Name: Proteom-weite Quantifizierung des Benennens Homogenität auf der Ebene des einzelnen Moleküls (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Lernen Sie die proteomweite Quantifizierung der Markierungshomogenität auf Einzelmolekülebene. Diese Methode ermöglicht die direkte Beobachtung heterogener Proteinpopulationen und eröffnet neue diagnostische Anwendungen.

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Die Autoren danken Masae Ohno und Kazuya Nishimura für experimentelle Unterstützung und Beratung. Diese Arbeit wurde von PRESTO (JPMJPR15F7), Japan Science and Technology Agency, Grants-in-aid für junge Wissenschaftler (A) (24687022), anspruchsvolle Pionierforschung (26650055) und wissenschaftliche Forschung an innovativen Bereichen (23115005), Japan Society for unterstützt. die Förderung der Wissenschaft und durch Zuschüsse von der Takeda Science Foundation und der Mochida Memorial Foundation für medizinische und pharmazeutische Forschung. S.l. räumt Unterstützung aus dem Programm von RIKEN International Programm zuordnen (IPA).

1. Zelle-Vorbereitung
<ol><li>HeLa-Zellen in einer 10 cm Petrischale bei 37 ° C kultivieren unter 5 % CO2 in Dulbecco modifizierten Adlerhorst 10 % fötalen Rinderserum-haltigem Medium.</li>
	<li>Exponentiell wachsende Zellen zu sammeln, sobald sie 70 % Konfluenz, nach ATCC Anweisungen17erreicht haben.<ol>
<li>Spülen Sie die Zellen mit 5 mL 1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) (pH 7,4). PBS zu entfernen.</li>
		<li>Fügen Sie 1 mL 0,1 % Trypsin-Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA). 5 min bei 37 ° c inkubieren</li>
		<li>Überwachen Sie das Fortschreiten der Zelle Dissoziation von Mikroskopie.</li>
		<li>Zellen werden Runde und aus der Schale gelöst sind, fügen Sie 4 mL Wachstumsmedium und brechen Sie Zelle Agglomeration durch Pipettieren zu.</li>
		<li>Die Anzahl der Zellen, die Zelle Zähler.</li>
		<li>150 X g für 10 min in ein Zentrifugenröhrchen zentrifugiert. Entfernen Sie das Medium und Aufschwemmen der Zelle Pellet mit 5 mL 1 X PBS (pH 7,4).</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 1.2.6. Aufzuwirbeln Sie Zellen mit 1 X PBS-Puffer (pH 7,4), eine Endkonzentration von 106 Zellen/mL mit der Anzahl in Schritt 1.2.5. Hinweis: Die Zellsuspension kann regelmÄÑig und bei-80 ° C gelagert mehrere Monate sein. Einen Frost/Tau-Zyklus wiederholen sollte vermieden werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) Zell-Lyse und fluoreszierende Kennzeichnung
<ol><li>10 mL Lyse Puffer zu machen (0,1 M Borat, 1 % Natrium-Dodecyl-Sulfat (SDS) und 1 % Tween 20). Passen Sie auf pH 12 mit 2 M NaOH. Achtung: Konzentrierte NaOH ist ätzend. Geeignete Handschuhe und Brille zu tragen, wenn Sie diese Lösung vorbereiten. Hinweis: Lysiereinrichtung Puffer kann bis zu einer Woche bei Raumtemperatur aufbewahrt werden.</li>
	<li>Mix 100 μL der Lyse Puffer mit 1 μL 1 M Dithiothreitol (DTT) und 4 μL des 50 %-3-[(3-cholamidopropyl)-Dimethylammonio] -1-Propanesulfonate (CHAPS).</li>
	<li>Mix 1 μL der Zellkultur (ca. 1.000 Zellen) mit dem gemischten Lysiereinrichtung Puffer aus Schritt 2.2. Pipettieren langsam um Luftblasen zu vermeiden, um die Lösung zu homogenisieren. Inkubieren Sie im Dunkeln bei Raumtemperatur für 5 min mit sanften Agitation. Neu die Lösung durch Pipettieren langsam zu homogenisieren.</li>
	<li>Fügen Sie 1 μL von 2 μg/mL Cy3 NHS-Ester Farbstoff. Pipettieren langsam um Luftblasen zu vermeiden, um die Lösung zu homogenisieren. 5 min im Dunkeln bei Raumtemperatur unter schonenden rühren inkubieren. Hinweis: Der hohe pH-Wert dieses Puffers führt Neutralisierung der Lysin-Reste in Proteinen, was zu einer höheren Reaktivität.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Zugabe von 1 μl 2 μg/ml Cy3 NHS-Ester Farbstoff. Pipettieren langsam um Luftblasen zu vermeiden, um die Lösung zu homogenisieren. 10 min im Dunkeln bei Raumtemperatur unter schonenden rühren inkubieren. Hinweis: Dieses wiederholte Zugabe von NHS-Ester Farbstoff kann die Kennzeichnung Effizienz zu steigern, weil einige der Farbstoff Cy3 NHS-Ester hydrolysiert und durch den hohen pH-Wert des Puffers Reaktion deaktiviert.</li>
	<li>Passen Sie auf pH 7,2 durch Zugabe von 100 μl von 0,8 M 4-(2-hydroxyethyl)-1-Piperazineethanesulfonic Säure (HEPES)-NaOH pH 7,2 um die Reaktion zu stillen. Pipettieren langsam um Luftblasen zu vermeiden, um die Lösung zu homogenisieren.</li>
