Verwendung von Sniper-Cas9, Off-Target Auswirkungen von CRISPR-Cas9 ohne den Verlust der Zielaktivität durch gerichtete Evolution

In der Natur ist Cas9 ein Immunprotein gegen eindringende Viren, das die Evolution Cas9 mit promiskuitiver Spezifität bevorzugt, die virale DNA mit spontanen Mutationen spalten kann. Wir haben ein künstlich gerichtetes Evolutionssystem gebaut, das eine optimierte Cas9-Variante mit hoher Spezifität bevorzugt. Sowohl negative als auch positive Auswahlen funktionieren gleichzeitig im Sniper Screening System.

Cas9-Varianten mit reduzierter Off-Target-Aktivität, die auch die Zielaktivität aufrechterhält, können gleichzeitig überprüft werden. Mutationen wurden auf der gesamten Cas9-Sequenz zufällig eingeführt, um die zu überprüfende Bibliothek zu erstellen. Und dies ermöglichte es, Mutationen in unerwarteten Positionen zu finden.

Derzeit verwenden viele Forscher in Wissenschaft und Industrie Y-Typ Cas9 für therapeutische Entwicklungen. Die Spezifität des Y-Typ S Cas9 ist jedoch nicht optimiert, was zu dicht gepackten Details führen kann. Beim Menschen bedeutet dies unerwartete Mutationen in zufälligen Genen, die zu schwerwiegenden Nebenwirkungen führen können.

Es gibt viele Cas9-ähnliche Enzyme, die in Therapeutika entwickelt werden. Unsere Technik kann verwendet werden, um die Spezifität anderer DNA und Nukleids wie Jipinger, Thailand und Cas9 auch wie CPF1 zu verbessern. Eine Bibliothek groß genug zu machen, ist der Schlüssel, um die Möglichkeiten zu erhöhen, eine Variante mit wichtiger Funktion zu erhalten.

Achten Sie darauf, eine hohe Effizienz im Kühlschritt zu erhalten, und verwenden Sie hocheffiziente kompetente Zellen. Um dieses Verfahren zu beginnen, fügen Sie ein Nanogramm des CCDB-Plasmids und des SGRNA-Plasmids mit doppelter Diskrepanz in fünfzig Mikroliter aufgetauter BW25141 GOI-Zellen hinzu. Mischen Sie die Zellen vorsichtig durch Pipettieren und übertragen Sie sie in eine vorgekühlte, 0,1 Zentimeter große Elektroporationsküvette.

Transformieren Sie den E-coli mit den beiden Plasmiden durch Elektroporation. Unmittelbar nach Abschluss der Elektroporation 250 Mikroliter SOC-Medium hinzufügen. Pipette die Lösung, um die Zellen und Medium zu mischen, und übertragen Sie die Mischung auf eine 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr.

Die transformierten Zellen wiederherstellen und bei 32 Grad Celsius bebrüten, mit sanftem Schütteln für eine Stunde. Fahren Sie mit der Vorbereitung der Snyper-Screening-Zellen fort, wie im Textprotokoll beschrieben. Wenn Sie bereit sind, DasSnyper-Screening durchzuführen, transformieren Sie die Snyper-Screening-Zellen mit 100 Nanogramm der vorbereiteten Cas9-Variantenplasmide aus jeder Bibliothek mithilfe des zuvor beschriebenen Elctroporationsprozesses.

Dann 250 Mikroliter der Zellen in ein frisches 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr übertragen. Fügen Sie 250 Piktogramme ATC zu einer Endkonzentration von 10 Nanogramm pro Milliliter hinzu. Erholen Sie sowohl die ATC-haltigen als auch die ATC-freien Zellen, indem Sie sie bei 32 Grad Celsius für eine Stunde mit sanftem Schütteln inkubieren.

