Medium-Throughput Screening Tests zur Beurteilung der Auswirkungen auf Ca^{2 +}-Signalisierung und Akrosom Reaktion in menschliches Sperma

Unsere Assays können verwendet werden, um Verbindungen für ihre Auswirkungen auf die Funktion der menschlichen Spermien zelle zu testen. Insbesondere können diese Methoden verwendet werden, um schnell und einfach eine große Anzahl von Verbindungen auf ihre Auswirkungen auf Kalziumsignalisierung und Akrosomenreaktion in menschlichen Spermien zu überprüfen. Visuelle Demonstrationen dieser Methode erleichtern es anderen, ähnliche Experimente in ihren eigenen Labors einzurichten.

Beginnen Sie, indem Sie eine 50 Milliliter Tube pro Milliliter rohen Samenprobe in ein Rohrgestell in einem 45-Grad-Winkel legen und vier Milliliter 37 Grad Celsius Human Tubal Fluid oder HTF-positives Medium zu jeder Röhre hinzufügen. Als nächstes, sorgfältig Pipette einen Milliliter verflüssigten Samenprobe auf den Boden jedes Rohres und legen Sie die Rohre bei 37 Grad Celsius für eine Stunde. Verwenden Sie am Ende der Inkubation eine modifizierte Pipettenspitze, die in einem 45-Grad-Winkel gehalten wird, um so viel wie möglich von der oberen Fraktion der motilen Spermienzelle, die HTF-positives Medium enthält, sanft in ein neues 15-Milliliter-Kunststoffrohr zu übertragen.

Um die gesammelten Spermien zu zählen, verdünnen Sie ein 20-Mikroliter-Aliquot auf den Faktor 10, 20, 30, 50 oder 90 in S100 Puffer in einem runden unteren zwei Milliliter-Rohr entsprechend der erwarteten Konzentration. Wirbeln Sie die verdünnten Spermien für 10 Sekunden bei 700 Rotationen pro Minute. Als nächstes tauchen Sie eine SP1-Kassette in die Probe ein und drücken Sie den weißen Kolben vollständig, um ein Aliquot der Probe in die Kassette zu saugen.

Legen Sie dann die Kassette in das Bildzytometer-Tablett und führen Sie den PI-gefärbten menschlichen Spermien-Assay entsprechend dem angewendeten Verdünnungsfaktor aus. Um Veränderungen in der freien intrazellulären Kalziumkonzentration zu messen, pipettedieren Sie die Spermienprobe einmal nach oben und unten und verwenden Sie eine automatische Repeaterpipette, um 50 Mikroliter fluorophor-gefärbte Spermien zu 24 Brunnen einer Reihe einer 384 Mikro-Wellplatte zu aliquotieren. Legen Sie die Mikrobrunnenplatte bei 30 Grad Celsius in den Fluoreszenzplattenleser und wählen Sie das entsprechende Protokoll für Fluorophor.

Wählen Sie einen Brunnen in der Reihe der Spermien und passen Sie die Verstärkung auf einen Zielwert von 20% dann starten Sie die Messung. Nach 10 Baseline-Zyklen, halten Sie das Experiment und werfen Sie die Schublade mit der Mikro-Brunnenplatte. Mit einer 12-Kanal-Pipette schnell 25 Mikroliter der vorbereiteten Lösungen von Compounds und Steuerungen von Interesse in die 12 doppelten Brunnen in der Reihe hinzufügen und sofort die Platte an den Leser zurückgeben, um die Messung so schnell wie möglich fortzusetzen.

Jegliche Änderungen der Fluoreszenz als Reaktion auf die Zugabe der Verbindungen oder Kontrollen werden vom Instrument erfasst. Für die Analyse der anfänsamreagierenden Analyse mischen Sie die Proben nach der Inkubation der kapazitierten Spermien mit den entsprechenden Fluoreszenzfarbstoffen, Verbindungen oder Kontrollen durch Pipettieren und fügen Sie 50 Mikroliter jeder Testprobe zu 100 Mikrolitern immobilisierender Lösung hinzu. Mischen Sie die Proben erneut und laden Sie die Kammern eines A2-Dias pro Probe mit ca. 30 Mikrolitern Probe pro Kammer.

Legen Sie dann die erste geladene Folie auf das Fach des Bildzytometers. Wählen Sie das FlexiCyte-Protokoll aus, und drücken Sie Run. Hier können repräsentative Ergebnisse eines Experiments zur Erprobung der Wirkung von vier Verbindungen, einer positiven Progesteronkontrolle und einer negativen Pufferkontrolle mit dem Medium-Durchsatz-Calciumsignaltest, wie gezeigt, beobachtet werden.

In diesem Diagramm wird eine Dosis-Ansprechkurve von Progesteron, die aus Spitzenprozentänderungen der intrazellulären freien Kalziumkonzentration abgeleitet wird, die durch eine seriell verdünnte Progesteronkonzentration induziert wird, gezeigt. Diese Daten veranschaulichen die Auswirkungen einer negativen oder einer von zwei positiven Kontrollen auf die Induktion einer akrosomen Reaktion in kapazitierten menschlichen Spermien in einem mitteldurchsatz-Akrosom-Reaktionstest. Um zu vermeiden, dass die Spitzen der induzierten Signale fehlen, ist es wichtig, die Chemikalien schnell in die Replizienbrunnen einzubauen und die Messung danach sofort fortzusetzen.

Durch die Änderung der Art von Fluorophoren und Farbstoffen können unsere Assays leicht modifiziert werden, um verschiedene wissenschaftliche Fragen zu beantworten. Diese Assays wurden bereits in mehreren Studien verwendet, um große Gruppen von Verbindungen für ihre Auswirkungen auf die menschliche Spermienfunktion zu testen.