Name: Automatisierte Messungen des Schlafes und Bewegungsorgane Aktivität im mexikanischen Cavefish (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 10 s
Description: Erfahren Sie die automatisierte Messung von Schlaf und Bewegungsaktivität im mexikanischen Höhlenfisch. Diese Methode quantifiziert Verhaltensmuster in sozialer Haltung und ist auf andere Fischarten übertragbar.

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Hinweis: Richten Sie Systeme für Verhaltens-Tracking bei Larven und Erwachsenen.
1. bauen ein Schlafsystem für Larven
Hinweis: Das monitoring-System für das Tracking durch Jungfische im Alter von 4 Tagen Post Befruchtung (Dpf) durch 30 Dpf A. Mexicanus Larven erfordert, dass mehrere Stücke Ausrüstung inklusive Infrarot (IR) Beleuchtung, Acryl IR Licht Diffusoren, Licht automatisiert Kontrollen (Timer), Computer, Kameras und Sekundärrohstoffe wie Verkabelung und Leistungssteller (Abbildung 1A). Die folgenden Hinweise informieren wie Sie bauen ein System um genau verfolgen lokomotorische Verhalten um Schlaf und zirkadiane Rhythmen im Larvenstadium zu studieren A. Mexicanus.
<ol><li>Konstruieren ein Beleuchtungssystem bestehend aus IR und weiße Leuchtdioden (LED): Legen Sie drei IR-Licht in ein Dreieck ca. 7,62 cm voneinander auf 30,5 x 30,5 cm dünnen Metallplattform Kühlkörper. Lichter in Reihe mit elektrischen Draht Draht und an eine Stromquelle anschließen.</li>
	<li>Legen Sie ein einzelnes weißes Licht LED in der Mitte der drei IR-Beleuchtung und bringen Sie sie an die Stromquelle angeschlossen.</li>
	<li>Verbinden Sie die Stromquelle für die LED einen leichten Timer auf eine circadiane Standardzeit festgelegt.</li>
	<li>Konstruieren Sie eine Plattform für Larven Tracking-System. Verwenden Sie 0,33 cm dicken weißen Schild Acryl für alle Komponenten der Plattform.</li>
	<li>Legen Sie die Aufnahme-Plattform auf den beleuchteten Quadrat Kühlkörper auf die, den Arenen mit Fischen befinden soll, während behavioral Tracking.</li>
	<li>
Legen Sie eine zweite Acryl im Inneren der Box zwischen den Lichtern und den Tieren, die IR für optimale Beleuchtung und Kontrast zu verbreiten. Hinweis: die Maße für die Larven Lichtkasten ist wie folgt: zwei 18 cm x 8,5 cm und zwei 17 x 8,5 cm LEDs, die chemisch miteinander, in Form einer 18 x 18 cm verklebt werden im Quadrat d. h. 8,5 cm hoch. Darüber hinaus möglicherweise Acryl leicht Ausschneiden "oder" gebohrt mit die richtigen Werkzeuge für individuelle Größenanpassung.<ol>
<li>Legen Sie die gesamte Larven Tracking-Bühne und Licht-Setup innerhalb einer geschlossenen Kunststoff-Rohr, und positionieren Sie die Kamera auf das Rohr. Hinweis: Es ist wichtig, dass Beleuchtung Reflexionen erscheinen auf dem Video Tracking, Trackinggenauigkeit beeinträchtigen wird. Die Platzierung der Kameras über einen Schlauch, der Plattform umgibt verbessert Beleuchtung und Schärfe für die Kameras, die für diese Experimente verwendet werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eine Webcam zu manipulieren (siehe Tabelle der Materialien) für IR-basierte Aufzeichnung. Entfernen Sie die Hersteller-Linse mit einem rotierenden Werkzeug (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Entfernen Sie die kleinen silbernen Schrauben auf der Rückseite der Kamera, um das innere Gehäuse zu entfernen.</li>
	<li>Entfernen Sie die kleinen schwarzen Schrauben im Inneren des Körpers der Kamera, den Rest des Objektivs zu lösen. Verwenden Sie einen kleinen Schraubenzieher, um keine Teile der Linse Gehäuse zu entfernen, was übrig bleibt, nach dem Schneiden der Linse.</li>
	<li>Entfernen Sie die blaue an der Oberseite von der geladenen LED gekoppelt Gerätegehäuse (CCD).</li>
	<li>Legen Sie die Kamera wieder zusammen indem du das Innengehäuse zurück zu der ursprünglichen Ausrichtung und verschrauben die beiden silbernen Schrauben wieder in ihre ursprüngliche Position.</li>
	<li>Strecke das Innere der Kamera mit einem kleinen sah, mit abgerundeten Kunststoff routing etwas passen. Glatt nach unten zusätzliche Kunststoff bis es einen Objektiv-Adapter passen.</li>
	<li>Installieren Sie einen IR-Pass-Filter im Inneren der Kamera so nah an der CCD möglichst ohne direkten Kontakt mit der Kamera. Hinweis: Achten Sie darauf, nicht den CCD-Chip im Inneren des Gehäuses der Kamera beschädigen. Achten Sie darauf, den Schnitt so waagerecht wie möglich zu halten. Jede Freifläche zwischen der Außenseite des IR-Filter und den Körper der Kamera zu verhindern, dass Licht die CCD zu erreichen, ohne gefiltert zu versiegeln.</li>
	<li>Befestigen Sie die Kamera zu einem Objektiv 35 mm fixiert (siehe Tabelle der Materialien) durch Einschrauben des Adapters an der Vorderseite der Kamera auf der Rückseite des Objektivs.</li>
	<li>Legen Sie die Kamera und Objektiv in das Loch in den Deckel auf die Röhre, die die Bühne und Licht Häuser gebohrt und schließen Sie den USB am Computer, die, dem von die Tieren aufgenommen werden. Hinweis: Legen Sie Fisch in einem Verhalten Raum, getrennt von dem Lager Fische untergebracht sind, um minimale Störungen bei Verhaltensstörungen Aufnahmen zu gewährleisten. Achten Sie darauf, um zu minimieren Schwankungen in Temperatur und Belüftung der Verhaltensexperimente verwirren kann.</li>
