Automatisierte Messungen des Schlafes und Bewegungsorgane Aktivität im mexikanischen Cavefish

Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Schlaf und Aktivität in jeder Fischpopulation zu quantifizieren und hat das Potenzial, die Anzahl der Modellsysteme zu erweitern, die zur Untersuchung der Schlafregulierung verwendet werden. Der Vorteil dieser Technik ist ihre Flexibilität. Beispielsweise können Fische in einer Vielzahl von Arenagrößen oder in sing- oder gruppengestatten den Tieren verfolgt werden.

Eine Stärke der Messung des Schlafes in diesem System ist die Amenabilität der Methode für Hochdurchsatz-Medikament oder genetisches Screening. Wir haben diese Methode auf die Untersuchung der Evolution des Schlafes in zwei verschiedenen Populationen von Höhlenfischen angewendet, die dramatisch unterschiedliche Schlafphänotypen zeigen. Obwohl es schwierig sein kann, ein System für Verhaltensbilder einzurichten, bietet unser System eine kostengünstige Methode zur Untersuchung von Larven und erwachsenen Fischen.

Um das System zu bauen, um das Bewegungsverhalten für das Studium von Schlaf und zirkadianen Rhythmen in Larven A.mexicanus genau zu verfolgen, verwenden Sie 0,33 Zentimeter dickes weißes Zeichen Acryl, um eine Plattform für das Larvenverfolgungssystem zu konstruieren. Platzieren Sie die Aufnahmeplattform auf dem beleuchteten quadratischen Kühlkörper, auf dem sich fischhaltige Arenen während der Verhaltensverfolgungsexperimente befinden, und legen Sie ein zweites Acryl in die Box zwischen den Lichtern im Tiergehäuse, um das Infrarot für optimale Beleuchtung und Kontrast zu diffundieren. Platzieren Sie die gesamte Larvenverfolgungsstufe und Beleuchtung in einem geschlossenen Kunststoffrohr.

Verwenden Sie ein Drehwerkzeug, um die Linse von einer experimentell geeigneten Webcam zu entfernen. Entfernen Sie die kleinen Schrauben auf der Rückseite der Kamera, um das Innengehäuse zu entfernen, und entfernen Sie die kleinen Schrauben im Inneren des Gehäuses der Kamera, um den Rest der Linse zu lösen. Verwenden Sie einen kleinen Schraubendreher, um alle Teile des Linsengehäuses zu entfernen, die nach dem Schneiden der Linse übrig bleiben.

Und entfernen Sie die blaue Leuchtdiode auf dem oberen Teil des ladungsgekoppelten Geräts oder CCD-Gehäuses. Als nächstes kehren Sie das Innengehäuse in seine ursprüngliche Ausrichtung zurück, bevor Sie die beiden äußeren Schrauben wieder in ihre ursprüngliche Position schrauben. Verwenden Sie eine kleine Säge, um die Innenseite der Kamera zu leiten, damit die Kamera mit einem abgerundeten Kunststoff-Routing-Bit ausgestattet werden kann, das den zusätzlichen Kunststoff glättet, bis er einen Objektivadapter begleiten kann.

Installieren Sie einen Infrarot-Passfilter so nah wie möglich an der CCD, ohne direkten Kontakt mit der Kamera herzustellen, und schrauben Sie den Adapter eines 35-Millimeter-Fixobjektivs an der Vorderseite der Kamera in die Rückseite des Objektivs. Legen Sie dann die Kamera und das Objektiv in das Loch, das in den Deckel an der Oberseite des Rohres gebohrt wird, das die Bühne und das Licht beherbergt, und befestigen Sie den USB-Stick an dem Computer, auf dem die Tiere aufgezeichnet werden. Um ein Schlafsystem für erwachsene Fische zu konstruieren, schneiden Sie zunächst Infrarotstreifen in etwa 46-Zentimeter-Intervallen.

Und legen Sie eine 46 mal fünf mal 0,32-Zentimeter 9%Licht Pass weiße Sendezeichen Acrylplatte direkt vor jedem Infrarot-Lichtstreifen, um das Infrarotlicht zu diffundieren. Legen Sie dann alle Tanks auf ein Rack, das die hintere Infrarotbeleuchtung unterstützt, und verwenden Sie undurchsichtige Kunststoffteiler und 10-Liter-Glastanks, um individuelle Arenen zu schaffen. Um die motorische Aktivität der mexikanischen Tetrafische zu erfassen, legen Sie Tag vier bis sechs Nachdüngungsfische in einzelne Brunnen einer 24-Well-Gewebeplatte und Tage 20 bis 30 nach der Befruchtung in einzelnen Brunnen einer Sechs-Brunnen-Gewebeplatte.

Aufzeichnen von Erwachsenen-Tetra-Schlaf und Aktivität in einem sozialen Einrichtungshaus bis zu fünf Erwachsene pro 10-Liter-Tank mit oder ohne Trennwände. In diesem repräsentativen Experiment zeigten Larvenfische aus drei unabhängigen Höhlenfischpopulationen eine signifikante Verringerung des Schlafes im Vergleich zu Oberflächenfischen. Diese Schlafproduktion ist in allen getesteten Jahren konsistent, da der Schlaf auch bei erwachsenen Pachon-, Molino- und Tinaja-Höhlenfischen im Vergleich zu Oberflächenfischen deutlich reduziert wurde.

Bemerkenswert ist, dass Sozialwohnungen den Schlaf in Oberflächenfischen robust reduzierten, ohne den Schlaf in Pacho-Höhlenfischen zu beeinträchtigen, wahrscheinlich aufgrund eines Kellereffekts in den Höhlenfischpopulationen. Bei der Aufnahme der Fische sollte darauf geachtet werden, dass die Kamerabeleuchtung optimal ist, um das Signal des Fisches relativ zum Hintergrund zu verbessern. Für dieses Protokoll ist eine grundlegende Befehlszeilencodierung erforderlich, die vollständig im Text beschrieben ist und für jede Lab-Einstellung zugänglich sein sollte.

Dieses Protokoll hat zu zahlreichen Fragen über die Schlafentwicklung geführt und wird derzeit für Drogenbildschirme verwendet, schlafverhalten verfolgen und verstehen, wie soziales Verhalten den Schlaf beeinflusst.