Ein Positionierungsgerät für die Platzierung von Mäusen während der intranasalen siRNA-Lieferung an das Zentrale Nervensystem
15. August 2019
Hier stellen wir ein Protokoll mit einem Maus-Positionierungsgerät vor, das die angemessene Platzierung von Mäusen für die intranasale Verabreichung einer hirngezielten Peptid-SiRNA-Formulierung ermöglicht, die eine effektive Gen-Silencing im zentralen Nervensystem ermöglicht.
Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung einer Positioniervorrichtung für die intranasale Abgabe von Biomolekülen an das Maus-ZNS. Die Verwendung dieses Geräts reduziert den Umgang mit Mäusen und die Behandlungszeit erheblich, was zu einer verbesserten Effizienz und Reproduzierbarkeit der Technik führt. Um dieses Verfahren zu beginnen, bewerten Sie den Anästhesiespiegel der Mäuse durch Pedalreflex, um die chirurgische Ebene zu erhalten.
Als nächstes stellen Sie die Positioniervorrichtung in einem angemessenen Abstand und einer angemessenen Höhe, um einen bequemen Zugriff auf alle erforderlichen Reagenzien zu ermöglichen. Dann tragen Sie Salbe auf die Augen des Tieres auf. Ziehen Sie eine Maus mit Stuhlgurten, stellen Sie sicher, dass die Vorderbeine der Maus natürliche Unterstützung bieten, während sie sich in einer entspannten Position ohne Beschwerden befindet.
Wiederholen Sie die Prozeduren für die verbleibenden Mäuse. Legen Sie vorsichtig jede Maus auf den dafür vorgesehenen Stuhl, indem Sie ihren Rücken parallel zur Rückenstütze des Stuhls und bei 90 Grad auf den Stuhlsitz legen. Lassen Sie das Tier natürlich in der Kopf- und Vorwärtsposition liegen, ohne zu drücken oder zu drücken.
Sobald alle Mäuse angeschnallt sind, beginnen Sie sofort mit der intranasalen Impfung. Um die intranasale Lieferung durchzuführen, laden Sie die Mikropipette mit zwei Mikrolitern der RVG9R siRNA-Komplexlösung. Halten Sie die Pipette in der dominanten Hand und unterstützen Sie sie mit der anderen Hand, um unkontrollierte Bewegungen zu vermeiden, während Sie siRNA verabreichen.
Legen Sie etwa ein zwei Mikroliter Tröpfchen ganz in der Nähe eines Nasenlochs, so dass die Maus es direkt einatmen kann. Wenn ein winziger Tropfen nicht leicht gebildet werden kann, ersetzen Sie die Pipettenspitze durch eine neue und wiederholen Sie den Vorgang. Drücken Sie den Mauskopf vorsichtig mit dem Zeigefinger für fünf Sekunden nach unten, während er einatmet und die Position aufrechterhält.
Um eine Drainage des Medikaments in die Lunge zu verhindern, ist es wichtig, den Mauskopf mit dem Zeigefinger fünf Sekunden lang ruhig nach unten zu drücken, während die Maus einatmet. Starten Sie eine Stoppuhr, um drei bis vier Minuten nach dieser Zeit Impfung in den zweiten Nare der ersten Maus zu takten. Dieses Zeitintervall ist notwendig, damit die Maus die erste Dosis einatmet und die normale Atmung wiederherstellt.
Im Drei- bis Vier-Minuten-Intervall zwischen der Impfung von alternativen Nares auf der ersten Maus, vollständige intranasale Impfung von einem Nare in jeder der verbleibenden drei Mäuse auf dem Gerät platziert. Wenn die Stoppuhr ertönt, impfen Sie das zweite Nasenloch auf der ersten Maus und wiederholen Sie den Vorgang für die anderen Mäuse wie oben. Wiederholen Sie den Vorgang, bis die 20 bis 30 Mikroliter für alle vier Mäuse geliefert werden.
Es dauert etwa 30 bis 45 Minuten, um den gesamten Impfvorgang abzuschließen. Bringen Sie die Tiere in ihre vorgesehenen Käfige zurück. Lassen Sie die Mäuse nicht unbeaufsichtigt, bis sie genügend Bewusstsein wiedererlangt haben, um die Brustbesinnung aufrechtzuerhalten.
Um die Gen-Silencing zu bewerten, extrahieren Sie RNA aus verschiedenen Hirnregionen mit einem RNA-Reinigungskit, kehren die Transkription in cDNA mit einem cDNA-Synthesekit um und führen qPCR mit Primer-Paaren durch. Die meisten Gehirn-Lieferung des RVG9R Peptid mit Alexa Fluor 488 markiert wurde zuerst mit dem Maus-Positionierungsgerät hier beschrieben getestet. Nach 48 Stunden nach der Impfung wurden verschiedene Organe zur Messung der A488-Fluoreszenz ausgeschnitten.
