Name: Assaying Circuit Spezifische Regulation von adulthippocampal neuralen Vorläuferzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Erfahren Sie, wie chemogenetische Manipulation neuronaler Schaltkreise die Proliferation adulter neuraler Stammzellen im Hippocampus reguliert. Diese Methode ermöglicht präzise Untersuchungen zur Neurogenese im erwachsenen Gehirn.

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L.J.Q. wurde vom National Institute of Mental Health der National Institutes of Health unter Diversity Supplement R01MH111773 sowie einem T32-Ausbildungsstipendium T32NS007431-20 unterstützt. Dieses Projekt wurde durch Zuschüsse unterstützt, die J.S. von NIH (MH111773, AG058160 und NS104530) gewährt wurden.

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Das Ziel dieses Protokolls ist es zu beurteilen, wie die Manipulation bestimmter neuronaler Schaltkreise die adulte Hippocampus-Neurogenese in vivo mit einer Reihe von Immunhistochemie-Techniken reguliert. Die aktivitätsabhängige Regulation der adulten Neurogenese, die durch bestimmte neuronale Schaltkreise vermittelt wird, ist eine wertvolle Technik mit großem Potenzial für Modifikationen, um eine Vielzahl von neuronalen Schaltkreisen zu untersuchen. Der Erfolg dieser Arten von Experimenten hängt von mehreren Faktoren a...