</ol>(2) Schlaf-System für Erwachsene
<ol><li>Konstruieren Sie eine IR-Beleuchtung für die Verfolgung von ausgewachsenen Fischen von ca. 46 cm Abständen IR Streifen schneiden. Ein Streifen von 46 cm ist ausreichend für jeden Tank 10 L Verhalten.</li>
	<li>Jeder Streifen zusammen in einer Reihe, jeder Streifen zu DC elektrischen Draht Löten Draht und befestigen Sie mit einer 9 V-Stromquelle.</li>
	<li>Ein 51 cm x 5,1 cm-Stück aus Aluminium, die als Kühlkörper fungiert zuordnen Sie jeder IR-Streifen.</li>
	<li>Legen Sie ein 46 cm x 5 cm, 0,32 cm dicken 9 % Licht-Pass weißes Schild Acryl Blatt direkt vor jeder IR-LED-Streifen, die IR zu verbreiten Licht.</li>
	<li>Platzieren Sie alle Panzer auf eine Zahnstange, die hinten angebrachte IR Beleuchtung unterstützt.</li>
	<li>Verwenden Sie opaken Kunststoff Teiler in 10 L-Glas-Tanks, um einzelnen Arenen zu erstellen. Hinweis: Die Arena-Größe kann je nach der Anzahl der Teiler verwendet und die Größe des Tanks variiert werden. Arena Größe wirkt lokomotorische Aktivität und Schlaf in Höhle und Oberfläche Fisch23.</li>
	<li>Montieren Sie Kameras ca. 4-6 m vom Panzer. Jede Kamera kann in der Regel von 3 Panzer gleichzeitig bereitstellen ausreichenden Auflösung für die Verfolgung aufnehmen. Hinweis: Erwachsenen Verhaltens Aufnahmen erfordern in der Regel keine separate weiße Beleuchtung, Tag-Nacht-Änderungen zu kontrollieren. Einfach mit standard Deckenbeleuchtung in einem Verhaltens-Raum an eine Zeitschaltuhr angeschlossen ist ausreichend.</li>
</ol>3. Aufnahme lokomotorischen Tätigkeit
Hinweis: Alle Verhaltensstörungen Aufnahmen erfolgt über eine standard Laptop oder Desktop mit einer Pufferbatterie Quelle. Aufgrund der großen Dateigröße einer 24 h Aufnahme (60-100 GB) speichern Sie alle Aufnahmen auf externe Festplatten.
<ol><li>Fische zwischen 4-30 Dpf für 18-24 h vor Beginn der Aufnahmen zu akklimatisieren. Füttern Sie Larven Fische mit live Artemia wenn zuerst in der Aufnahme-Kammer und 1 h vor Beginn der Aufnahme gelegt. 4-5 Tage vor Aufnahme Verhalten geschlechtsreifer Fische zu akklimatisieren und einmal täglich mit Flockenfutter oder mit live Blackworms zu ernähren. Hinweis: Achten Sie darauf, Larven Fische im Süßwasser vor der Aufnahme, platzieren, da übrig gebliebenen Artemia Tracking-Probleme bei der späteren Analyse führt. Gemeinsam mit Rädertierchen Kultivierung bietet eine alternative Möglichkeit, ihrer geringen Größe mit Tracking nicht stört.</li>
	<li>Statt Fisch im Alter von 4-6 Dpf in 24-Well-Zellkultur-Platten. Haus Fisch im Alter von 20-30 Dpf in 12-Well-Zellkultur-Platten für die Aufnahme.</li>
	<li>Rekord Erwachsene in 10 L Tanks passen mit Teilern, fünf individuell untergebracht Fisch unterzubringen oder ohne Trennwände zum Rekord schlafen und Tätigkeit in einem sozialen Umfeld. Hinweis: Achten Sie darauf, die Kamera vor dem Einleiten der Aufnahme um Trackinggenauigkeit zu maximieren. Öffnen Sie die Blende der Kameralinse nicht zu weit, da dies die Schärfe des Bildes drastisch verringert wird. Allerdings gibt es ein Gleichgewicht; Wenn die Iris zu weit geschlossen ist, wird die Bildrate des Videos unter 15,00 fps fallen. Es ist wichtig für die spätere Analyse, dass die Framerate 15,00 Frames pro s für den Einsatz mit einigen Schlaf individuell geschriebenen Skript23,24 bleibt.</li>
	<li>Hintergrund-Beleuchtung Beleuchtung/Helligkeit einstellen.</li>
	<li>Optimierung der Beleuchtung vor Beginn der Aufnahme. Immer den Kontrast auf höchstem Niveau möglich und verwenden Sie Helligkeit und Hintergrundbeleuchtung , um die Helligkeit zu justieren, bis die Tiere am klarsten sind.</li>
	<li>Rekord Fisch für 24 oder 48 Stunden. Hinweis: Notfall backup-Batterie-Packs, die Macht der Beleuchtung, Computer und Kameras sollten bei Stromausfällen gekauft werden. Alle Akku-Packs sollte wenn möglich auch in Notfall-Steckdosen angeschlossen werden. Akku-Packs werden in der Regel nicht macht das Gerät für mehr als ein paar Minuten bis zu einer Stunde höchstens und dienen zur Brücke zwischen Hauptstrom zu verlieren und in die Notstrom-System zu übertragen.</li>
</ol>4. Analyse der motorischen Aktivität in einzeln untergebracht Fisch mit automatisierten tracking-Software
<ol><li>Um zu Beginn der Analyse des Verhaltens-Tracking-Software zu öffnen, wählen Sie Neues Experiment aus Vorlageund dann eine Pre-Defined Vorlage anwenden.</li>
	<li>Da das Programm nun welche Arten verfolgen aufgefordert werden, wählen Sie Fisch. Verwenden Sie die Dropdown-Box, um entweder Zebrafisch-Larven Zebrafish Erwachsenen je der experimentellen Paradigma auszuwählen.</li>
	<li>Richten Sie den Arenen, in denen jedes Tier verfolgt werden. Wählen Sie für Larven gut Platte, Runde gut und Nein Zonenvorlage. Verwenden Sie für Erwachsene Freiland, Quadrat mit No Zonenvorlage. Dann bestimmen Sie die richtige Anzahl von Arenen, eine für jedes Tier, in dem Video verfolgt.</li>
