Name: Konvektion Verbesserte Lieferung von optogenetischen Adeno-assoziierten Viral vektor an den Cortex von Rhesus Macaque unter Anleitung von Online-MRT-Bildern (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Erfahren Sie die MR-gesteuerte konvektionsverstärkte Lieferung optogenetischer Virenvektoren im Makakenkortex. Diese Methode ermöglicht großflächige neuronale Manipulation und erweitert das Verständnis komplexer Schaltkreise.

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Diese Arbeit wurde von American Heart Association Postdoctoral fellowship (AY), Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) Reorganization and Plasticity to Accelerate Injury Recovery (REPAIR; N66001-10-C-2010), R01. NS073940 und vom UCSF Neuroscience Imaging Center. Diese Arbeit wurde auch vom Eunice Kennedy Shiver National Institute of Child Health & Human Development der National Institutes of Health unter der Award-Nummer K12HD073945, dem Washington National Primate Research Center (WaNPCR, P51 OD010425) und das Center for Neurotechnology (CNT, ein Forschungszentrum der National Science Foundation Engineering Research Center unter Grant EEC-1028725). Wir danken Camilo Diaz-Botia, Tim Hanson, Viktor Kharazia, Daniel Silversmith, Karen J. MacLeod, Juliana Milani und Blakely Andrews für ihre Hilfe bei den Experimenten und Nan Tian, Jiwei He, Peter Ledochowitsch, Michel Maharbiz und Toni Haun für die technische Hilfe.