Adult Neurogenesis ist ein biologischer Prozess, durch den neue Neuronen in einem Erwachsenen geboren und in die bestehenden neuronalen Netzwerke integriert werden1. Beim Menschen findet dieser Prozess im Dentate Gyrus (DG) des Hippocampus statt, wo täglich etwa 1.400 neue Zellen geboren werden2. Diese Zellen befinden sich im inneren Teil der DG, der eine neurogene Nische, die so genannte subgranulare Zone (SGZ), beherbergt. Hier durchlaufen hippocampale adulte neuronale Stammzellen (NSCs) einen komplexen Entwicklungsprozess, um voll funktionsfähige Neuronen zu werden, die zur Regulierung spezifischer Gehirnfunktionen beitragen, einschließlich Lernen und Gedächtnis, Stimmungsregulierung und Stressreaktion3 ,4,5,6. Um das Verhalten zu beeinflussen, werden erwachsene NSCs durch verschiedene externe Reize in einer aktivitätsabhängigen Weise stark reguliert, indem sie auf eine Reihe lokaler und distaler chemischer Hinweise reagieren. Diese chemischen Hinweise umfassen Neurotransmitter und Neuromodulatoren und handeln in einer Schaltung spezifische Weise aus verschiedenen Gehirnregionen. Wichtig ist, dass die kreisweite Konvergenz dieser chemischen Hinweise auf NSCs eine einzigartige und präzise Regulierung von Stammzellaktivierungs-, Differenzierungs- und Schicksalsentscheidungen ermöglicht.
Eine der effektivsten Möglichkeiten, die Schaltungsregulierung von erwachsenen NSCs in vivo abzuhören, besteht darin, die Immunfluoreszenzanalyse mit kreisweiten Manipulationen zu koppeln. Die Immunfluoreszenzanalyse von nSCs für Erwachsene ist eine häufig verwendete Technik, bei der Antikörper gegen bestimmte molekulare Marker verwendet werden, um das Entwicklungsstadium von nSCs für Erwachsene anzuzeigen. Zu diesen Markern gehören: Nestin als radiale Gliazelle und früher neuronaler Vorläufermarker, Tbr2 als zwischengeschalteter Vorläufermarker und dcx als Neuroblast und unreifer Neuronenmarker7. Zusätzlich können durch die Verabreichung von Thymidin-Analogen wie BrdU, CidU, Idu und Edu Zellpopulationen, die sich der S-Phase unterziehen, individuell beschriftet und visualisiert werden8,9,10. Durch die Kombination dieser beiden Ansätze kann eine breite Palette von Fragen untersucht werden, die von der Art und Weise, wie die Proliferation in bestimmten Entwicklungsstadien reguliert wird, bis hin zur Wirkung verschiedener Hinweise auf die NSC-Differenzierung und Neurogenese reichen.
Es gibt mehrere Möglichkeiten, neuronale Schaltkreise effektiv zu manipulieren, einschließlich elektrischer Stimulation, Optogenetik und Chemogenetik, jeder mit seinen eigenen Vor- und Nachteilen. Die elektrische Stimulation beinhaltet eine umfangreiche Operation, bei der Elektroden in eine bestimmte Hirnregion implantiert werden, die später verwendet werden, um elektrische Signale zu übertragen, um eine zielgerichtete Hirnregion zu modulieren. Dieser Ansatz fehlt jedoch sowohl der zellulären als auch der Schaltungssspezifität. Optogenetik beinhaltet die Lieferung von viralen Partikeln, die einen Licht-aktivierten Rezeptor kodieren, der durch einen Laser stimuliert wird, der durch eine implantierte optische Faser emittiert wird, aber umfangreiche Manipulationen, hohe Kosten und komplexe Operationen erfordert11. Chemogenetik beinhaltet die Abgabe von Viruspartikeln, die einen Designerrezeptor kodieren, der ausschließlich durch Designermedikamente oder DREADDs aktiviert wird, die anschließend durch einen spezifischen und biologisch inerten Liganden, bekannt als Clozapin-N-Oxid (CNO)12, aktiviert werden. . Der Vorteil der Verwendung von DREADDs zur Manipulation lokaler neuronaler Schaltkreise, die erwachsene NSCs regulieren, liegt in der Leichtigkeit und den verschiedenen Wegen der CNO-Administration. Dies ermöglicht einen weniger zeitaufwändigen Ansatz mit reduzierter Tierhandhabung, der für Langzeitstudien leicht anpassungsfähig ist, um neuronale Schaltkreise zu modulieren.
Der in diesem Protokoll beschriebene Ansatz ist eine umfassende Sammlung verschiedener Protokolle, die erforderlich sind, um die Schaltkreisregulierung der erwachsenen Hippocampus-Neurogenese erfolgreich abzuhören, die sowohl Immunfluoreszenztechniken als auch Schaltungsmanipulationen kombiniert. Chemogenetik. Die im folgenden Protokoll beschriebene Methode eignet sich zur Stimulierung oder Hemmung eines oder mehrerer Schaltkreise gleichzeitig in vivo, um ihre regulatorische Funktion auf die adulte Neurogenese zu bestimmen. Dieser Ansatz wird am besten verwendet, wenn die Frage nicht ein hohes Maß an zeitlicher Auflösung benötigt. Fragen, die eine präzise zeitliche Kontrolle der Stimulation/Hemmung bei einer bestimmten Frequenz erfordern, können besser mit der Optogenetik13,14behandelt werden. Der hier beschriebene Ansatz ist leicht für Langzeitstudien mit minimalem Umgang mit Tieren geeignet, insbesondere dort, wo Stress ein großes Anliegen ist.