Platte 25 Mikroliter der wiedergewonnenen ATC-freien Zellen auf einer LB-Agarplatte, die Chloramphenicol und Kanamycin enthält. Fügen Sie ATC zu dem wiedergewonnenen ATC enthaltenden Zellen zu einer Endkonzentration von 100 Nanogramm pro Milliliter auf einer 245 Millimeter LB Agarplatte hinzu. Die ATC-haltigen Zellen sofort auf einen LB-Agar mit Chloramphenicol, Kanamycin und Arabinose aufeiner LB-Agar-Platte.

Alle Teller über Nacht bei 32 Grad Celsius inkubieren. Am nächsten Tag fotografieren Sie die Platten. Mit der offenen CFU-Software zählen Sie die Anzahl der lebensfähigen Kolonien, um sicherzustellen, dass die Anzahl der Kolonien auf der nicht-selektiven Platte mindestens zehnmal größer ist als die Vielfalt der Bibliothek, um alle Varianten abzudecken.

Ziehen Sie die Kolonien, die auf den selektiven Platten aus allen drei Bibliotheken überlebt. Übertragen Sie diese gepoolten Kolonien auf 250 Milliliter LB Medium, ergänzt mit Chloramphenicol, und inkubieren über Nacht bei 42 Grad Celsius. Laden Sie zunächst die Cas OF-Finder-Software, um Zielstandorte auszuwählen.

Wählen Sie den PAM-Typ passend für den spezifischen Cas9-Typ und das Zielgenom aus. Füllen Sie die Registerkarte Abfragesequenzen aus. Wählen Sie die Nichtübereinstimmungsnummer aus, und klicken Sie auf die Schaltfläche Absenden.

Nach einigen Sekunden werden die On-Target- und Off-Target-Sites angezeigt. Wählen Sie im Allgemeinen die Off-Target-Sites mit einer bis drei Nichtübereinstimmungen aus. Als Nächstes bestellen Sie die CRRNA und die Track RRNA Oligos mit Vorlagensequenzen und verstärken Sie die Vorlage, wie im Textprotokoll beschrieben.

Analysieren Sie zwei Mikroliter der verstärkten Schablonen-DNA auf einem 2%Agarose-Gel und reinigen Sie dann die Schablone. Inkubieren Sie die Reaktionsmischung über Nacht bei 37 Grad Celsius. Am nächsten Tag 0,5 Mikroliter DNAse hinzufügen und bei 37 Grad Celsius für 15 bis 30 Minuten brüten und dann die SGRNA reinigen.

Behandeln Sie dann 10 Mikrogramm der in-vitro transkribierten RNA mit 250 Einheiten kalbenalkalischer Phosphatase für drei Stunden bei 3 Grad Celsius in Gegenwart von 100 Einheiten RNAse-Inhibitor und reinigen Sie dann die behandelte SGRNA. Erstens, halten HEK293 T-Zellen in DMEM ergänzt mit 10%FBS und 1%Antibiotika bei 37 Grad Celsius mit 5%Kohlendioxid. Als nächstes mischen Sie zwei Mikrogramm entweder Wildtyp oder Snyper Cas9 Protein mit zwei Mikrogramm SGRNA, und inkubieren bei Raumtemperatur für zehn Minuten, um RNP-Komplexe zu machen.

Versuchen Sie, die Zellen zu verrechnen und zu zählen, waschen Sie sie dann und bereiten Sie sie im Elektroporationspuffer vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Elektroporate die RNP-Komplexe in die Zellen mit einem Impuls von 1300 Volt für 30 Millisekunden. Unmittelbar nach der Elektroporation die Zellen auf einer 48-Well-Platte mit 500 Mikroliter DMEM gefüllt, ergänzt mit 10%FBS und 1%Antibiotika.

Inkubieren Bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid. Bewahren Sie HEK293 T-Zellen in DMEM, ergänzt mit 10%FBS und 1%Antibiotika bei 37 Grad Celsius mit 5%Kohlendioxid. Am Tag vor der Transfektion, versuchen und zählen Sie die Zellen.