	<li>Wählen Sie das Modell für die optimale Überwachung, klicken Sie auf verfolgen Mittelpunkt, und achten Sie darauf, dass die tierische Farbe dunkler als der Hintergrund ausgewählt ist. Wenden Sie die Frame-Rate, mit der das Video übernommen wurde. Die Tracking-Software sollte dies automatisch erkennen.</li>
	<li>Zeichnen Sie eine Waage, um die reale Entfernung eines Objektes genau zu bestimmen, das lokomotorische Verhalten der Fische mit Arena-Einstellungenzu kalibrieren.</li>
	<li>Bearbeiten Sie die Arenen um sicherzustellen, dass die gesamte Fläche, die die Fische in verfolgt werden; Ansonsten werden Proben während der Akquisition verloren gehen. Hinweis: Vorsicht beim Bereiche einrichten. Larven Fische sind besonders anfällig für Fehler verfolgen, wenn die Arenen entweder zu groß oder klein sind. Schlechter Beleuchtung im Experiment kann auch Schatten an den Wänden der well-Platten, erstellen, die das Programm ein Tier vorstellen kann, erstellen einen Fehlalarm ist.</li>
	<li>Klicken Sie auf Erweiterte. Unter Methode in Erkennung Einstellungwählen Sie Dynamische Subtraktion, dann klicken Sie auf Hintergrund und Lernen beginnen. Einstellen Sie Dunkel-Kontrast Signal-/Rauschverhältnis, bis die Tiere gut nachverfolgt sind und Hintergrund nicht die Verfolgung verursacht zu springen. Hinweis: Videoqualität kann variieren zwischen Experimente, so jeder Prüfung unter verschiedene Einstellungen entsprechend zu verwenden muss Umständen. Mit dem Thema Kontur und Motivgröße Funktionen kann Tracking-Ergebnisse deutlich verbessern.</li>
	<li>Wählen Sie Test-Liste und laden Sie die richtigen Parametern zu, bevor Sie beginnen, die Daten in das Programm aufzunehmen.</li>
	<li>Klicken Sie in der Registerkarte " Erwerb ", wählen Sie Track alle geplanten Testversionen und klicken Sie auf die Aufnahmetaste.</li>
	<li>Sicherzustellen Sie unter Analyse Profil, Distanz und Zeit & Bewegung sind ausgewählt. Hinweis: In Reihenfolge für die spätere Schlafanalyse ist es wichtig, dass diese Einstellungen korrekt sind, als die .perl Datei muss lesen diese Daten in der richtigen Reihenfolge um Schlaf zu berechnen.</li>
	<li>Wählen Sie Rohdatenunter exportieren, exportieren Sie die Daten als Unicode-Text.</li>
</ol>(5) Tracking untergebracht sozial Fisch
<ol><li>Führen Sie die Schritte 4.1-4.4 das Experiment in der Tracking-Software einrichten.</li>
	<li>Wählen Sie im Dropdown-Menü wie viele Tiere, für das Experiment zu verfolgen.</li>
	<li>Zeichnen Sie im Arena -Einstellungen den richtigen Maßstab um den realen Abstand zu kalibrieren.</li>
	<li>In Erkennung Einstellungen verwenden Dynamische Subtraktionund den dunklen Kontrast um das Tier am besten zu verfolgen.</li>
	<li>Einstellen Sie die Motivgröße unter den Einstellungen Erkennung so, dass nur ein sehr kleiner Teil des Tieres verfolgt wird. Hinweis: Verfolgen nur einen kleinen Teil des Tieres, wird dadurch verringert sich die Menge des Umschaltens zwischen den Tieren, wenn sie während der Akquisition kreuzen.</li>
	<li>Sobald die Spuren gesammelt sind, mithilfe des Track-Editor manuell mal fix wo Fische kreuzen können.</li>
</ol>(6) Gewinnung von Schlafdaten aus lokomotorischen Tätigkeit
Hinweis: Die Behaviorale Definition des Schlafes in Larven und Erwachsenen A. Mexicanus ist 1 min oder mehr Ruhe. Diese Definition wurde anhand Erregung Schwelle Experimente, wo eine größere Sinnesreiz benötigt wird, um eine Verhaltensreaktion in einem schlafenden Zustand zu initiieren (> 60 s) im Vergleich zum Aufwachen14,17. Um kleine Bewegungen und driften gemeinsame Arten, dort zu Fischen zu berücksichtigen sind Geschwindigkeit Schwellenwerte angewendet, um wirkliche Bewegung durch Lärm oder Drift zu trennen. Diese Schwellen sind rechnerisch abgeleitet, durch den Vergleich der Korrelationen zwischen Distanz und Schlafdauer, die höchsten R-squared-Werte zu finden; Dabei bestimmen die genaueste Geschwindigkeit für Bewegung und Schlaf. Für Larven Fische die oberen und unteren Grenzwerte sind beide 12 mm/s da ist wenig bis keine Drift. Die untere Grenze ist für Erwachsene Fische 2 cm/s mit einer Obergrenze von 4 cm/s, für Drift zu berücksichtigen.
<ol><li>Installieren Sie Cygwin auf den Analyse-Computer, die Ausführung von individuell geschriebenen Skripten zu extrahieren Bewegungsorgane und schlafen Verhalten durchzuführen.</li>
	<li>Erstellen Sie einen neuen Experiment-Ordner in das Cygwin home-Verzeichnis.</li>
	<li>Importieren Sie die unformatierten Unicode-Daten aus tracking-Software und führen Sie die .sh-Datei im Cygwin, die Codierung von UTF-16, UTF-8 zu konvertieren.</li>
	<li>Führen Sie die .perl Datei in Cygwin, die Schlafdaten extrahieren.</li>
	<li>Öffnen Sie die Makrodatei und folgen Sie den Anweisungen in der Tabelle um die Datenanalyse wie gewünscht abzuschließen. Hinweis: Ein Mindestmaß an Kommandozeilen-Codierung werden notwendig, diesen Teil der Analyse durchzuführen. Allgemeine Linux-Befehle ist ausreichend. Wenn es Probleme mit den Programmen die Daten richtig zu lesen sind, überprüfen Sie die Daten aus tracking-Software in einem frei verfügbaren Texteditor um sicher zu sein, die Codierung und Reihenfolge ist richtig für die ausführbaren Dateien richtig schreiben.</li>
</ol>