	<li>Fügen Sie 20 μL 19 mg/mL Biotin-(Polyethylenglykol (PEG))2-Amine und 5 μL von 20 mg/mL 1-Ethyl - 3-(3-Dimethylaminopropyl) Carbodiimide (EDC). Pipettieren langsam um Luftblasen zu vermeiden, um die Lösung zu homogenisieren. 1 h im Dunkeln bei Raumtemperatur unter schonenden rühren inkubieren. Hinweis: Dieser Schritt Biotinylierungen ist notwendig, die Proteinmoleküle auf ein Mikroskop-Deckglas bei einer festen Dichte und mit keine Vorliebe für Protein-Arten zu beheben.</li>
	<li>Umgesetzte Kennzeichnung Reagenzien zu entfernen und die Probe mit einer Ultrafiltration Spalte mit 10 kDa Cutoff, nach den Anweisungen des Herstellers konzentrieren. Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Die Probe kann für mehrere Wochen bei-80 ° C gelagert werden.</li>
</ol>(3) Proteom Trennung und Verwertung
<ol><li>4 x SDS-Probenpuffer (200 mM Tris-HCl pH 6,8, 4 % SDS, 4 % Glycerin und 0,4 % Bromophenol blue) hinzufügen. Hinweis: Zur Vermeidung von Beschädigungen der Farbstoff die Protein-Probe sollte nicht erhitzt werden, wie im standard SDS-PAGE und bei Raumtemperatur aufbewahrt werden.</li>
	<li>Durchführen Sie standard-SDS-PAGE für die Protein-Probe und eine molekulare Leiter, mit 20 % Acrylamid Gel. Migrieren Sie die Probe in das Gel in eine konstante Spannung (160 V) bis die Migration beendet vorne nur das Gel.</li>
	<li>Bild das Gel um die Position der Protein-Bands (Abbildung 3) identifizieren.</li>
	<li>Schneiden Sie die Gel-Teile einschließlich Proteinfraktionen von Interesse mit einer scharfen Klinge, basierend auf den Band-Positionen. Fraktionierung, 16, 23, 55 und 120 kDa Gipfeln und 19-25, 25-32, 32 – 42, 42 – 54, 54 – 69, 69 / 97, 97-136 und 136 – 226 kDa Regionen sind in Abbildung 3dargestellt.</li>
	<li>Proteine mit einem Dialysator durch Electroelution mit einer Porengröße von 6 – 8 kDa, nach den Anweisungen des Herstellers zu extrahieren. Hinweis: Die extrahierte Probe kann für mehrere Wochen bei-80 ° C gelagert werden.</li>
</ol>(4) Mikroskop-Deckglas-Vorbereitung
<ol><li>Bereiten Sie 200 μL des Avidin Puffer (5 mM HEPES-NaOH pH 7,2, 10 ng/mL Avidin und Rinderserumalbumin (BSA) 2 mg/mL) für jede Probe.</li>
	<li>Bereiten Sie Deckgläsern 22 mm x 22 mm und 0,15 mm Dicke. Setzen Sie die Deckgläsern um Luft-Plasma mit einem Plasma cleaner für 1 min zu reinigen und aktivieren ihre Oberflächen.</li>
	<li>Mantel der Deckgläsern mit Avidin durch Spin-Coating 200 μL der Avidin-Puffer mit einem Spin Coater für 5 Sekunden bei 500 u/min, gefolgt von 30 Sekunden bei 1.000 u/min. Inkubieren Sie Deckgläsern für 15 min bei Raumtemperatur trocknen lassen.</li>
	<li>Die Protein-Probe Deckgläsern vorbereiten.<ol>
<li>Verdünnen Sie die Protein-Probe (ab 3.5) 100 Mal in 5 mM HEPES-NaOH pH 7,2.</li>
		<li>Platz 100 μL der verdünnten Probe auf der Oberfläche in der Mitte des Avidin beschichtete Deckglas (aus Schritt 4.3).</li>
		<li>In der Dunkelheit für 15 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie die Positivkontrolle.<ol>
<li>Platz 100 μL von 10 ng/mL gereinigt fluoreszierende Biotin in 5 mM HEPES-NaOH pH 7,2 in der Mitte des das Avidin beschichtete Deckglas (aus Schritt 4.3).</li>
		<li>In der Dunkelheit für 15 min bei Raumtemperatur inkubieren. Hinweis: Diese Positivkontrolle Deckglas stellt die Dichte des Avidin Bindung Spots, dient zum Berechnen der LO.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie die negative-Kontrolle.<ol>
<li>Spin-Mantel das Plasma gereinigt Deckglas mit 200 μl 5 mm HEPES-NaOH und 2 mg/mL BSA (ohne Avidin).</li>
		<li>Inkubieren Sie für 15 min bei Raumtemperatur trocknen lassen.</li>
		<li>Fügen Sie 100 μL von 10 ng/mL gereinigt fluoreszierende Biotin in 5 mM HEPES-NaOH pH 7,2.</li>
		<li>In der Dunkelheit für 15 min bei Raumtemperatur inkubieren. Hinweis: Diese Negativkontrolle Deckglas stellt die Menge der unspezifischen Bindung von fluoreszierenden Biotin, das Deckglas ohne Avidin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Spülen Sie jedes Deckglas mit 200 μl destilliertes Wasser durch an den Rändern des Deckglases um die Mitte des Deckglases mit der Spitze berühren nicht zu pipettieren. Wiederholen Sie diese waschen dreimal. Hinweis: Nach dem Absaugen von Wasser auf das Deckglas, sollte Wasser sofort wieder auf das Deckglas zu verhindern, dass es völlig austrocknen platziert werden.</li>
	<li>Luft-Plasma auf die gleiche Anzahl von Deckgläsern wie in Schritt 4.2 aussetzen.</li>