Alle Verfahren wurden von der University of California, San Francisco Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt und entsprechen dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren. Das folgende Verfahren wurde mit zwei erwachsenen männlichen Rhesusmakaken im Alter von 8 und 7 Jahren mit einem Gewicht von 17,5 kg bzw. 16,5 kg (Affe G und Affe J) durchgeführt.
HINWEIS: Verwenden Sie standardmäßige aseptische Techniken für alle chirurgischen Eingriffe.
1. Baseline Imaging
<ol><li>Sedate und intubieren das Tier und halten Vollnarkose unter Isofluran (Konzentration zwischen 0 und 5% je nach Bedarf geändert, abhängig von Vitalsymptomen wie Atemfrequenz und Herzfrequenz). Überwachen Sie die Temperatur, Herzfrequenz, Sauerstoffsättigung, elektrokardiographische Reaktionen und den Endgezeiten-Teildruck von CO2 während des gesamten Verfahrens.</li>
	<li>Legen Sie das Tier in einen MR-kompatiblen stereotaxic-Rahmen (siehe Materialtabelle), in dem es während des gesamten Verfahrens verbleibt. Schließen Sie das Tier an eine tragbare MR-kompatible Isofluran-Maschine an und transportieren Sie es zum MRT-Scanner (3 T).</li>
	<li>Erfassen Sie Standard T1 (Flip-Winkel = 9°, Wiederholungszeit/Echozeit = 668,6, Matrixgröße = 192 x 192 x 80 , Scheibendicke = 1 mm) und T2 (Flip-Winkel = 130°, Wiederholungszeit/Echozeit = 52,5, Matrixgröße = 256 x 256 x 45, Scheibendicke = 1 mm) anatomische MR-Bilder als Ausgangslage Referenz und für die chirurgische Planung.</li>
	<li>Das Tier aus der Anästhesie bergen und in die Tierhaltung transportieren.</li>
	<li>Verwenden Sie die erfassten T1- und T2-Bilder, um die Platzierung der Kraniotomie zu bestimmen. Die Lage der Kraniotomie kann genau bestimmt werden, indem der kortikale Interessenbereich von MR mit dem Makaken-Gehirnatlas (Paxinos, Huang, Petride, Toga 2nd Edition) abgerechnet wird. Darüber hinaus können diese Basisbilder eine Schätzung für die Standorte der virusviralen Infusion liefern. Die hier gezeigten kortikalen Regionen sind M1 und S1.</li>
</ol>2. MR-kompatible Kammerimplantation
<ol><li>Sedate und intubieren sie das Tier und pflegen Sie die Vollnarkose mit Standardanästhesieüberwachung wie in 1.1.</li>
	<li>Legen Sie das Tier in den MR-kompatiblen stereotaxic-Rahmen, in dem es während der gesamten Kammerimplantation und viralen Vektorabgabe verbleibt. Verbinden Sie das Tier mit einer tragbaren MR-kompatiblen Isofluran-Maschine.</li>
	<li>Erstellen Sie einen sagittalen Schnitt ca. 2 cm von der Mittellinie mit einer Länge von ca. 5 cm mit einem Skalpell.</li>
	<li>Entfernen Sie das darunter liegende Weichgewebe mit Aufzügen aus dem Schädel (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Erstellen Sie eine kreisförmige Kraniotomie (2,5 cm Durchmesser), um die vorgeplanten Injektionsbahnen mit einem Trephin abzudecken (siehe Tabelle der Materialien).<ol>
<li>Senken Sie den Mittelpunkt des Trephins am Rand des Trephins vorbei. Erstellen Sie einen Einzug in der Mitte der geplanten Kraniotomie ausreichend tief im Schädel, um das Trephin mit dem einstellbaren Mittelpunkt des Trephins zu verankern. Seien Sie vorsichtig, um ein vollständiges Eindringen durch die Schädeltiefe zu vermeiden, da dies Schäden am darunterliegenden Neuronalgewebe verursachen könnte.</li>
		<li>Spülen Sie den Bereich regelmäßig mit Saline, je nach Bedarf, um die Gewebefeuchtigkeit während der gesamten Kraniotomie zu erhalten.</li>
		<li>Sobald die Mitte gemacht ist, senken Sie das Trephin auf den Schädel und drehen Sie das Trephin im Uhrzeigersinn und gegen den Uhrzeigersinn, während Sie Abwärtsdruck ausüben, bis die Knochenkappe mit Zangen entfernt werden kann. Seien Sie vorsichtig, um eine Beschädigung des darunter liegenden Gewebes mit dem Trephin zu vermeiden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fädeleine eine feine Naht (Größe 6-0) durch die Dura in der Mitte der Kraniotomie und heben Sie die Dura, indem Sie sanft die Naht von der Oberfläche des Gehirns ziehen und ein Zelt in der Mitte der Kraniotomie bilden.</li>
	<li>Als nächstes punktieren Sie die Dura in der Nähe der Mitte des Zeltes mit feiner ophthalmologischer Schere, um zu vermeiden, dass das Gehirn beschädigt wird. Dann schneiden Sie die Dura von der Mitte bis zum Rand der Kraniotomie und weiter entlang der Kante mit feinen opthalmischen Schere.</li>