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<li>Bell, M. A., Foster, S. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBell%2C+MA+%22The+evolutionary+biology+of+the+threespine+stickleback%22">The evolutionary biology of the threespine stickleback</a>. 584, Oxford University Press. Available from:
 <a target="_blank" href="http://books.google.com/books?hl=de&lr=&id=uxC0lN-Z3FIC&pgis=1">http://books.google.com/books?hl=de&lr=&id=uxC0lN-Z3FIC&pgis=1</a> (1994).</li>
<li>Seehausen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((African+cichlid+fish%3A+a+model+system+in+adaptive+radiation+research%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+Biological+Sciences%2FThe+Royal+Society%22%5BJournal%5D)">African cichlid fish: a model system in adaptive radiation research.</a> Proceedings of Biological Sciences/The Royal Society. 273 (1597), 1987-1998 (1597).</li>
<li>Basolo, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Female+preference+predates+the+evolution+of+the+sword+in+swordtail+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Female preference predates the evolution of the sword in swordtail fish.</a> Science. 250, 808-810 (1990).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

Dieses Protokoll beschreibt ein maßgeschneidertes System zur Quantifizierung der Schlaf und Bewegungsorgane Aktivität bei Larven und adulten Cavefish. Cavefish entstanden als führende Modell für das Studium der Evolution des Schlafes, die verwendet werden kann, um die genetischen und neuronalen Grundlagen der Schlaf Verordnung1zu untersuchen. Die entscheidenden Schritte in dieses Protokoll gehören Optimierung der Beleuchtung und Videoqualität um genaues tracking zu gewährleisten ist notwendig, um ...