Bei einer Arbeit mit einer 48-Well-Skala, Platte 10 000 Zellen pro Brunnen und 250 Mikroliter des gesamten Wachstumsmediums. Bereiten Sie mit einem lipidbasierten Transfektionsreagenz 250 Nanogramm P3S Cas9-Plasmid und 250 Nanogramm SGRNA für die Transfektion vor. Mischen Sie dann die Plasmide in 25 Mikroliter serumfreies MEM.

Verdünnen Sie einen Mikroliter Transfektionsreagenz mit 25 Mikroliter serumfreiem MEM. Inkubieren Sie diese Mischung bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Kombinieren Sie die Plasmidmischung mit der Transfektionsreagenzmischung und brüten Sie im Raum für 20 Minuten, um Plasmid lipofectamin-Komplexe zu bilden.

Danach 50 Mikroliter dieser Mischung direkt in jeden Brunnen enthaltende Zellen hinzufügen. Schaukeln Sie die Platte sanft hin und her, um sie zu mischen. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in einem Kohlendioxid-Inkubator für 48 bis 72 Stunden nach der Transfektion, bevor Sie die Transgenexpression untersuchen.

Nach der Isolierung der zuvor vorbereiteten genomischen DNA, generieren Tiefe Sequenzierung Bibliotheken durch PCR-Verstärkung der GDNA mit Primern auf Ziel und Off-Target. Verwenden Sie dann Indexprimer, um jedes Beispiel zu beschriften. Verwenden Sie einen Sequenzierungscomputer der nächsten Generation, um die Poolbibliotheken einer gekoppelten Endsequenzierung zu unterwerfen.

Nachdem der Snyper-Bildschirm durchgeführt wurde, kann der Prozentsatz der Überlebenskolonien berechnet werden, indem die Anzahl der Kolonien auf der selektiven LB-Platte durch die Anzahl der Kolonien auf der nicht-selektiven LB-Platte dividiert wird. Während dieser Prozentsatz in der Regel sehr niedrig ist, wenn er mit Bibliotheken von SP Cas9 durchgeführt wird, können echte positive Treffer durch Die Wiederholung des Bildschirms mit dem überlebenden Pool bereichert werden. Ein repräsentativer Snyper-Bildschirm zeigt eine 100%-Überlebensrate nach dem dritten Bildschirm erhalten.

Transfektionen mit RNPs oder Plasmid codierten Snyper Cas9 können für verschiedene Ziele durchgeführt werden, und die resultierenden On-Target- und Off-Target-Aktivitäten, gemessen durch Targets Amplicon-Sequenzierung. Bei den meisten Zielen zeigt Snyper Cas9 das gleiche Niveau der Zielaktivitäten und höhere Spezifitätsverhältnisse im Vergleich zum Wildtyp. Abgeschnittene SGRNAs können auch verwendet werden, um die Spezifität weiter zu verbessern.

Eine höhere Transformationseffizienz im ersten Reinigungsschritt ist sehr wichtig, um die Klone nicht mit hoher Spezifität zu verlieren. Spätere Screening-Schritte wiederholen eine geringere Transformationseffizienz, da die Klone bereits im ersten Screening-Schritt angereichert sind und die Wahrscheinlichkeit, sie zu verlieren, geringer ist. Es wird mehr als einen Klon geben, den wir auf dem Snyper-Bildschirm gefunden haben.

On-Target- und Off-Target-Aktivitäten dieser Klone sollten in so vielen verschiedenen Zielen wie möglich charakterisiert werden, um Klone mit der besten Leistung auszuwählen. Mit dieser Methode können Wissenschaftler die Spezifität der Cas9-ähnlichen Enzyme verbessern, ohne die On-Target-Aktivität zu verlieren. Darüber hinaus benötigen die Wissenschaftler keine Vorkenntnisse über die Struktur des Proteins, um Verbesserungen vorzunehmen.