	<li>Montieren Sie die zylindrische, maßgeschneiderte CED MR-kompatible Kammer (Abbildung1; siehe Abschnitt 4 für Produktionsanleitungen) an den Schädel auf der Oberseite der Kraniotomie, um kanülaelle Unterstützung während der CED-Infusion zu bieten, so dass die Krümmung des Kammerflansches sich ausrichtet gut mit der Krümmung des Schädels.</li>
	<li>Befestigen Sie die Implantate am Schädel entweder mit Kunststoffschrauben und Dental-Acryl oder ein paar Titanschrauben.</li>
</ol>3. Virale Vektor-Lieferung
<ol><li>Kurz nach der Implantation der MR-kompatiblen Kammer und dem Einsetzen des Kanüleninjektionsgitters (Abbildung 1A-B, Zusatzabbildung 1) in die Kammer füllen Sie das Gitter mit Kochsaline (0,9% NaCl) zur Visualisierung der Injektionsstellen über MR-anatomische Bilder und Füllen Sie die Kammerhohlräume mit nasssteriler resorbierbarer Gelatine, um die Feuchtigkeit des Gehirns aufrechtzuerhalten (Abbildung 1F).</li>
	<li>Bedecken Sie die Haut und den Zylinder mit einem sterilen antimikrobiellen Schneidvorschnitt, um die Sterilität der Zylinder während des Transports und MR-Infusionen aufrechtzuerhalten. Legen Sie eine Vitamin-E-Kapsel, um die Oberseite des Injektionsgitters für eine positive Identifizierung zu markieren.</li>
	<li>Während das Tier intubiert bleibt, lösen Sie das Endotrachealrohr aus dem Anästhesiekreislauf und befestigen Sie es wieder an einer tragbaren MR-kompatiblen Isofluranmaschine und transportieren Sie das Tier zum MRT-Scanner.</li>
	<li>Erfassen Sie T1-Bilder (Flip-Winkel = 9°, Wiederholungszeit/Echozeit = 668,6, Matrixgröße = 192 x 192, Scheibendicke = 1 mm, 80 Scheiben), um den Abstand vom oberen Rand des Injektionsrasters und der kortikalen Oberfläche zu berechnen. Die Vitamin-E-Kapsel ist in T1-Bildern deutlich sichtbar und sollte als Marker für die Oberseite des Injektionsgitters verwendet werden (Abbildung 2A). Verwenden Sie das Linealwerkzeug der MR-Bildgebungssoftware, um den Abstand zwischen der Oberseite des Injektionsrasters und der kortikalen Oberfläche zu messen.</li>
	<li>Erfassen Sie T2-Bilder (Flip-Winkel = 130°, Wiederholungszeit/Echozeit = 52,5, Matrixgröße = 256 x 256, Scheibendicke = 1 mm, 45 Scheiben), um die optimalen Kanülenführungen für jeden Standort basierend auf dem Zielort der Infusion zu bestimmen (Abbildung 2B-C). Wie bereits erwähnt, ist das Kanülengitter mit Einer Saline gefüllt, die in T2-Bildern am besten sichtbar ist. Mit der MR-Bildgebungssoftware scrollen Sie durch die koronalen und sagittalen Ebenen, um den Zielort der Infusion zu finden.</li>
	<li>Nachdem Sie den viralen Vektor für einige Stunden bei Raumtemperatur auftauen, mischen Sie den viralen Vektor mit dem MR-Kontrastmittel Gadoteridol (Verhältnis 250:1; 2mM Gd-DTPA, siehe Materialtabelle) durch Pipette oder Wirbelmischung. HINWEIS: Die vorgestellte Technik wurde auf AAV-Vektoren mit einem CamKIIa-Promotor getestet, der die Expression von C1V1 mit EYFP verschmolzen (AAV2.5-CamKII-C1V1-EYFP, Titer: 2,5 x 1012 Virusmoleküle/ml; siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Laden Sie das gemischte Virus in einen 0,2 ml Hochdruck-IV-Schlauch (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Richten Sie ein steriles Feld außerhalb des MR-Scanners ein, um die virale Infusionslinie vorzubereiten.</li>
	<li>Mit Hochdruck-IV-Schläuchen eine lange Verlängerungsleitung (ca. 3-5 Meter, je nach Standort der Infusionspumpe in Bezug auf die MR-Bohrung) an eine MR-kompatible 3 ml Spritze anschließen und mit Kochsaline grundieren.</li>
	<li>Schließen Sie das distale Ende der langen Verlängerungslinie an das proximale Ende des mit dem Virus beladenen 0,2 ml IV-Schlauches an und befestigen Sie die refluxresistente Kanüle mit einer 1 mm gestuften Spitze (Abbildung 2D; siehe Abschnitt 5 für Kanülenproduktionsanweisungen) an das distale Ende diese Baugruppe mit einem Klemmen-Katheterstecker (siehe Materialtabelle) (Abbildung 2E).</li>
	<li>Stellen Sie schließlich die Spritze in eine MR-kompatible Pumpe (siehe Materialtabelle). Stellen Sie den Pumpenregler in den Scanner-Kontrollraum, da er nicht MR-kompatibel ist.</li>
	<li>Wählen Sie anhand der zuvor erhaltenen anatomischen MR-Basisbilder die Position des Kanüleninjektionsgitters und die Einfügetiefe aus, die erforderlich sind, um die Zielinfusionsstelle zu erreichen. Markieren Sie die Einfügetiefe auf der Kanüle mit sterilem Klebeband.</li>