Schlaf ist im gesamten Tierreich auf der physiologischen, funktionellen und verhaltensbezogenen Ebene1,2,3hoch konserviert. Während Schlaf bei Säugetieren Versuchstieren in der Regel Elektroenzephalogramme anhand ist, elektrophysiologische Aufnahmen sind weniger praktisch in kleinen genetisch zugänglich Modellsystemen und somit Schlaf ist in der Regel gemessen basierend auf Verhalten3 , 4. Verhaltensmerkmale Schlaf zugeordnet sind hoch konserviert im gesamten Tierreich und erhöhte Erregung Schwelle, Reversibilität mit Stimulation und anhaltenden Verhaltensstörungen Ruhe5enthalten. Diese Maßnahmen können verwendet werden, um Schlaf bei Tieren von der Nematoden Wurm, C. Elegans, durch Menschen6bis hin zu charakterisieren.
Die Verwendung von Verhaltensstörungen Ruhe, Schlaf zu charakterisieren erfordert automatisierte Tracking-Software. Mit tracking-Software, Perioden von Aktivität und Unbeweglichkeit sind bestimmt über mehrere Tage und lange Perioden der Inaktivität werden eingestuft, wie schlafen7,8. In den letzten Jahren wurden mehrere Tracking-Systeme für den Erwerb von Aktivitätsdaten unter eine Vielfalt an kleinen genetisch zugänglich Modellsysteme entwickelt; auch Würmer, Fruchtfliegen und Fisch9,10,11. Diese Programme werden durch die Software begleitet, die ermöglicht die automatische Verfolgung des tierischen Verhaltens, einschließlich der open-Source-Freeware und kommerziell verfügbare Software7,12,13,14 . Diese Systeme unterscheiden sich in ihrer Flexibilität und ermöglichen eine effiziente Sortierung und Charakterisierung von Schlaf Phänotypen in zahlreichen genetisch amendable Modelle.
Genetische Untersuchung des Schlafes in den Zebrafish Danio Rerio, führte zur Identifizierung von zahlreichen Genen und neuronale Schaltkreise, die Schlaf15,16Regeln. Dies hat ein leistungsfähiges System zur Erforschung der neuronalen Grundlagen des Schlafes in einem Wirbeltier Labortier, viel weniger ist bekannt über wie Schlaf entwickelt und wie natürliche trägt Variation Verordnung schlafen. Die mexikanische Cavefish, Astyanax Mexicanus (A.) Mexicanus), dramatische Unterschiede in den Schlaf, lokomotorischen Tätigkeit und Tagesrhythmus17,18entwickelt haben. Diese Fische gibt es Augen Oberfläche Fische, die die Flüsse von Mexiko und Süd-Texas und mindestens 29 bewohnen Populationen in der Sierra Del Abra-Region des nordöstlichen Mexiko19,20,21Höhle. Bemerkenswert ist, scheinen viele Verhaltensunterschiede, einschließlich Schlafverlust, unabhängig voneinander in mehreren Cavefish Populationen14,22entstanden sind. Cavefish bieten daher ein Modell für die Untersuchung die konvergente Entwicklung des Schlafes, circadiane, und Sozialverhalten.
Dieses Protokoll beschreibt ein System zur Messung von Schlaf und Bewegungsorgane Verhalten in A. Mexicanus Larven und Erwachsene. Eine maßgeschneiderte Infrarot-basierte Aufnahme-System ermöglicht video-Aufzeichnung von Tieren unter hellen und dunklen Bedingungen. Kommerziell verfügbare Software kann verwendet werden, um die Aktivität zu messen und benutzerdefinierte Makros werden verwendet, um verschiedene Aspekte der Inaktivität zu quantifizieren und Perioden des Schlafes zu bestimmen. Dieses Protokoll beschreibt auch experimentelle Änderungen für die Verfolgung der Aktivitäten von mehreren Tieren in einem Tank, die Möglichkeit bietet, die Wechselwirkungen zwischen Schlaf und Sozialverhalten zu untersuchen. Diese Systeme können auf Maß Schlaf, circadiane Verhalten und Bewegungsorgane Aktivität in zusätzliche Fischarten, darunter Zebrafisch und Stichlinge angewendet werden.

<table><tbody><tr><td>12-V-Netzteil</td><td>Umgebungsbeleuchtung</td><td>24 Watt 12-VDC-Netzteil</td><td></td></tr><tr><td>Trennwände aus Acryl (Erwachsene)</td><td>TAP Kunststoff</td><td></td><td>Bestellen Sie die Blätter in den gewünschten Größen</td></tr><tr><td>Infrarotlichtquelle für Erwachsene</td><td>Umweltleuchten 24 Watt 12-VDC-Netzteil</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Akkupack</td><td>CyberPower</td><td>CP850PFCLCD</td><td></td></tr><tr><td>Kameraobjektiv (Erwachsene)</td><td>Navitar Zoom 7000</td><td>Zoom 7000</td><td></td></tr><tr><td>Kameraobjektiv (larval)</td><td>Fujian 35mm f/1.7</td><td>B01CHX7668</td><td>Kaufen bei Amazon</td></tr><tr><td>Kameraobjektivadapter</td><td>d</td><td>1524219</td><td></td></tr><tr><td>Kamerahalterung</td><td>CowboyStudio Super Clamp</td><td>B002LV7X1K</td><td>Kaufen bei Amazon</td></tr><tr><td>Aquarium</td><td>Deep Blue Professional</td><td>ADB11006</td><td></td></tr><tr><td>Kühlkörper (Erwachsene)</td><td>M-D </td><td>Bauprodukte Artikelnummer: 61085</td><td>Zuschnitt</td></tr><tr><td>Kühlkörper (Larve)</td><td>M-D Bauprodukte</td><td>Artikelnummer: 57000</td><td>Zuschnitt für</td></tr><tr><td>Infrarotleuchten (Erwachsene)</td><td>Umweltleuchten Infrarot 850 nm 5050 LED-Streifen</td><td>irrf850-5050-60-reel</td><td>Passend für</td></tr><tr><td>Infrarotleuchten (Larve)</td><td>LED World</td><td>B00MO9H7H4</td><td>Kaufen bei Amazon</td></tr><tr><td>IR-diffundierendes Acryl</td><td>TAP Kunststoff</td><td></td><td>Bestellen Sie Blätter in den Größen nach Bedarf</td></tr><tr><td>Laptop/Computer</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Jeder Laptop funktioniert.</td></tr><tr><td>LED-Leuchte</td><td>Chanzon 10 High Power Led Chip 3W Weiß (6000K-6500K/600mA-700mA/DC 3V-3,4V/3 Watt)</td><td>B06XKTRSP7</td><td>Verwendung mit Chanzon 25 Stück 1 W, 3 W, 5 W LED-Kühlkörper (2-polig Schwarz) Aluminium-Grundplatte Panel</td></tr><tr><td>Lichttimer</td><td>Century 24 Stunden Plug-in Mechanischer Timer Geerdete</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kunststoff-Wandhalterung für IR</td><td>Everbilt Kunststoff-Stecktafel</td><td>Modell # 17961</td><td></td></tr><tr><td>Netzkabel</td><td>BNTECHGO 22 Gauge Silikondraht</td><td>B01K4RPE0Y</td><td></td></tr><tr><td>Stromquelle</td><td>Rapid LED MOONLIGHT</td><td>DRIVER (350MA)</td><td></td></tr><tr><td>Gewebekulturplatten</td><td>Fisherbrand</td><td>12-Well (FB012928) 24-Well (FB012929)</td><td></td></tr><tr><td>Stativ Kugelkopf</td><td>Demon DB-44</td><td>B00TQ54CZO</td><td>Kaufen bei Amazon</td></tr><tr><td>USB Festplatte</td><td>Seagate 3TB Backup</td><td>STDT3000100</td><td></td></tr><tr><td>USB Webcam</td><td>Microsoft LifeCam</td><td>Q2F-00014</td><td>Kaufen bei Amazon</td></tr><tr><td>Wandhalterung für Kamera</td><td>LDR Industries 1/2" Stahlrohr</td><td>307 12X36</td><td>Montiert an der Wand mit Flansch und 90°; Rohrbogen. Könnte auch ein Stativ verwenden, um die Kamera zu halten.</td></tr></tbody></table>