	<li>Legen Sie die gereinigten Deckgläschen auf Probe-gebundenen Deckglas ab Schritt 4.7 um Austrocknen zu vermeiden.</li>
</ol>5. Beobachtung mit Einzelmolekül-Fluoreszenz-Mikroskopie
<ol><li>Starten Sie ein Fluoreszenzmikroskop Weitfeld- oder evaneszenten Feld. Achtung: Direkte oder verstreuten Laserstrahlung kann dazu führen, dass Auge oder Hautschäden. Geeignete Schutzbrille und schirmen den Lichtweg Laser. Hinweis: Das Mikroskop-Setup finden Sie auf unserer früheren Publikation16. Kurz gesagt, kann ein Weitfeld- oder evaneszenten Feld Fluoreszenzmikroskop, ausgestattet mit einer Hochleistungs-488 nm Laseranregung, ein hoher numerischer Apertur-Objektiv und eine hochempfindliche Kamera für diese Messung verwendet werden. Darüber hinaus sind für eine automatisierte Messung eine computergesteuerte XY translationale Probentisch, mechanische Fensterläden für Laser Erregungen und ein Autofokus-System empfohlen, installiert werden.</li>
	<li>Das Deckglas auf dem Mikroskop und finden im Mittelpunkt.</li>
	<li>Führen Sie einen Kachel-Scan um mindestens 100 Bilder zu erhalten. Hinweis: Die Laser-Beleuchtung sollte mit mechanischen Fensterläden zum Beispiel ausgesetzt werden, nur dann, wenn Bilder mit der Kamera zur Minimierung von Immunofluoreszenz Aufnahme gesteuert werden. Es gibt viele Beispiele, empfiehlt automatisierte Messung mit Hilfe eines Computerprogramms die Mikroskop-Geräte steuern. Jedes Bild umfasst in der Regel 100 – 500 Einzelmolekül Spots, wenn ein 60 X Objektiv verwenden.</li>
</ol>6. Bild-Analyse und Gewinnung von Informationen
<ol><li>Wenn das Bild Unebenheiten durch die Laser-Beleuchtung-Muster hat, durchführen Sie Bildverarbeitung zu18korrigieren.<ol>
<li>Erwerben Sie ein Referenzbild durch Messung mit einem Deckglas Stichprobe aus gleichmäßig verteilt Farbstoffe mit Hilfe einer Kamera Einstellung die gleiche wie in Schritt 5.3.</li>
		<li>Erwerben Sie ein Offset Bild durch Messung mit keine Laseranregung mit der gleichen Kameraeinstellung.</li>
		<li>Subtrahieren Sie jeder Pixelwert in jedem Beispiel-Bild und die Referenz-Bild mit dem Wert des Offset Bildes.</li>
		<li>Jeder Pixelwert in die subtrahierten Beispielbilder durch den Wert im subtrahierten Referenzbild zu teilen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sammeln Sie ordnungsgemäß erworbenen Bilder zu und entfernen Sie den Bildhintergrund.<ol>
<li>Bilder mit großen fluoreszierende Aggregaten manuell zu entfernen.</li>
		<li>Entfernen Sie den Bildhintergrund durch die Anwendung der rollenden Kugel Algorithmus19 mit einem Ball-Radius von 50 Pixeln mit ImageJ20.</li>
		<li>Schärfen der Bilder durch Subtraktion unscharfe Bilder mit ImageJ (schärfen Bild-Funktion).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Finden Sie und analysieren Sie Einzelmolekül-Spots in Bildern.<ol>
<li>Einzelmolekül-Spots mit dem Yen Schwelle Algorithmus21 mit ImageJ zu identifizieren.</li>
		<li>Filtern Sie Plätze mit weniger als zwei Pixel auszuschließende Dunkelrauschen der Kamera und stellen mehr als 20 Pixel um Aggregationen von Proteinen mit ImageJ (ROI-Manager) auszuschließen.</li>
		<li>Die Anzahl der Plätze in jedem Bild. Mit der Beleuchtung korrigierten Bilder (Schritt 6.1.4), analysieren total Intensitäten innerhalb von Pixeln zu jedem Spot mit ImageJ.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Berechnen Sie die Kennzeichnung Auslastung (LO) mithilfe der folgenden Formel: LO = (Anzahl der zählt in der Probe / Anzahl der Grafen in die Positivkontrolle) X 100</li>
	<li>Berechnen Sie die durchschnittliche Anzahl von Fluoreszenzfarbstoffen gesprungen, um ein einziges Eiweißmolekül (N̄Farbstoff).<ol>
<li>Analysieren Sie ein Histogramm der Intensitäten von jedem Ort. Hinweis: Das Histogramm zeigt in der Regel mehrere Gipfel, und jede Spitze steht eine unterschiedliche Anzahl von Farbstoffmoleküle an ein Protein gebunden. Die erste, zweite und dritte Gipfel im Histogramm entspricht 1, 2 und 3 Moleküle, beziehungsweise.</li>
		<li>Berechnen Sie die durchschnittliche Intensität aus dem Histogramm. Auch berechnen Sie der Peak-Intensität des ersten Peaks durch Anwendung ein "glockenförmig" Fitting.</li>
		<li>Berechnen Sie N̄Farbstoff , indem man die durchschnittliche Intensität mit der Peak-Intensität.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären die folgenden konkurrierenden finanziellen vorgibt: RIKEN hat auf diese Ergebnisse mit S.L. und Y.T genannt als Miterfinder eine Patentanmeldung eingereicht.