	<li>Beginnen Sie die Infusion mit einer Rate von 1 l/min und validieren Sie den Fluss der Flüssigkeit in der Infusionslinie visuell, indem Sie den Auswurf von Flüssigkeit aus der Kanülenspitze beobachten.</li>
	<li>Legen Sie die Kanüle manuell durch das Injektionsgitter in die Zieltiefe ein und halten Sie gleichzeitig den Durchfluss in der Infusionslinie aufrecht, da dadurch verhindert wird, dass das eingedrungene Gewebe die Kanüle während des Einsetzens verstopft.</li>
	<li>Erfassen Sie schnelle (2 Minuten) Blitz T1 gewichtete Bilder (Flip-Winkel = 30°, Wiederholungszeit / Echozeit = 3,05, Matrixgröße = 128 x 128, Scheibendicke = 1 mm, 64 Scheiben) für die Online-Überwachung der viralen Vektorinfusion.</li>
	<li>Nach der Infundierung von 10 L des Vektors, so dass genügend Viren in den MR-Scanner infundiert werden, erhalten Sie MR-Bilder, um die korrekte Kanülenplatzierung zu überprüfen, wie dies durch die beobachtete Ausbreitung des Virus offensichtlich ist. Wenn die Tiefe der eingelegten Kanüle falsch ist, passen Sie die Tiefe entsprechend an oder entfernen Sie langsam die Kanüle und versuchen Sie es erneut, wie in 3.12.</li>
	<li>Überwachen Sie die Infusion durch Anleitung von Online-MR-Bildern (Flash T1 gewichtet) und erhöhen Sie die Infusionsrate alle paar Minuten um 1 L/min Schritte auf 5 l/min Schritte (Abbildung 3A).</li>
	<li>Nachdem Sie ca. 40 l des viralen Vektors infundiert haben, beginnen Sie, die Infusionsrate um 1 L/min-Schritte zu reduzieren, und stoppen Sie die Infusion, nachdem 50 l injiziert wurden, und lassen Sie die Kanüle für 10 Minuten an Ort und Stelle.</li>
	<li>Entfernen Sie langsam die Kanüle aus dem Gehirn und bewegen Sie sich zum nächsten Ort. Wiederholen Sie die Schritte 3.9 bis 3.19 für jeden Standort.</li>
	<li>Bedecken Sie den Zylinder mit einem sterilen Vorhang am Ende der Injektionen, bevor tierische Transport. Dann transportieren Sie das Tier zurück in den Operationssaal.</li>
	<li>Entweder die MR-kompatible Kammer auspflanzen und den chirurgischen Schnitt schließen, indem sie die Knochenklappe und den darüber liegenden Muskel ersetzen und die Haut mit standardaseptischen Techniken nähen, oder ersetzen Sie die Kammer durch einen Titanzylinder und künstliche Dura (siehe Yazdan-Shahmorad et al. 20169) für neuronale Aufnahme und Stimulation.</li>
</ol>4. MR-kompatible Kammerproduktion
<ol><li>Herstellung des Nylonkanülen-Injektionsgitters (Abbildung 1A-B) durch Bearbeitung nach den angegebenen Abmessungen (Zusatzabbildung 1).</li>
	<li>3D drucken Sie den MR-kompatiblen Zylinder aus Acrylnitril Butadien-Styrol (ABS0-Kunststoff (Abbildung 1C-E) (siehe Zusatzdatei 1-3; siehe Materialtabelle für 3D-Drucker und Materialien). HINWEIS: Ein Entwurf unterhält ein festes Kanüleneinspritzgitter innerhalb des MR-kompatiblen Zylinders (Abbildung 1C), während ein anderes die Rotation des Rasters ermöglicht und den Einspritzbereich erweitert (Abbildung 1D-E).</li>
	<li>Gewinden Sie das Kanülen-Injektionsgitter und tippen Sie auf den entsprechenden Hohlraum der MR-kompatiblen Kammer, so dass beide Teile den gleichen Einfädeln aufweisen. HINWEIS: Jede Art von Gewindekannen kann verwendet werden, sofern beide Komponenten das gleiche Gewinde haben.</li>
	<li>Setzen Sie das Nylonkanüle-Injektionsgitter ein, indem Sie in das Gewindeloch des MR-kompatiblen Zylinders einschrauben.</li>
</ol>5. Reflux-resistente Kanülenproduktion13
<ol><li>Schneiden Sie einen 30 cm langen Kieselsäureschlauch mit 0,32 mm ID und 0,43 mm OD für den inneren Kieselsäureschlauch (siehe Materialtabelle) mit einer Rasierklinge.</li>
	<li>Schneiden Sie einen 7,5 cm langen und einen 5 cm langen Kieselsäureschlauch mit 0,45 mm ID und 0,76 mm OD für den äußeren Kieselsäureschlauch (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Halten Sie die 7,5 cm außenschläuche an den 30 cm innenschläuchemit Cyanoacrylat so fest, dass sich das Innenrohr 1 mm über das Außenrohr hinaus erstreckt, wodurch der refluxresistente Schritt (Abbildung 2D) wird. Um sicherzustellen, dass das Cyanoacrylat nicht in das Innere der Innenschläuche gelangt, legen Sie das Cyanoacrylat auf die Außenseite der Innenschläuche weit von der Kanülenspitze.</li>
	<li>Fügen Sie den 5 cm langen Kieselsäureschlauch an das andere Ende des Innenschlauchs ein, um ihn am Klemmen-Katheteranschluss zu befestigen (siehe Schritt 3.10).</li>
</ol>