<table><tbody><tr><td>24-Well-Platte</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>07-200-84</td><td></td></tr><tr><td>48-Well-Platte</td><td>Denville Scientific</td><td>T1049</td><td></td></tr><tr><td>5-Ethinyl-2'-Desoxyuridin (Edu)</td><td>Carbosynth</td><td>NE08701</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol 70% Isopropyl</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol-Vorbereitungspads</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-680-63</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-488 Azid</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10266</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Hühner-Thermometer</td><td>für</td><td>NES; RRID: AB_2314882</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ziegen DCX</td><td>Santa Cruz</td><td>Kat# SC_8066; RRID: AB_2088494</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus TBR2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-4875-82; RRID: AB_11042577</td><td></td></tr><tr><td>Betadin-Lösung (Povidon-Jod)</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Citirinsäure Stock [.1M] Zitronensäure (21 g/l Zitronensäure)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>251275</td><td></td></tr><tr><td>Clozapin N-Oxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C08352-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Konfokale Software (Zen Schwarz)</td><td>Zeiss Mikroskopie</td><td>Zen 2.3 SP1 FP1 (schwarz)</td><td></td></tr><tr><td>Kupfer (II) Sulfat Pentahydrate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AC197722500</td><td></td></tr><tr><td>Wattestäbchen</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deckglas</td><td>Denville Scientific</td><td>M1100-02</td><td></td></tr><tr><td>Delicate Task Wipe Kimwipes</td><td>Kimtech Science</td><td>7557</td><td></td></tr><tr><td>Bohrer 0,5 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>19007-05</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenglykol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>E178-1</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Nadel 2 Zoll</td><td>Hmailton Company</td><td>7803-05</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Spritze 5 &mu; L Modell 75 RN</td><td>Hmailton Company</td><td>Ref: 87931</td><td></td></tr><tr><td>Hochgeschwindigkeitsbohrer</td><td>Foredom</td><td>1474</td><td></td></tr><tr><td>Infusionspumpe</td><td>Harvard Apparat</td><td>70-4511</td><td></td></tr><tr><td>Injizierbare Kochsalzlösung</td><td>Mountainside Health Care</td><td>NDC 0409-4888-20</td><td></td></tr><tr><td>Insulinspritze</td><td>BD Ultrafeine Insulinspritzen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Henry Schein</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>Stereotax für Kleintiere</td><td>KOPF Instrumente</td><td>Modell 942</td><td></td></tr><tr><td>Leica M80</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Mikrotom</td><td>Leica</td><td>SM2010 R</td><td></td></tr><tr><td>LSM 780</td><td>Zeiss Mikroskopie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nair (Haarentfernungsprodukt)</td><td>Nair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldahyde 4%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>158127</tr><tr><td>Plus geladener Objektträger</td><td>Denville Scientific</td><td>M1021</td><td></td></tr><tr><td>Phosphat-gepufferte Lösung (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>Puralube Vet Salbe</td><td>Puralube</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slide Rack 20 Objektträgereinheit</td><td>Elektronenmikroskopie Science</td><td>70312-24</td><td></td></tr><tr><td>Objektträgerhalter</td><td>Elektronenmikroskopie Science</td><td>70312-25</td><td></td></tr><tr><td>Heizkissen für Kleintiere</td><td>K& H</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Super PAP Pen 4 mm Spitze</td><td>PolySciences</td><td>24230</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgisches Skalpell</td><td>MedPride</td><td>47121</td><td></td></tr><tr><td>Tris gepufferte Lösung (TBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5912</td><td></td></tr><tr><td>Trinatriumcitrat Lager [0,1 M] Trinatriumcitrat (29,4 g/L Trinatriumcitrat)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8532</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vet Bond Gewebekleber</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr></tbody></table>

assaying circuit spezifische regulation von adulthippocampal neuralen vorläuferzellen