Dieses Whitepaper beschreibt ein Protokoll, um die Kennzeichnung Homogenität der einzelnen markierten Protein-Arten in den Zellen nach der Trennung mit SDS-PAGE (Schritt 3) zu quantifizieren. Das Trennverfahren kann mit anderen Methoden wie flüssige Chromatographie oder Kapillarelektrophorese, ersetzt werden, die Trennung und Fraktionierung von zellulären Proteinen mit hoher Auflösung erfordert spezielle Ausrüstung23ermöglichen. Die Kennzeichnung Methode mit NHS-Ester in das aktuelle Protokoll kan...

Proteomanalyse, deren Ziel es ist, die Gesamtheit der Protein-Moleküle in die Zelle ausgedrückt zu quantifizieren, ist ein wertvoller Ansatz an aktuellen biologischen und medizinischen Studien. Diese Analyse basiert häufig auf Massenspektrometrie, die Protein-Arten anhand der Spektren erzeugt durch Protein Ionisation1,2,3identifiziert. Eine alternative Methode für Proteomanalyse ist Elektrophorese, einschließlich Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE), Kapillarelektrophorese und zweidimensionale (2D) Gelelektrophorese. Diese Methode beruht auf unspezifischen fluoreszierende Kennzeichnung der Protein-Moleküle in den analysierten Zellen, gefolgt von elektrophoretischen Trennung und Erkennung und Quantifizierung der einzelnen Protein-Arten. Zur Erreichung der erforderlichen unspezifische Protein-Kennzeichnung ist eine Strategie, fluoreszierende Farbstoffe zu verwenden, die an Proteine über elektrostatische und hydrophobe Interaktionen, wie Coomassie Blau und Sypro-Ruby4,5,6 binden können . Eine alternative Strategie ist mit kovalente Kennzeichnung mit Farbstoffen mit N-Hydroxysuccinimide (NHS) Ester oder Maleimide, die kovalent an Proteine durch gemeinsame Rückstände wie primäre Amine und Thiole binden kann, bzw.7, 8.
Unterdessen ist die Nachweisempfindlichkeit Fluoreszenz ideal für Low-Fülle Proteine und kleine Anzahl von Zellen zu analysieren. Einzelmolekül-Fluoreszenz-Bildgebung ist eines der empfindlichsten Methoden, die ermöglicht die Erkennung von einzelnen fluoreszierende Farbstoffe und markierte Proteine in Vitro und in vivo9,10,11,12, 13,14,15. Anwendung dieser bildgebenden Methode Elektrophorese basierenden Proteomanalyse wird voraussichtlich hochsensiblen und quantitativen Assays ermöglichen durch individuelle Fluoreszent-markierten Proteinen zählen. Es bleibt unklar, ob Beschriftung mit Fluoreszenzfarbstoffen homogen genug über die Proteinmoleküle ist, und wie diese Homogenität von verschiedenen Protein-Arten (Abbildung 1) betroffen ist. Einfache Masse Lösung Messungen können verwendet werden, um einem Molverhältnis von Fluoreszenzfarbstoffen, Proteine, sogenannte "Kupplung Effizienz"8 oder "Beschriftung Effizienz" zu erhalten, aber diese Eigenschaft liefert keine Informationen über die Homogenität der Beschriftung unter Protein-Moleküle.
Hier beschreiben wir das Protokoll für eine Probe zu untersuchen, die Kennzeichnung Homogenität für alle Arten von Protein in der Zelle (Abbildung 2)16. Die zwei wichtigsten Schritte des Assays sind Proteinreinigung und Bildgebung. Im ersten Schritt alle Proteine in den Zellen sind Eindringmittel beschriftet und biotinylierte, dann extrahiert separat mit Gelelektrophorese gefolgt von Electroelution. Im zweiten Schritt sind Fluoreszenzeigenschaften von einzelnen Protein-Moleküle in den entnommenen Proben anhand des Einzelmolekül-Bildgebung. Aus diesen Daten, Parameter, die wichtig für die Zählung Analyse, wie z. B. der Anteil der Proteine mit mindestens einem beschriftet färben, die wir fordern Kennzeichnung Auslastung (LO)16, und die durchschnittliche Anzahl von Fluoreszenzfarbstoffen gebunden an ein einziges Protein-Molekül (N̄ Farbstoff), charakterisiert werden können. In das Protokoll ein optimiertes Verfahren zur Kennzeichnung der HeLa-Zelle Proteome mit NHS Ester-basierte Cyanin 3 (Cy3) Farbstoff wird exemplarisch dargestellt und kann mit anderen Kennzeichnung Verfahren nach gewünschten Forschungsziele geändert werden.