In keinem der Organe wurde in den negativen Kontrollen festgestellt. Andererseits wurde ein starkes fluoreszierendes A488-Signal ausschließlich in den Gehirnen der rVG9R-geimpften Gruppe nachgewiesen. Darüber hinaus wurde die Position der Mausplatzierung mit der Supine-Position-Methode und der Wachmethode für die Wirksamkeit verglichen.
Die Ergebnisse zeigten, dass die Positionierung der Mäuse Kopf nach unten und nach vorne verbesserte die Penetranz und Ablagerung von RVG9R A488 im gesamten Gehirngewebe. Um die SiRNA-Bereitstellung an das Gehirn weiter zu bestätigen, wurde nach einer einzigen intranasalen Verabreichung von RVG9R, die auf Cy5 mit siRNA bezeichnet wurde, eine vollständige Hirnscannierung durchgeführt. Im Gegensatz zu PBS oder RVM9R führte die Komplexierung mit RVG9R zu einer starken Ansammlung von siRNA in wichtigen Hirnregionen wie der Riechbirne, dem Kortex, dem Hippocampus, dem Thalamus, dem Hypothalamus, dem Mittleren Hirn und dem Kleinhirn.
Das Positioniergerät kann für die Abgabe von Medikamenten oder Molekülen an das Maus-ZNS verwendet werden. Die Anwendungen erstrecken sich auf die Prüfung von Therapeutika sowie die Untersuchung zellulärer Mechanismen im ZNS. Dieses Positionierungsgerät wurde von den Forschern verwendet, um die Wirksamkeit von siRNAs bei der Behandlung der West-Nil-Virus-Krankheit zu demonstrieren und Therapien für andere ZNS-Erkrankungen zu erforschen.
Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung einer Maus-Positioniervorrichtung für die intranasale Applikation einer das Gehirn gezielt ansprechenden Peptid-siRNA-Formulierung, die eine effektive Genstilllegung im zentralen Nervensystem ermöglicht. Die Methode verbessert die Effizienz und Reproduzierbarkeit und minimiert gleichzeitig den Umgang mit den Mäusen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Gen-Therapie
- Biomolekulare Abgabe
Hintergrund
- Die intranasale Applikation ist ein aussichtsreicher Weg für Therapien, die auf das zentrale Nervensystem abzielen.
- Effiziente Applikationstechniken sind entscheidend für reproduzierbare Ergebnisse.
- Die Positionierung der Maus kann die Wirksamkeit der Wirkstoffabgabe beeinflussen.
- Die Genstilllegung mittels siRNA ist ein wertvolles Werkzeug in der neurowissenschaftlichen Forschung.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines Protokolls für die effektive intranasale Applikation von siRNA im zentralen Nervensystem der Maus.
- Beurteilung des Einflusses der Mauspositionierung auf die Effizienz der Arzneimittelabgabe.
- Nachweis der Nützlichkeit der Positioniervorrichtung für Anwendungen in der Gentherapie.
Verwendete Methoden
- Beurteilung der Anästhesietiefe bei Mäusen vor der Positionierung.
- Verwendung einer Positioniervorrichtung, um die Mäuse in einer entspannten Lage zu fixieren.
- Intranasale Applikation einer siRNA-Komplexlösung.
- RNA-Extraktion und qPCR zur Bewertung der Genstilllegungseffizienz.
Hauptergebnisse
- Signifikante Gen-Silenzierung in Gehirnregionen nach Inokulation beobachtet.
- Verbesserte Abgabe von siRNA mithilfe der Positioniervorrichtung im Vergleich zu anderen Methoden.
- Starke Fluoreszenz in den Gehirnen behandelte Mäuse nachgewiesen, was auf eine erfolgreiche Abgabe hinweist.
- Die heruntergeneigte Kopfposition verbesserte die Durchdringung und Ablagerung der siRNA-Formulierung.
Schlussfolgerungen
- Die Mauspositions-Vorrichtung ist wirksam für die ZNS-Drogenabgabe.
- Diese Methode kann in verschiedenen therapeutischen und Forschungskontexten angewendet werden.
- Weitere Studien können die Anwendung bei der Behandlung von ZNS-Erkrankungen untersuchen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die effiziente intranasale Applikation von auf das ZNS zielenden Wirkstoffen stellt nach wie vor eine entscheidende Engstelle in der präklinischen Neurowissenschaft und der Entwicklung von Gentherapien dar. Diese Positionierungsvorrichtung ermöglicht eine standardisierte, hochdurchsatzfähige Verabreichung von Biomolekülen wie siRNA, Peptiden oder Nanopartikeln an das Mausgehirn, wodurch die Reproduzierbarkeit verbessert und die Variabilität in Studien zur Zielstrukturnbindung verringert wird. Durch die Unterstützung einer konsistenten Kopf-unten-und-vorne-Positionierung wird das Vorhersagevertrauen hinsichtlich der ZNS-Aufnahme erhöht und das Risiko bei der translationellen Weiterentwicklung intranasal verabreichter Therapiekandidaten reduziert.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die präzise Überprüfung therapeutischer Hypothesen, indem eine reproduzierbare Applikation zentralnervensystemaktiver Wirkstoffe wie RVG9R-siRNA-Komplexe sichergestellt wird.