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</ol>

PNS hat finanzielles Interesse an Neuralink Corp., einem Unternehmen, das klinische Therapien mit Hilfe von Hirnstimulation entwickelt.

Hier skizzieren wir eine praktikable und effiziente Technik zur Erzielung einer großflächigen optogenetischen Expression in NHP primärssomatosensorischer und motorischer Kortex durch MR-geführte CED. Die Verwendung von MR-geführtem CED bietet erhebliche Vorteile gegenüber herkömmlichen Methoden der viralen Infusion im NHP-Gehirn. Ein solcher Vorteil ist die Fähigkeit, Expression über große Gebiete mit weniger erforderlichen Infusionen zu erreichen. Zum Beispiel, mit herkömmlichen Methoden, Mehrfachinjektionen von 1-2 l d...

Optogenetik ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das die Manipulation der neuronalen Aktivität und die Untersuchung von Netzwerkverbindungen im Gehirn ermöglicht. Die Implementierung dieser Technik bei nicht-menschlichen Primaten (NHPs) hat das Potenzial, unser Verständnis von groß angelegter neuronaler Berechnung, Kognition und Verhalten im Primatengehirn zu verbessern. Obwohl die Optogenetik in den letzten Jahren erfolgreich in NHPs implementiert wurde1,2,3,4,5,6,eine Herausforderung, die Forscher gesicht endiebe hohe Ausdrucksniveaus über große Hirnbereiche bei diesen Tieren. Hier bieten wir einen effizienten und vereinfachten Ansatz, um ein hohes Maß an optogenetischer Expression über große Bereiche des Kortex in Makaken zu erreichen. Diese Technik hat großes Potenzial, aktuelle optogenetische Studien an diesen Tieren inKombination mit modernsten Aufnahmen 8,9 und optischestimulation10 Technologien zu verbessern.
Konvektionsverstärkte Abgabe (CED) ist eine etablierte Methode der Lieferung von pharmakologischen Wirkstoffen und anderen großen Molekülen, einschließlich viraler Vektoren, an das zentrale Nervensystem11,12,13. Während herkömmliche Verabreichungsmethoden mehrere Infusionen mit geringem Volumen beinhalten, die über kleine Regionen des Gehirns verteilt sind, kann CED eine breitere und gleichmäßigere Agentenverteilung mit weniger Infusionen erreichen. Druckgetriebene Massenflüssigkeitsströme (Konvektion) während der Infusion ermöglichen eine breitere und gleichmäßig verteilte Transduktion des Zielgewebes bei der Bereitstellung viraler Vektoren mit CED. In neueren Studien haben wir die Transduktion und anschließende optogenetische Expression großer Bereiche der Primärmotor (M1) und somatosensorischen (S1) Kortika9 und Thalamus14 mit Magnetresonanz (MR)-geführtem CED nachgewiesen.
Hier skizzieren wir die Verwendung von CED, um eine optogenetische Expression über große kortikale Bereiche mit nur wenigen kortikalen Injektionen zu erreichen.