<table><tbody><tr><td>22x22x0,15 mm Deckglas</td><td>VWR</td><td>470019-004</td><td></td></tr><tr><td>488 nm Argonlaser</td><td>Coherent</td><td>Innova 70C</td><td></td></tr><tr><td>488 nm dichroitischer Spiegel</td><td>Semrock</td><td>FF495-Di03</td><td></td></tr><tr><td>488 nm Emissionsfilter</td><td>Semrock</td><td>FF02-520/28</td><td></td></tr><tr><td>560 nm dichroitischer Filter</td><td>Semrock</td><td>Di02-R561</td><td></td></tr><tr><td>560 nm Emissionsfilter</td><td>Semrock</td><td>FF02-617/73</td><td></td></tr><tr><td>560 nm Faserlaser</td><td>MBP Communications</td><td>F-04306-2</td><td></td></tr><tr><td>60x Öl-Immersionslinse</td><td>Olympus</td><td>PLAPON 60x</td><td></td></tr><tr><td>Avidin</td><td>Nacalai-tesque</td><td>03553-64</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-PEG-Amin</td><td>Thermo Scientific</td><td>21346</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylierte Alexa Fluor 488</td><td>Nanocs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Borat</td><td>Nacalai-tesque</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9547</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Dojindo</td><td>C008-10</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 NHS-ester</td><td>Farbstoff GE Healthcare</td><td>PA13101</td><td></td></tr><tr><td>Dialysator&nbsp; - D-Röhre, 6-8 kDa</td><td>Merck Millipore</td><td>71507-M</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Nacalai-tesque</td><td>14112-94</td><td></td></tr><tr><td>EDC</td><td>Nacalai-tesque</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EMCCD-Kamera</td><td>Andor</td><td>IiXon 897</td><td></td></tr><tr><td>Epi-Fluoreszenzmikroskop</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>Gel-Viewer</td><td>GE Healthcare</td><td>ImageQuant LAS 4000</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-, Streptomycin- und Amphotereozyten-Mix</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmareiniger</td><td>Diener Electronic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Wako</td><td>NC0792960</td><td></td></tr><tr><td>Leimreinigungssäule 10K</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC5010</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr></tbody></table>

proteom-weite quantifizierung des benennens homogenität auf der ebene des einzelnen moleküls

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Zelle Proteome zeichnen sich oft mit Elektrophorese-Assays, wo alle Arten von Proteinen in den Zellen sind unspezifisch mit einer Leuchtstofffärbung beschriftet und sind von einem Photodetektor nach ihrer Trennung entdeckt. Einzelmolekül-Fluoreszenz-Bildgebung bieten Gromer Proteindetektion mit seiner Fähigkeit zur Visualisierung von einzelnen fluoreszierende Moleküle. Allerdings wird die Anwendung dieser leistungsstarke bildgebende Methode Elektrophorese-Assays durch den Mangel an Möglichkeiten, um die Homogenität der fluoreszierenden Kennzeichnung der einzelnen Protein-Arten über das Proteom charakterisieren behindert. Hier haben wir eine Methode zur Evaluierung der Kennzeichnung Homogenität über das Proteom basierend auf ein einzelnes Molekül Fluoreszenz imaging Assay entwickelt. In unserer Messung mit Hilfe einer Stichprobe von HeLa-Zelle, der Anteil der Proteine, die mit mindestens einem Farbstoff, der wir genannt "Kennzeichnung Belegung" beschriftet (LO), war entschlossen, Auswahl von 50 % bis 90 %, das hohe Potenzial der Anwendung der Einzelmolekül-Bildgebung zu unterstützen sensibel und präzise Proteomanalyse.