automatisierte messungen des schlafes und bewegungsorgane aktivität im mexikanischen cavefish

Automated Measurements of Sleep and Locomotor Activity in Mexican Cavefish

Über Stämme zeichnet sich Schlaf durch hoch konservierte Verhaltensmerkmale, die gehören erhöhte Erregung Schwelle, rebound nach Schlafentzug und Perioden des Verhaltens Unbeweglichkeit konsolidiert. Die mexikanische Cavefish Astyanax Mexicanus (A. Mexicanus),, ist ein Modell für Studium Merkmal Evolution als Reaktion auf ökologische Störung. A. Mexicanus vorhanden wie Augen Oberfläche Wohnformen und mehrere blinde höhlenbewohnenden Bevölkerungen, die robuste morphologischen und verhaltensbezogene Unterschiede aufweisen. Schlafmangel ist in mehrere, unabhängig voneinander entwickelt Cavefish Bevölkerungen aufgetreten. Dieses Protokoll beschreibt eine Methodik zur Quantifizierung der Schlaf und Bewegungsorgane Aktivität in A. Mexicanus Höhle und Oberfläche Fisch. Eine kostengünstige Videoüberwachungssystem ermöglicht Verhaltens Bildgebung einzeln untergebracht Larven oder Erwachsene Fische über einen Zeitraum von einer Woche oder länger. Das System kann angewendet werden, um im Alter von 4 Tagen Post Befruchtung bis ins Erwachsenenalter zu fischen. Der Ansatz kann auch zur Messung der Auswirkungen sozialer Interaktionen auf den Schlaf durch Aufnahme mehrere Fische in einer einzigen Arena angepasst werden. Nach behavioral Aufnahmen Daten werden analysiert, mit tracking-Software automatisiert und Schlafanalyse ist mit benutzerdefinierte Skripts, die mehrere Schlaf Variablen einschließlich Dauer, Kampf und Kampf Anzahl quantifizieren verarbeitet. Dieses System kann auf Maß Schlaf, circadiane Verhalten und Bewegungsorgane Tätigkeit in fast alle Fischarten, darunter Zebrafisch und Stichlinge angewendet werden.

Larven im Alter von die 4-30 Dpf zuverlässig in den Custom-Build geschlossenen System in Abbildung 1beschriebenen aufgezeichnet werden kann. Das System beinhaltet IR und sichtbare Beleuchtung ermöglicht Aufnahmen unter hellen und dunklen Bedingungen unter verschiedenen Lichtverhältnissen sichtbar (Abb. 1A). Die Videos sind dann mit Tracking-Software (Abbildung 1 bC) analysiert und na...

Dieses Protokoll beschreibt die Methodik zur Quantifizierung der Bewegungsorgane Verhalten und Schlaf in der mexikanischen Cavefish. Frühere Analysen werden erweitert, um diese Verhaltensweisen in sozial untergebracht Fisch zu messen. Dieses System kann weit angewendet werden, um Schlaf und Aktivität in anderen Fischarten zu studieren.

Automatisierte Messungen des Schlafes und Bewegungsorgane Aktivität im mexikanischen Cavefish

Across phyla, sleep is characterized by highly conserved behavioral characteristics that include elevated arousal threshold, rebound following sleep ...

Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Schlaf und Aktivität in jeder Fischpopulation zu quantifizieren und hat das Potenzial, die Anzahl der Modellsysteme zu erweitern, die zur Untersuchung der Schlafregulierung verwendet werden. Der Vorteil dieser Technik ist ihre Flexibilität. Beispielsweise können Fische in einer Vielzahl von Arenagrößen oder in sing- oder gruppengestatten den Tieren verfolgt werden.Eine Stärke der Messung des Schlafes in diesem System ist die Amenabilität der Methode für Hochdurchsatz-Medikament oder genetisches Screening. Wir haben diese Methode auf die Untersuchung der Evolution des Schlafes in zwei verschiedenen Populationen von Höhlenfischen angewendet, die dramatisch unterschiedliche Schlafphänotypen zeigen. Obwohl es schwierig sein kann, ein System für Verhaltensbilder einzurichten, bietet unser System eine kostengünstige Methode zur Untersuchung von Larven und erwachsenen Fischen.Um das System zu bauen, um das Bewegungsverhalten für das Studium von Schlaf und zirkadianen Rhythmen in Larven A.mexicanus genau zu verfolgen, verwenden Sie 0,33 Zentimeter dickes weißes Zeichen Acryl, um eine Plattform für das Larvenverfolgungssystem zu konstruieren. Platzieren Sie die Aufnahmeplattform auf dem beleuchteten quadratischen Kühlkörper, auf dem sich fischhaltige Arenen während der Verhaltensverfolgungsexperimente befinden, und legen Sie ein zweites Acryl in die Box zwischen den Lichtern im Tiergehäuse, um das Infrarot für optimale Beleuchtung und Kontrast zu diffundieren. Platzieren Sie die gesamte Larvenverfolgungsstufe und Beleuchtung in einem geschlossenen Kunststoffrohr.Verwenden Sie ein Drehwerkzeug, um die Linse von einer experimentell geeigneten Webcam zu entfernen. Entfernen Sie die kleinen Schrauben auf der Rückseite der Kamera, um das Innengehäuse zu entfernen, und entfernen Sie die kleinen Schrauben im Inneren des Gehäuses der Kamera, um den Rest der Linse zu lösen. Verwenden Sie einen kleinen Schraubendreher, um alle Teile des Linsengehäuses zu entfernen, die nach dem Schneiden der Linse übrig bleiben.Und entfernen Sie die blaue Leuchtdiode auf dem oberen Teil des ladungsgekoppelten Geräts oder CCD-Gehäuses. Als nächstes kehren Sie das Innengehäuse in seine ursprüngliche Ausrichtung zurück, bevor Sie die beiden äußeren Schrauben wieder in ihre ursprüngliche Position schrauben. Verwenden Sie eine kleine Säge, um die Innenseite der Kamera zu leiten, damit die Kamera mit einem abgerundeten Kunststoff-Routing-Bit ausgestattet werden kann, das den zusätzlichen Kunststoff glättet, bis er einen Objektivadapter begleiten kann.Installieren Sie einen Infrarot-Passfilter so nah wie möglich an der CCD, ohne direkten Kontakt mit der Kamera herzustellen, und schrauben Sie den Adapter eines 35-Millimeter-Fixobjektivs an der Vorderseite der Kamera in die Rückseite des Objektivs. Legen Sie dann die Kamera und das Objektiv in das Loch, das in den Deckel an der Oberseite des Rohres gebohrt wird, das die Bühne und das Licht beherbergt, und befestigen Sie den USB-Stick an dem Computer, auf dem die Tiere aufgezeichnet werden. Um ein Schlafsystem für erwachsene Fische zu konstruieren, schneiden Sie zunächst Infrarotstreifen in etwa 46-Zentimeter-Intervallen.Und legen Sie eine 46 mal fünf mal 0,32-Zentimeter 9%Licht Pass weiße Sendezeichen Acrylplatte direkt vor jedem Infrarot-Lichtstreifen, um das Infrarotlicht zu diffundieren. Legen Sie dann alle Tanks auf ein Rack, das die hintere Infrarotbeleuchtung unterstützt, und verwenden Sie undurchsichtige Kunststoffteiler und 10-Liter-Glastanks, um individuelle Arenen zu schaffen. Um die motorische Aktivität der mexikanischen Tetrafische zu erfassen, legen Sie Tag vier bis sechs Nachdüngungsfische in einzelne Brunnen einer 24-Well-Gewebeplatte und Tage 20 bis 30 nach der Befruchtung in einzelnen Brunnen einer Sechs-Brunnen-Gewebeplatte.Aufzeichnen von Erwachsenen-Tetra-Schlaf und Aktivität in einem sozialen Einrichtungshaus bis zu fünf Erwachsene pro 10-Liter-Tank mit oder ohne Trennwände. In diesem repräsentativen Experiment zeigten Larvenfische aus drei unabhängigen Höhlenfischpopulationen eine signifikante Verringerung des Schlafes im Vergleich zu Oberflächenfischen. Diese Schlafproduktion ist in allen getesteten Jahren konsistent, da der Schlaf auch bei erwachsenen Pachon-, Molino- und Tinaja-Höhlenfischen im Vergleich zu Oberflächenfischen deutlich reduziert wurde.Bemerkenswert ist, dass Sozialwohnungen den Schlaf in Oberflächenfischen robust reduzierten, ohne den Schlaf in Pacho-Höhlenfischen zu beeinträchtigen, wahrscheinlich aufgrund eines Kellereffekts in den Höhlenfischpopulationen. Bei der Aufnahme der Fische sollte darauf geachtet werden, dass die Kamerabeleuchtung optimal ist, um das Signal des Fisches relativ zum Hintergrund zu verbessern. Für dieses Protokoll ist eine grundlegende Befehlszeilencodierung erforderlich, die vollständig im Text beschrieben ist und für jede Lab-Einstellung zugänglich sein sollte.Dieses Protokoll hat zu zahlreichen Fragen über die Schlafentwicklung geführt und wird derzeit für Drogenbildschirme verwendet, schlafverhalten verfolgen und verstehen, wie soziales Verhalten den Schlaf beeinflusst.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Behavior

Verhalten

Wir beschreiben Verfahren zur Erfassung täglichen Bewegungsaktivität...