<table><tbody><tr><td>0,2 mL Hochdruck-Infusionsschläuche</td><td>Smiths Medical Inc., Dublin, OH, USA</td><td>533640</td><td></td></tr><tr><td>0,32 mm Innendurchmesser, 0,43 mm Außendurchmesser Quarzglasschläuche</td><td>Polymicro Technologies</td><td>1068150027</td><td></td></tr><tr><td>0,45 mm Innendurchmesser, 0,76 mm Außendurchmesser Quarzglasschläuche</td><td>Polymicro Technologies</td><td>1068150625</td><td></td></tr><tr><td>AAV2,5-CamKII-C1V1-EYFP</td><td>Penn Vector Core, Universität von Pennsylvania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ABS Kunststoff</td><td>Stratasys, MN, USA</td><td>ABSplus-P430</td><td></td></tr><tr><td>Antimikrobielles Inzisionstuch</td><td>3M</td><td>6650EZ</td><td>Ioban Drape</td></tr><tr><td>Dental Acryl</td><td>Henry Schein, Inc.</td><td>1013117</td><td>Acryl-Haftvermittler</td></tr><tr><td>Aufzüge</td><td>VWR International, LLC.</td><td>10196-564</td><td>Langenbeck Elevator, breite Spitze</td></tr><tr><td>Feine Naht</td><td>McKesson Medical-Surgical Inc.</td><td></td><td></td>1034505</tr><tr><td>Gadoteridol</td><td>Prohance, Bracco Diagnostics, Princeton, NJ</td><td>0270-1111-04</td><td></td></tr><tr><td>Laser zur Lichtstimulation</td><td>Omicron-Laserage, Deutschland</td><td>PhoxX 488-60</td><td></td></tr><tr><td>MR kompatible 3 cc Spritze</td><td>Harvard Gerät, Holliston, MA, USA</td><td>59-8377</td><td></td></tr><tr><td>MR Imaging Software</td><td>Pixmeo</td><td>OsiriX MD 10.0</td><td></td></tr><tr><td>MR-kompatibel Pumpe</td><td>Harvard apparat, Holliston, MA, USA</td><td>Harvard PHD 2000</td><td></td></tr><tr><td>MR-kompatibler stereotaktischer Rahmen</td><td>KOPF</td><td>1430M MRT</td><td></td></tr><tr><td>Perifix Clamp Style Katheteranschluss</td><td>B-Braun, Bethlehem, PA, USA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Kunststoffschrauben</td> Kunststoff <td>1</td><td>0-80 x 1/8N</td><td>Nylonschrauben</td></tr><tr><td>Titanschrauben</td><td>Crist Instrument Co., Inc.</td><td>6-YCX-0312</td><td>Selbstschneidende Knochenschrauben</td></tr><tr><td>Trephine</td><td>GerMedUSA Inc,SKU</td><td>:GV70-42</td><td></td></tr><tr><td>uPrinter SE 3D-Drucker</td><td>Stratasys, MN, USA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Vitamin E Kapsel</td><td>Pure Encapsulations, LLC.</td><td>DE1</td><td></td></tr><tr><td>Nass sterile resorbierbare Gelatine</td><td>Pfizer Inc.</td><td>AZL0009034201</td><td>Gelschaum</td></tr></tbody></table>

konvektion verbesserte lieferung von optogenetischen adeno-assoziierten viral vektor an den cortex von rhesus macaque unter anleitung von online-mrt-bildern

Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images

In der Optogenetik von nicht-menschlichen Primaten (NHP) ist die Infektion großer kortikaler Bereiche mit viralen Vektoren oft eine schwierige und zeitaufwändige Aufgabe. Hier zeigen wir die Verwendung von Magnetresonanz (MR)-geführte Konvektions-verstärkte Abgabe (CED) optogenetischer viraler Vektoren in primäre somatosensorische (S1) und motorische (M1) Kortiken von Makaken, um eine effiziente, weitverbreitete kortikale Expression von lichtempfindliche Ionenkanäle. Adeno-assoziierte virale (AAV) Vektoren, die das rot verschobene Opsin C1V1 kodieren, das mit gelbem fluoreszierendem Protein (EYFP) verschmolzen ist, wurden unter MR-geführtem CED in den Kortex von Rhesusmakaken injiziert. Drei Monate nach der Infusion bestätigte die epifluoreszierende Bildgebung große Regionen optogenetischer Expression (>130 mm2) in M1 und S1 in zwei Makaken. Darüber hinaus konnten wir zuverlässige lichtevokierte elektrophysiologische Reaktionen aus den exzessierten Bereichen mit mikroelektrokortikographischen Arrays aufzeichnen. Spätere histologische Analysen und Immunflecken gegen den Reporter ergaben eine weit verbreitete und dichte optogenetische Expression in M1 und S1, die der Verteilung entspricht, die durch epifluoreszierende Bildgebung angezeigt wird. Diese Technik ermöglicht es uns, innerhalb eines kürzeren Zeitraums mit minimalen Schäden im Vergleich zu den herkömmlichen Techniken Expression über große Bereiche des Kortex zu erhalten und kann ein optimaler Ansatz für die optogenetische Virusabgabe bei großen Tieren wie NHPs sein. Dieser Ansatz zeigt ein großes Potenzial für die Manipulation neuronaler Schaltkreise auf Netzwerkebene mit Zelltyp-Spezifität in Tiermodellen, die evolutionär nah am Menschen sind.

Convection Enhanced Delivery (CED) unter MRT-Leitfaden
Die Ausbreitung des viralen Vektors wurde während der CED-Infusion unter Anleitung von Online-MR-Bildern überwacht (Abbildung 3A). In dieser Studie wurden S1 und M1 von zwei Affen ins Visier genommen (Abbildung 3B). Die dreidimensionalen Verteilungsvolumina wurden in einer Post-hoc-Analyse der MR-Bi...

Hier zeigen wir Magnetresonanz (MR)-geführte Konvektions-verstärkte Abgabe (CED) von viralen Vektoren in den Kortex als effizienten und vereinfachten Ansatz zur Erzielung optogenetischer Expression über große kortikale Bereiche im Makakenhirn hinweg.

Konvektion Verbesserte Lieferung von optogenetischen Adeno-assoziierten Viral vektor an den Cortex von Rhesus Macaque unter Anleitung von Online-MRT-Bildern

In non-human primate (NHP) optogenetics, infecting large cortical areas with viral vectors is often a difficult and time-consuming task. Here, we ...