Abbildung 4 stellt raw-Bilddaten für Bruchteile von unterschiedlichem Molekulargewicht der Proteine von HeLa-Zelle lysate, sowie die positive und negative Kontrolle. Während der Protein-Probe und Positive Ausstellung 100 – 500 Punkte pro Bild steuern, zeigt die negative-Kontrolle keine oder wenige stellen, zeigen, dass das Protokoll ausreichend unspezifische Bindung der Farbstoffe auf der Oberfläche des Deckglases hemmt. Vor Ort Intensität Histogramme für die...

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Kennzeichnung Homogenität für jede Art von Protein in einer komplexen Protein-Probe auf der Einzelmolekül-Ebene zu bewerten.

Proteom-weite Quantifizierung des Benennens Homogenität auf der Ebene des einzelnen Moleküls

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Diese Methode demonstriert die Kalibrierung der Quantifizierung der Proteinmenge in flüssigen Proben mit einem Einzelmolekülverfahren zum Zählen. Insbesondere kann es veranschaulichen, wie Proteinpopulationen auf jeder Molekülebene fluoreszierend gekennzeichnet werden können. Frühere Methoden führten Massenmessungen durch, um molare Verhältnisse von fluoreszierenden und Proteinmolekülen zu analysieren, aber sie können nicht aufzeigen, wie heterogen Proteinpopulationen tatsächlich gekennzeichnet sind.Unsere Methoden können es direkt auf der Einmolekülebene tun. Unsere Methode kann auf ultrasensible und fortgeschrittene molekulare Konzentrationstests ausgedehnt werden, was zu zukünftigen diagnostischen Methoden führen wird, die effiziente Ergebnisse pathogener Moleküle in Proben ermöglichen. Unsere Methode kann auf die Analyse einzelner Proteinarten mit fluoreszierenden Antikörpern sowie auf die Analyse mehrerer Arten mit unspezifischen Etiketten für alle durch Elektrophorese oder Chromatographie getrennten Proteine angewendet werden.Der kritischste Punkt der Technik ist die Reproduzierbarkeit von Daten. Ich empfehle, den gleichen experimentellen Zustand so weit wie möglich bei der Messung mehrerer Proben zu halten. Die visuelle Demonstration dieser Technik wird zeigen, wie jeder experimentelle Schritt stabil und reproduzierbar wird.Es wird auch einige ungewöhnliche Schritte in der Biochemie Protokolle zeigen, wie die Spin-Beschichtung und Waschen von Mikroskop Abdeckungen. Bereiten Sie zum Starten dieses Verfahrens den Lysingpuffer und 1%Tween-20 wie im Textprotokoll beschrieben vor. Verwenden Sie Natriumhydroxid, um den pH-Wert auf 12 einzustellen.Mischen Sie 100 Mikroliter Lysingpuffer mit einem Mikroliter eines Molaren DDT und vier Mikroliter 50%CHAPS. Fügen Sie einen Mikroliter der vorbereiteten Zellkultur hinzu und homogenisieren Sie die Lösung durch langsames Pipettieren, um Blasen zu vermeiden. Inkubieren Sie im Dunkeln bei Raumtemperatur für fünf Minuten mit sanfter Rührung.Rehomogenisieren Sie dann die Lösung, indem Sie sie langsam nach oben und unten pfeifen. Fügen Sie ein Mikrogramm Cy3 NHS EsterFarbstoff hinzu und homogenisieren Sie die Lösung, indem Sie die Pipettierung verlangsamen, um Blasen zu vermeiden. Inkubieren Sie im Dunkeln bei Raumtemperatur für 10 Minuten mit sanfter Rührung.Wiederholen Sie diesen Vorgang, indem Sie die gleiche Menge Farbstoff hinzufügen und die Probe einmal inkubieren. Fügen Sie 100 Mikroliter 0,8 Mol HEPES-Natriumhydroxid hinzu, um den pH-Wert der Lösung auf 7,2 einzustellen und die Reaktion zu löschen. Langsam Pipetten nach oben und unten, um die Lösung zu homogenisieren.Als nächstes fügen Sie 20 Mikroliter Biotin-2-Amin und fünf Mikroliter EDC hinzu. Homogenisieren Sie die Lösung, indem Sie langsam nach oben und unten pfeifen. Inkubieren Sie im Dunkeln bei Raumtemperatur für eine Stunde mit sanfter Rührung.Verwenden Sie danach eine Ultrafiltrationssäule mit einem 10-Kilo-Dalton-Cutoff, um unreagierte Etikettierungsreagenzien zu entfernen und die Probe zu konzentrieren. Nach der Ausführung von Standard-SDS-PAGE für die Proteinprobe und einer molekularen Leiter, bilde das Gel ab, um die Position der Proteinbänder zu identifizieren. Verwenden Sie eine scharfe Klinge, um die Gelportionen auszuschneiden, die Proteinfraktionen enthalten, die auf den Standorten der Bänder basieren.Legen Sie zunächst Abdeckungen fest, die 22 mal 22 Millimeter groß und 0,15 Millimeter dick sind. Verwenden Sie einen Plasmareiniger, um die Abdeckungen für eine Minute dem Luftplasma auszusetzen, um ihre Oberflächen zu reinigen und zu aktivieren. Als nächstes verwenden Sie einen Spin Coater, um die Abdeckungen mit 200 Mikroliter Avadin-Puffer für fünf Sekunden bei 500RPM zu schichten, gefolgt von 30 Sekunden bei 1000U/min.Inkubieren Sie die Abdeckungen bei Raumtemperatur für 15 Minuten, um sie an der Luft trocknen zu lassen. Verwenden Sie zur Herstellung von Coverlips für die Proteinprobe eine Proteinprobe, die verdünnt wurde. 