- Operativer Wert: Verringert die vom Anwender abhängige Variabilität der Dosierung und unterstützt zuverlässige Bewertungen der Zielmolekülbindung und der Modulation von Signalwegen.
- Vorhersagegenauigkeit: Verbessert die Konsistenz von Biomarker-Analysen wie Gen-Silenzierung oder Proteinknockdown über verschiedene Behandlungsgruppen hinweg.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet standardisierte biologische Systeme für die nachgeschaltete Untersuchung vor, indem eine einheitliche Verabreichung von Wirkstoffen an das zentrale Nervensystem sichergestellt wird.
- Operationeller Wert: Ermöglicht die Reproduzierbarkeit von Assays durch kontrollierte Tierpositionierung und verringerte Handling-bedingte Stressbelastung.
- Plattformnutzung: Ermöglicht die Bewertung unterschiedlicher Wirkstoffformen, einschließlich siRNA, Nanopartikel und Antikörper, hinsichtlich ihrer Verabreichung an das zentrale Nervensystem.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Erhält die Krankheitsrelevanz, indem eine konsistente Applikation in wichtige Hirnregionen ermöglicht wird, die in neurodegenerativen Erkrankungen oder bei Virusinfektionsmodellen beteiligt sind.
- Operativer Wert: Ermöglicht eine schnelle Prüfung therapeutischer Kandidaten durch parallele Bearbeitung von bis zu acht Mäusen pro Sitzung.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Unterstützt Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch durch Verbesserung der Zuverlässigkeit von Daten zur ZNS-Exposition und Zielstrukturenmodulation.
Pipeline- und Workflow-Integration
Das Gerät integriert sich in den Entdeckungsworkflow von der frühen Target-Validierung bis hin zur Leadoptimierung und unterstützt zuverlässige Bewertungen der ZNS-Zufuhr vor IND-erforderlichen Studien.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung, indem eine konsistente Applikation von siRNA- oder Peptid-Therapeutika ermöglicht wird, um die Zielmodulation in vivo zu validieren.
- Screening: Verbessert die Bereitschaft und Reproduzierbarkeit von Assays, indem die Tierpositionierung während der intranasalen Applikation von Substanzen standardisiert wird.
- Analytik: Ermöglicht den quantitativen Vergleich der ZNS-Aufnahme über Fluoreszenz-, qPCR- oder Biomarker-Auswertungen zwischen Behandlungsgruppen.
- Translationale Forschung: Verbindet die Entdeckung mit der präklinischen Kontinuität, indem die Zuverlässigkeit von Metriken zur ZNS-Applikation verbessert wird, die in Dosis-Wirkungs- und Wirksamkeitsstudien verwendet werden.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Funktioniert als wiederverwendbare Plattform zur Bewertung mehrerer zns-gerichteter Modalitäten über Projekte und therapeutische Bereiche hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Nutzen: Erhöht die Vorhersagesicherheit bezüglich der ZNS-Zustellung und Zielstrukturenbindung, indem die prozedurale Variabilität verringert wird.
- Operativer Nutzen: Verbessert Durchsatz und Standardisierung und reduziert die manuelle Arbeitszeit sowie die Abhängigkeit von technischem Personal.
- Strategischer Nutzen: Unterstützt fundiertere Go/No-Go-Entscheidungen durch verbesserte Datengüte und eine geringere Rate an falsch-negativen Ergebnissen in Assays zur ZNS-Zustellung.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung intranasal verabreichter therapeutischer Kandidaten auf Grundlage reproduzierbarer Daten zur ZNS-Aufnahme.
Durchführungsaspekte
- Erfordert eine Schulung in der Beurteilung der Anästhesie und in der korrekten Fixierung der Tiere, um deren Wohlbefinden und eine richtige Positionierung sicherzustellen.
- Hängt vom Zugang zu Ausrüstung für die intranasale Applikation ab, wie beispielsweise Mikropipetten und sterilen Spitzen, um eine konsistente Tropfenbildung zu gewährleisten.
- Erfordert eine Standardisierung zwischen den Teams, um eine einheitliche Kopf-nach-unten-und-vorn-Positionierung sowie eine gleichmäßige Zeitabfolge zwischen den Applikationen in die Nasenöffnungen sicherzustellen.
- Muss durch Anpassung der Stuhlhöhe und Neigungseinstellung an verschiedene Mausstämme oder -größen angepasst werden.
- Beschränkt sich auf Verfahren, die eine präzise intranasale Applikation erfordern; nicht geeignet für intravenöse oder orale Applikationswege.