Konvektionsverbesserte Abgabe(CED) von optogenetischen Virusvektoren bei nichtmenschlichen Primaten wird es Forschern ermöglichen, neuronale Aktivität in großem Maßstab zu manipulieren, um komplexe neuronale Berechnungen und Verhaltensweisen zu verstehen. Mit CED können wir eine hohe optogenetische Expression über große Regionen des Primatenhirns mit nur wenigen Injektionen in kurzer Zeit im Vergleich zu traditionellen Methoden erreichen. Magnetresonanz oder MR-kompatible Kammerimplantation wird in DerRegel bei nichtmenschlichen Primatenoperationen durchgeführt, das Verfahren wird im Textprotokoll ausführlich beschrieben und in diesem Video kurz beschrieben.Nach der Sedierung, Positionierung und anfänglichen Einschnitte, wie im Textprotokoll beschrieben, erstellen Sie eine kreisförmige Kraniotomie, um die vorgeplanten Flugbahnen für Injektionen mit einem Trephin abzudecken. Erstellen Sie einen Einzug in der Mitte der geplanten Kraniotomie ausreichend tief im Schädel, um das Trephin mit dem einstellbaren Mittelpunkt des Trephins zu verankern. Sobald die Mitte gemacht ist, senken Sie das Trephin auf den Schädel und drehen Sie das Trephin im Uhrzeigersinn und gegen den Uhrzeigersinn, während Sie Abwärtsdruck ausüben, bis die Knochenkappe mit Zangen entfernt werden kann.Nach dem Anheben der Dura, wie im Textprotokoll beschrieben, schneiden Sie die Dura von der Mitte bis zum Rand der Kraniotomie und fahren Sie entlang der Kante mit feiner ophthalmologischer Schere fort. Montieren Sie die zylindrische maßgeschneiderte Konvektion verbesserte Lieferung MR-kompatible Kammer auf den Schädel auf der Oberseite der Kraniotomie, um Kanülenunterstützung während der Infusion zu bieten, so dass die Krümmung des Kammerflanschguts gut mit der Krümmung des Schädels ausgerichtet ist. Befestigen Sie die Implantate am Schädel entweder mit Kunststoffschrauben und Dental-Acryl oder ein paar Titanschrauben.Befüllen Sie das Gitter kurz nach dem Implantieren der MR-kompatiblen Kammer und dem Einsetzen des Kanüleninjektionsgitters mit 0,9% Saline zur Visualisierung der Injektionsstellen über MR-anatomische Bilder. Füllen Sie auch die Kammerhohlräume mit nasssterilem, resorbierbarem Gelschaum, um die Feuchtigkeit des Gehirns aufrechtzuerhalten. Bedecken Sie die Haut und den Zylinder mit einem sterilen antimikrobiellen Schneidvorschnitt, um die Sterilität der Zylinder während des Transports und MR-Infusionen aufrechtzuerhalten.Legen Sie eine Vitamin-E-Kapsel, um die Oberseite des Injektionsgitters für eine positive Identifizierung zu markieren. Während das Tier intubiert bleibt, lösen Sie das Endotrachealrohr aus dem Anästhesiekreislauf und befestigen Sie es wieder an einer tragbaren MR-kompatiblen Isofluran-Maschine. Transportieren Sie das Tier zum MRT-Scanner.Erfassen Sie T1-Bilder, um den Abstand vom oberen Rand des Injektionsgitters und der kortikalen Oberfläche zu berechnen. Die Vitamin-E-Kapsel ist in T1-Bildern deutlich sichtbar und sollte als Marker für die Oberseite des Injektionsgitters verwendet werden. Erfassen Sie T2-Bilder, um die optimalen Kanülenführungen für jeden Standort basierend auf dem Zielort der Infusion zu bestimmen.Das Kanülenraster ist mit Einer Saline gefüllt, die in T2-Bildern am besten sichtbar ist. Mit der MR-Bildgebungssoftware scrollen Sie durch die koronalen und sagittalen Ebenen, um den Zielort der Infusion zu finden. Nachdem Sie den viralen Vektor für ein paar Stunden bei Raumtemperatur auftauen, mischen Sie den viralen Vektor mit dem MR-Kontrastmittel Gadoteridol durch Pipetten- oder Wirbelmischung.Laden Sie das gemischte Virus in 0,2 Milliliter Hochdruck-IV-Schläuche. Mit Hochdruck-IV-Schläuchen eine lange Verlängerungsleitung an eine MR-kompatible Drei-Milliliter-Spritze anschließen und mit Kochsaline grundieren. Schließen Sie das andere Ende des langen Verlängerungsschlauchs an die 0,2 Milliliter IV-Schläuche an, die mit dem Virus beladen sind.Dann befestigen Sie die refluxbeständige Kanüle mit einer ein Milliliter gestuften Spitze mit einem Klemmen-Katheterstecker am distalen Ende dieser Baugruppe. Stellen Sie die Spritze schließlich in eine MR-kompatible Pumpe ein. Wählen Sie anhand der erhaltenen anatomischen MR-Basisbilder die Position des Kanüleninjektionsgitters und die Einfügetiefe aus, die erforderlich sind, um die Zielinfusionsstelle zu erreichen.Markieren Sie die Einfügetiefe auf der Kanüle mit sterilem Klebeband. Beginnen Sie die Infusion mit einer Rate von einem Mikroliter pro Minute und validieren Sie den Fluss der Flüssigkeit in der Infusionslinie visuell, indem Sie den Auswurf von Flüssigkeit aus der Kanülenspitze beobachten. Legen Sie die Kanüle manuell durch das Injektionsgitter in die Zieltiefe ein und halten Sie gleichzeitig den Durchfluss in der Infusionslinie aufrecht, da dies verhindert, dass das eingedrungene Gewebe die Kanüle während des Einsetzens verstopft.Erfassen Sie jetzt schnelle Flash-T1-gewichtete Bilder für die Online-Überwachung der viralen Vektorinfusion. Nach der Infundierung von ca. 10 Mikroliter des Vektors, so dass genügend Viren in den MR-Scanner infundiert werden, erhalten Sie MR-Bilder, um die korrekte Kanülenplatzierung zu überprüfen, wie die stagnierte Ausbreitung des Virus zeigt. Wenn die Tiefe der eingelegten Kanüle falsch ist, passen Sie die Tiefe entsprechend an oder entfernen Sie langsam die Kanüle, und versuchen Sie erneut, die Einfügung zu versuchen.Überwachen Sie die Infusion durch Anleitung von Online-MR-Bildern. Erhöhen Sie die Infusionsrate auf fünf Mikroliter pro Minute um einen Mikroliter pro Minute Schritte alle paar Minuten. Es ist wichtig, die Infusionsrate langsam zu erhöhen und nicht mehr als fünf Mikroliter pro Minute zu überschreiten, da hohe Infusionsraten Gewebeschäden verursachen könnten.Nachdem Sie etwa 40 Mikroliter des viralen Vektors infundiert haben, beginnen Sie, die Infusionsrate um einen Mikroliter pro Minute zu reduzieren. Beenden Sie die Infusion, nachdem ca. 50 Mikroliter injiziert wurden. Lassen Sie die Kanüle für zehn Minuten an Ort und Stelle.Entfernen Sie langsam die Kanüle aus dem Gehirn und bewegen Sie sich zum nächsten Ort. Den Zylinder vor dem Tiertransport mit einem sterilen Vorhang am Ende der Injektionen bedecken und das Tier dann zurück in den Operationssaal transportieren. Histologische Analysen an seriellen koronalen Abschnitten zeigen eine großangelegte optogenetische Expression um die Infusionsstellen.Hier sind das koronale Basisbild und die Ausbreitung des Kontrastmittels nach der Infusion für dieselbe MR-Koronascheibe zu sehen. Ein koronaler Gewebeabschnitt wird ungefähr gleich dargestellt. Peroxidase-Färbung spiegelt die Expression des gelben fluoreszierenden Proteins oder EYFP-Reporters wider.Eine gute Ausrichtung wird zwischen dem Bereich der EYFP-Expression beobachtet, gemessen mit Oberflächenepifluoreszense und mit histologischer Färbung. Dazu gehört die Region der Vektorausbreitung, die aus MR-Bildern geschätzt wird. Weiße Punkte zeigen Injektionsstellen an und der gesamte schwarze Bereich stellt den Bereich dar, der durch die Craniotomie exponiert wird.Hier ist ein Bild mit geringer Vergrößerung der koronalen Abschnitte zu sehen, die mit einem GfP-Antikörper mit Anti-GFP-Antikörpern befleckt sind und den medialen lateralen Aspekt der YFP-Expression im somatosensorischen Kortex zeigen. Die schwarze Pfeilspitze zeigt die Position der Kanülenspur an. Das benachbarte Gewebe wird bei größerer Vergrößerung gezeigt, um eine laminare Verteilung der YFP-positiven Zellen zu zeigen.Dicht besiedelte Regionen von YFP-positiven Zellen befinden sich überwiegend in den Schichten zwei bis drei und fünf bis sechs. Eine weitere Vergrößerung zeigt typische Pyramidenzellen in den Schichten zwei bis drei, Schicht fünf und Schicht sechs. Es ist wichtig, die Kanüle für 10 Minuten an Ort und Stelle zu lassen, nachdem der Fluss gestoppt wurde.Dadurch wird sichergestellt, dass das Virus in das umgebende zielgerichtete Neuronalgewebe gelangt ist. CED ist ein effizienter Ansatz, um gleichmäßig hohe Expressionsniveaus in großen Hirnregionen bei Säugetieren zu erreichen. Es hat das Potenzial, unser Verständnis von neuronalen Schaltkreisen und Konnektivität zu erweitern.Nach viraler Transduktion durch CED können nachfolgende optogenetische Stimulationsexperimente mit elektrischen Aufzeichnungs- und Verhaltens-Essays gepaart werden, um die komplexe Schaltungsdynamik im Gehirn zu enthüllen. Diese Technik wurde bereits 2018 von Yazdan-Shahmorad und Kollegen eingesetzt, bei der die optogenetische neuronale Modulation eingesetzt wurde, um netzwerkweite Konnektivitätsänderungen im sensorischen motorischen Kortex zu induzieren.