Assaying Bewegungsaktivität zu zirkadianen Rhythmen Study and Sleep Parameter in Drosophila</em

Es wird ein Verfahren zur Manipulation der Aktivität der zerebralen kortikalen Pyramidenzellen optogenetically während das Elektroenzephalogramm, Elektromyogramm, und zerebrale Laktatkonzentration überwacht werden beschrieben. Experimentelle Aufnahmen werden auf Kabel-tethered Mäusen durchgeführt, während sie spontane Schlaf / Wach-Zyklen. Optogenetische Ausrüstung wird in unserem Labor zusammengebaut; Kontrollgerät ist kommerziell erhältlich.

Gleichzeitige Elektroenzephalographie, Real-time Messung der Laktat-Konzentration und optogenetische Manipulation der neuronalen Aktivität in der Nagetier Cerebral Cortex

Dieses Video zeigt ein Protokoll für die Implantation einer Elektroenzephalogramm (EEG) und Elektromyogramm (EMG) Elektrodenanordnung in eine anästhesierte Maus. Der Prozess umfasst die Befestigung der Maus auf einem stereotaktischen Rahmen, einen Mittellinienschnitt im Schädel, das Bohren von Löchern für die Elektroden und das Fixieren der Elektrodeneinheit für die Signalaufzeichnung. Nach der Wiederherstellung wird das Schlaf-Wach-Verhalten der Maus anhand der aufgezeichneten Signale...

Analyse des Schlafverhaltens bei Mäusen durch Elektroenzephalogramm und Elektromyogramm-Aufzeichnungen

Hier stellen wir experimentelle und analytische Verfahren vor, um die zeitliche Dynamik der neuronalen und kardialen Variablen des Nicht-REM-Schlafes bei Mäusen zu beschreiben, die die Schlafreaktion auf akustische Reize modulieren.

Quantifizierung der infra-langsamen Dynamik der spektralen Kraft und der Herzfrequenz bei schlafenden Mäusen

Wir beschreiben eine Hochdurchsatz-Methode zur Messung der Schlaf durch Activity based Überwachung Haus-Käfig. Diese Methode bietet Vorteile gegenüber herkömmlichen EEG-basierten Methoden. Es kann ist gut für die Bestimmung der gesamten Schlafdauer validiert und ein mächtiges Werkzeug, Schlaf in Nager-Modelle der menschlichen Krankheit zu überwachen.

Nicht-invasive High-Throughput-Bestimmung der Schlafdauer bei Nagern

Dieser Artikel stellt eine nicht-invasive Biomonitoring-System für die kontinuierliche Aufzeichnung und Analyse der Krebse Herz- und motorischen Aktivitäten. Dieses System besteht aus einem Nah-Infrarot-optischen Sensor, Video-Tracking-Modul und Software für die Bewertung der Krebse Herzschläge, spiegelt seine physiologischen Zustand und Krebse Verhalten während der Herzschlag Schwankungen charakterisiert.

Kontinuierliche nicht-invasive Messung der Krebse Herz- und Verhaltens-Aktivitäten

In diesem Protokoll wir zeigen, wie Astyanax Mexicanus Erwachsene zu züchten, die Larven zu erhöhen, und ganze-Mount Immunohistochemistry auf Post-Larven Fische zu vergleichen die Phänotypen der Oberfläche und Höhle Morphotypen führen.

Anhebung der mexikanischen Tetra Astyanax Mexicanus für Analyse der Post-larval Phänotypen und vollständig-hängen Immunohistochemistry

Wir beschreiben Ansätze für die Manipulation von Genen im evolutionären Modellsystem Astyanax Mexicanus. Drei verschiedene Techniken beschrieben: Tol2-vermittelte Transgenese, gezielte Manipulation des Genoms mit CRISPR/Cas9 und Zuschlag des Ausdrucks mit Morpholinos. Diese Tools sollten die direkte Untersuchung von Genen zugrunde liegen die Unterschiede zwischen Oberfläche und höhlenbewohnenden Formen erleichtern.

Manipulation der Genfunktion in mexikanischen Cavefish

Hier präsentieren wir Methoden für Hochdurchsatz-Studie eine Reihe von mexikanischen Cavefish, Verhaltensweisen und lebenswichtigen Färbung eines Mechanosensory-Systems. Diese Methoden nutzen freier Software und kundenspezifische Skripte, bietet eine praktische und kostengünstige Methode für das Studium des Verhaltens.

Verhaltens-Tracking und Neuromast Darstellung der mexikanischen Cavefish

Laufaktivität (LMA) ist eine einfache und leicht durchgeführt Messung des Verhaltens bei Mäusen. Kopplung von Video-Tracking-Software (VTS) und LMA ermöglicht die Verbesserung der Spezifität und Sensitivität, vor allem, wenn mit dem Handbuch, Linie überqueren Methode der LMA Analyse verglichen. Zusätzlich VTS ermöglicht langfristige Verfolgung von Maus LMA.

Maus Kurz-und Langzeit-Bewegungsaktivität von Video-Tracking-Software analysiert

Erfahren Sie die automatisierte Messung von Schlaf und Bewegungsaktivität im mexikanischen Höhlenfisch. Diese Methode quantifiziert Verhaltensmuster in sozialer Haltung und ist auf andere Fischarten übertragbar.

Automatisierte Messungen des Schlafes und Bewegungsorgane Aktivität im mexikanischen Cavefish

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