100 Mikroliter der verdünnten Probe auf die Mitte der avadinbeschichteten Abdeckungen legen.Inkubieren Sie im Dunkeln bei Raumtemperatur für 15 Minuten. Zur Vorbereitung der Positivkontrolle 100 Mikroliter gereinigtes fluoreszierendes Biotin in fünf mikromolareHEPES-Natriumhydroxid bei pH 7,2 in die Mitte eines avadinbeschichteten Abdeckrutsches geben. Inkubieren Sie im Dunkeln bei Raumtemperatur für 15 Minuten.Zur Vorbereitung der Negativkontrolle, Spin-Schicht-Plasma Abdeckungenmitlipsmitlips mit 200 Mikroliter von fünf HEPES-Natriumhydroxid mit zwei Milligramm pro Milliliter BSA ohne Avadin. Fügen Sie 100 Mikroliter zu gereinigtem fluoreszierendem Biotin in fünf mikromolarem HEPES-Natriumhydroxid bei pH 7,2 hinzu. Inkubieren Sie im Dunkeln für 15 Minuten bei Raumtemperatur.Danach spülen Sie jeden Deckelschlupf mit 200 Mikroliter destilliertem Wasser durch Pipettieren an den Rändern, um sicherzustellen, dass die Mitte des Deckels nicht mit der Pipettenspitze berührt wird. Wiederholen Sie diese Wäsche dreimal. Setzen Sie dann eine Minute lang eine gleiche Anzahl neuer Abdeckungen dem Luftplasma aus.Legen Sie einen gereinigten Deckelaufschlag auf jeden probengebundenen Deckel, um eine Trocknung zu vermeiden. Starten Sie ein Weitfeld- oder Evaneszenzfluoreszenzmikroskop. Stellen Sie einen Deckelschlupf auf das Mikroskop und finden Sie den Fokus.Führen Sie dann einen Kachelscan durch, um mindestens 100 Bilder zu erhalten. In dieser Studie wird die Kennzeichnungshomogenität jeder markierten Proteinart in Zellen nach Trennung mit SDS-PAGE quantifiziert. Die Rohbilddaten für verschiedene Molekulargewichtsfraktionen von Proteinen aus HeLa-Zelllysat sowie die positiven und negativen Kontrollen sind hier zu sehen.Während sowohl die Proteinprobe als auch die Positivkontrolle zwischen 100 und 500 Flecken pro Bild aufweisen, weist die Negativkontrolle nur sehr wenige bis gar keine auf. Dies zeigt, dass der Prozess die unspezifische Bindung von Farbstoffen an die Deckgerade ausreichend hemmt. Spot-Intensitätshistogramme für die Proteinproben und die Positivkontrolle stellen mehrere Spitzen dar, die die stochastische Bindung von Farbstoffen an primäre Amen in Proteinen bzw. Avadin-Tetramerstrukturen darstellen.Alle Flecken zeigten blinkendes und stufenweises Photobleaching mit kontinuierlicher Lasererregung, wobei die Beobachtung auf der Ebene des einzelnen Moleküls hervorgehoben wurde. Die Etikettierungsbelegung oder LO wird dann aus dem Verhältnis der Anzahl der Flecken in jeder Proteinprobe zu dem in der Positivkontrolle berechnet. Die aus der HeLa-Zelllysatprobe gemessene LO reicht von 50 % für die kleinere Molekulargewichtsfraktion bis zu 90 % für die Fraktion mit höherem Molekulargewicht.Die LO für die gesamte Proteomprobe ohne Trennung ist 72%Es ist wichtig, frisch hergestellte Reagenzien zu verwenden und Staub zu vermeiden, insbesondere bei der Herstellung der Deckellipsen. Nach diesem Verfahren kann eine Analyse der Einzelmolekülzählung in einem bestimmten Volumen durchgeführt werden, um die Konzentrationen jedes Proteins zu quantifizieren. Beispielsweise kann eine Analyse an jedem Rohprodukt oder Gel- und Kapillarelektrophoreseprodukten durchgeführt werden.Diese Technik ebnet den Weg für die Verwendung von Einzelmolekülfluoreszenz-Bildgebung für molekulare Medizin, organische Chemie und Omics-Analyse. Durch überbrücken des Konzepts zwischen Konzentration und Zahlen. Konzentriertes Natriumhydroxid ist korrosiv, und bei der Handhabung sollte ein ausreichender Schutz getragen werden.Auch Hochleistungs-Laserstrahlung kann Augenschäden verursachen, so schutzweise Brille nimmern.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Advances in Massenspektrometrie haben die Hochdurchsatz-Analyse der Proteinexpression und Modifikation in einer Vielzahl von Geweben erlaubt. Kombiniert mit subzelluläre Fraktionierung und Krankheitsmodelle, quantitative Massenspektrometrie und der Bioinformatik neue Eigenschaften in biologischen Systemen offenbaren kann. Das hierin beschriebene Verfahren analysiert Chromatin-assoziierten Proteinen in der Einstellung von Herzerkrankungen und ist ohne weiteres auch auf...