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Research

Forschung

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Neuroscience

Neurowissenschaften

Hier präsentieren wir die intrakranielle Injektion von AAV-Vektoren für die Fluoreszenzmarkierung von Neuronen und Gliazellen in der Sehrinde.

Intrakranielle Injektion von Adeno-assoziierte virale Vektoren

Die jüngste Entwicklung der Neurowissenschaften Tools, die Genetik und Optik zu kombinieren, die als "Optogenetik", ermöglicht die Kontrolle über die neuronalen Schaltkreis-Aktivität mit einem beispiellosen Maß an räumlicher und zeitlicher Auflösung. Hier bieten wir ein Protokoll für die Integration von In-vivo-Aufnahme mit optogenetischen Manipulation von genetisch definierte Untergruppen von präfrontalen kortikalen und subicular Pyramidenzellen.

Eine Methode zur High Fidelity optogenetische Kontrolle der Einzelpyramidenzellen<em&gt; In-vivo-</em

Dieses Protokoll beschreibt die Schritte und Datenanalysen, die für eine erfolgreiche Durchführung der optogenetischen funktionellen Magnetresonanztomographie (ofMRT) erforderlich sind. ofMRT ist eine neuartige Technik, die die Hochfeld-fMRT-Auslesung mit optogenetischer Stimulation kombiniert und so eine zelltypspezifische Kartierung funktioneller neuronaler Schaltkreise und ihrer Dynamik im gesamten lebenden Gehirn ermöglicht.

Optogenetische Functional MRI

Dieses Video zeigt das Kraniotomieverfahren, das die chronische Bildgebung von Neuronen im retrosplenialen Kortex der Maus mittels in vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie in der transgenen Thy1-GFP-Linie ermöglicht. Dieser Ansatz wird mit der Injektion von mCherry-exprimierenden Adeno-assoziierten Viren in den dorsalen Hippocampus kombiniert. Diese Techniken ermöglichen eine langfristige Überwachung der erfahrungsabhängigen strukturellen Plastizität bei RSC.

Die gleichzeitige Zwei-Photonen<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging der synaptischen Eingänge und Postsynaptische Targets in der Maus retrosplenialen Cortex

Wie derzeit implementiert, erfordert die Optogenetik bei nichtmenschlichen Primaten die Injektion viraler Vektoren in das Gehirn. Eine optimale Injektionsmethode sollte zuverlässig sein und für viele Anwendungen in der Lage sein, einzelne Stellen beliebiger Tiefe anzuvisieren, die in der postmortalen Histologie leicht und eindeutig identifiziert werden können. Ein Injektionsverfahren mit diesen Eigenschaften wird vorgestellt.

Injektionen von AAV-Vektoren für die Optogenetik in anästhesiertem und wach verhaltendem nicht-menschlichem Primatengehirn

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die virale Transduktion diskreter Hirnregionen mit optogenetischen Konstrukten beschreibt, um eine synapsenspezifische elektrophysiologische Charakterisierung in akuten Nagetierhirnschnitten zu ermöglichen.

Ex vivo Optogenetische Befragung der synaptischen Übertragung und Plastizität über große Entfernungen vom medialen präfrontalen Kortex zum lateralen entohinalen Kortex

In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll, das die Adeno-assoziierte Virusinjektion mit der Implantation eines Schädelfensters kombiniert, um die Dynamik der Mikroglia und die neuronale Aktivität in wachen Mäusen simultan abzubilden.

Simultane Bildgebung von Mikrogliadynamik und neuronaler Aktivität in wachen Mäusen

Es wird eine neue Technik zur großflächigen Verabreichung von Adeno-assoziierten Viren beschrieben, die eine Subarachnoidalvirus-Infusion verwendet. Diese Methode gewährleistet nicht nur eine weit verbreitete Transduktion von neokortikalen Neuronen der Maus in oberflächlichen Schichten, sondern führt auch zu einer selektiven Expression des Transgens in pyramidalen Neuronen der fünften Schicht, selbst wenn ein nicht-selektiver Promotor verwendet wird.

Weit verbreitete Transduktion neokortikaler Neuronen der Maus durch Subarachnoidal-Injektion von AAV2

Dieses Protokoll bietet eine integrierte Methode, die virale Abgabe, Optrodenimplantation, photothrombotische Induktion, gleichzeitige Aufzeichnung der Astrozyten- und neuronalen Aktivität sowie optogenetische Stimulation von Astrozyten umfasst. Diese integrierte Methode zielt darauf ab, eine parallele Untersuchung der Astrozyten-Neuron-Beziehung über die akuten bis chronischen Stadien des ischämischen Schlaganfalls zu ermöglichen.

Eine integrierte Methode zur photothrombotischen Schlaganfallmodellierung und zur in-vivo-Optrodenerfassung neuronaler und astrozytischer Aktivität bei sich wirkenden Mäusen

Es wird ein Verfahren zur Manipulation der Aktivität der zerebralen kortikalen Pyramidenzellen optogenetically während das Elektroenzephalogramm, Elektromyogramm, und zerebrale Laktatkonzentration überwacht werden beschrieben. Experimentelle Aufnahmen werden auf Kabel-tethered Mäusen durchgeführt, während sie spontane Schlaf / Wach-Zyklen. Optogenetische Ausrüstung wird in unserem Labor zusammengebaut; Kontrollgerät ist kommerziell erhältlich.

Gleichzeitige Elektroenzephalographie, Real-time Messung der Laktat-Konzentration und optogenetische Manipulation der neuronalen Aktivität in der Nagetier Cerebral Cortex

Erfahren Sie die MR-gesteuerte konvektionsverstärkte Lieferung optogenetischer Virenvektoren im Makakenkortex. Diese Methode ermöglicht großflächige neuronale Manipulation und erweitert das Verständnis komplexer Schaltkreise.

Konvektion Verbesserte Lieferung von optogenetischen Adeno-assoziierten Viral vektor an den Cortex von Rhesus Macaque unter Anleitung von Online-MRT-Bildern (Video) | JoVE Journal

Konvektion Verbesserte Lieferung von optogenetischen Adeno-assoziierten Viral vektor an den Cortex von Rhesus Macaque unter Anleitung von Online-MRT-Bildern

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