen bei Mäusen zur Untersuchung des Tumormikromilieus und Behandlungsresistenzen. Dieses Modell zeigt klinisch relevante Symptome wie humane Erkrankungen.

Intramucosal Impfung des Plattenepithelkarzinom Zellen in Mäusen für Tumor immun Profilierung und Behandlung Antwort Bewertung

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