Quantitative Analyse von Chromatin Proteome in Disease

Stabile Isotopenmarkierung von Peptiden durch reduktive Dimethylierung (Redi-Markierung) ist eine schnelle, kostengünstige Strategie für genaue Massenspektrometrie-basierte quantitative Proteomik. Hier zeigen wir ein robustes Verfahren für die Aufbereitung und Analyse von Proteingemischen mit Hilfe der redi Ansatz, der auf fast jedem Probentyp angewandt werden kann.

Quantitative Proteomics Mit reduktive Dimethylierung Stabile Isotope Labeling

Es wurde ein Hochdurchsatzprotokoll für die kombinierte Proteomik- und Glykomik-Aufreinigung und die LC-MS/MS-Quantifizierung im Plasma entwickelt. Die Deamidierungsanalyse von N-verknüpften Glykosylierungsmotiven war spezifisch für deglykosylierte Stellen. Eine genaue Quantifizierung der N-Glykane wurde durch die Kopplung der filtergestützten N-Glykan-Trennung an die Individualitätsnormalisierung bei der Markierung mit der Glykanhydrazid-Tag-Strategie erreicht.

Eine quantitative Glycomics und Proteomics Kombinierte Reinigungsstrategie

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll, um präzise quantitate Proteine mit Isobaren Kennzeichnung, umfangreiche Fraktionierung, Bioinformatik und Qualitätskontrolle Schritte in Kombination mit Flüssigkeitschromatographie eine Schnittstelle zu einem hochauflösenden Massenspektrometer.

Tiefen Proteom Profilierung durch isobare Kennzeichnung, umfangreiche Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie und softwaregestützte Quantifizierung

Dieses Manuskript beschreibt ein Verfahren zur Kennzeichnung einzelner Boten-RNA (mRNA) Abschriften mit Fluoreszent-markierten DNA-Sonden für den Einsatz in Einzelmolekül-Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (SmFISH) Experimente in E. Coli. SmFISH ist eine Visualisierungsmethode, die erlaubt die simultane Detektion, Lokalisierung und Quantifizierung der einzelnen mRNA-Moleküle in festen Einzelzellen.

Methode zur Kennzeichnung Transkripte in einzelnen Escherichia coli Zellen für Einzelmolekül-Fluoreszenz In Situ Hybridisierung Experimente

Dieser Workflow beschreibt die Gleichzeitige der zeit- und kosteneffizienten Anreicherung mehrerer Protein-Post-Translational-Modifikationen (PTMs) für die quantitative globale proteomische Analyse. Das Protokoll nutzt ptM-Anreicherung auf Peptidebene mit mehreren konjugierten Antikörpern, gefolgt von einer datenunabhängigen Erfassungsmassenspektrometrieanalyse, um biologische Einblicke in PTM-Übersprechen zu gewinnen.

Gleichzeitige Affinitätsanreicherung von zwei posttranslationalen Modifikationen für Quantifizierung und Standortlokalisierung

Wir präsentieren ein optimiertes Tandem-Massen-Tag-Etikettierungsprotokoll (TMT), das detaillierte Informationen für jeden der folgenden Schritte enthält: Proteinextraktion, Quantifizierung, Niederschlag, Verdauung, Etikettierung, Einreichung an eine Proteomik-Anlage und Datenanalysen.

TMT-Beispielvorbereitung für proteomics Facility Submission und nachfolgende Datenanalyse

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"Cell Surface Capture"-Workflow zur markierungsfreien Quantifizierung des Zelloberflächenproteoms

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Automatisierung der posttranslationalen Analyse einzelzelliger Histon-Modifikationen unter Verwendung einer isotopischen Zweiplex-Markierungsstrategie und der ArgC-Verdauung. Dieser Workflow ermöglicht quantitative, reproduzierbare und hochsensible Profilierung der Chromatinheterogenität und epigenetischen Antworten bei Einzelzellauflösung.

Automatisierte Probenvorbereitung für die multiplexierte Analyse einzelzelliger Histon-Posttranslationalen Modifikationen (sc-hPTM2)

Lernen Sie die proteomweite Quantifizierung der Markierungshomogenität auf Einzelmolekülebene. Diese Methode ermöglicht die direkte Beobachtung heterogener Proteinpopulationen und eröffnet neue diagnostische Anwendungen.

Proteom-weite Quantifizierung des Benennens Homogenität auf der Ebene des einzelnen Moleküls

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