Assaying Circuit Specific Regulation of Adult Hippocampal Neural Precursor Cells

Die adulte Neurogenese ist ein dynamischer Prozess, bei dem neu aktivierte neuronale Stammzellen (NSCs) in der subgranularen Zone (SGZ) des Dentatgyrus (DG) neue Neuronen erzeugen, die sich in einen bestehenden neuronalen Kreislauf integrieren und zu spezifischen Hippocampusfunktionen beitragen. . Wichtig ist, dass die adulte Neurogenese sehr anfällig für Umweltreize ist, die eine aktivitätsabhängige Regulierung verschiedener kognitiver Funktionen ermöglichen. Eine breite Palette von neuronalen Schaltkreisen aus verschiedenen Gehirnregionen orchestriert diese komplexen kognitiven Funktionen. Es ist daher wichtig zu verstehen, wie bestimmte neuronale Schaltkreise die Adult Neurogenese regulieren. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Manipulation der Aktivität neuronaler Schaltkreise mit Designerrezeptoren, die ausschließlich durch Designer-Medikamente (DREADDs) Technologie aktiviert werden, die NSCs und neugeborene Nachkommen bei Nagetieren reguliert. Dieses umfassende Protokoll umfasst die stereotaxic-Injektion von Viruspartikeln, die chemogenetische Stimulation bestimmter neuronaler Schaltkreise, die analoge Verabreichung von Thymidin, die Gewebeverarbeitung, die Immunfluoreszenzkennzeichnung, die konfokale Bildgebung und die Bildgebung. Analyse verschiedener Stadien neuronaler Vorläuferzellen. Dieses Protokoll enthält detaillierte Anweisungen zu Antigen-Retrieval-Techniken zur Visualisierung von NSCs und deren Nachkommen und beschreibt eine einfache, aber effektive Möglichkeit, Gehirnkreise mit Clozapin-N-Oxid (CNO) oder CNO-haltigem Trinkwasser zu modulieren und DREADDs-exzierende Viren. Die Stärke dieses Protokolls liegt in seiner Anpassungsfähigkeit, eine Vielzahl von neuronalen Schaltkreisen zu untersuchen, die die von NSCs abgeleitete Adult Neurogenese beeinflussen.

Nach den oben beschriebenen experimentellen Verfahren (Abbildung 1A,B) konnten wir die Auswirkungen der Stimulierung kontralateraler Mooszellprojektionen auf die neurogene Nische innerhalb des Hippocampus bestimmen. Durch die Verwendung eines cre-abhängigen Gq-gekoppelten stimulierenden DREADD-Virus gepaart mit einer moosigen Zelle mit der Bezeichnung 5-HT2A Cre-line konnten wir selektiv exzitatorische Projektionen von moosigen Zellen auf die kontralaterale DG aktivieren und...

Das Ziel dieses Protokolls ist es, einen Ansatz zur Analyse des Verhaltens von adulten neuronalen Stamm-/Vorläuferzellen als Reaktion auf die chemogenetische Manipulation eines bestimmten lokalen neuronalen Schaltkreises zu beschreiben.

Assaying Circuit Spezifische Regulation von adulthippocampal neuralen Vorläuferzellen

Adult neurogenesis is a dynamic process by which newly activated neural stem cells (NSCs) in the subgranular zone (SGZ) of the dentate gyrus (DG) generate ...

Dieses Protokoll kann beantworten, wie verschiedene Schaltkreise im Gehirn die adulte Neurogenese regulieren und insbesondere, wie stimulierende oder hemmende neuronale Schaltkreise die Proliferation adulter neuronaler Stammzellen beeinflussen. Der Vorteil dieser Technik ist, dass sie in der Lage ist, gezielt gewünschte neuronale Schaltkreise anzusprechen und die Belastung der Tiere zu reduzieren. Diese Methode kann Einen einblick in die Art und Weise geben, wie verschiedene Gehirnkreise die Adult Neurogenese regulieren, insbesondere, wie bestimmte Zelltypen, die bestimmte Neurotransmitter freisetzen, die Proliferation adulter neuronaler Stammzellen regulieren.Um dieses Verfahren zu beginnen, legen Sie die Gewebeabschnitte in PBS und montieren Sie fünf bis acht Abschnitte auf einem positiv geladenen Dia in serieller Reihenfolge von vorder nach hinten. Lassen Sie die Gewebeabschnitte bei Raumtemperatur für zwei bis fünf Minuten trocknen und halten Sie sich vollständig an den Dias. Bereiten Sie als Nächstes den Citratpuffer in einem Container vor.Den Citratpuffer in einer Mikrowelle fünf Minuten erhitzen, bis die Lösung kocht. In der Zwischenzeit die montierten Abschnitte in einen Gl

assaying-circuit-specific-regulation-adult-hippocampal-neural

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Neurale Stammzellen wurden aus dem Hippocampus von erwachsenen, nicht überwinternde einjährige Arctic Erdhörnchen (AGS) aufgestellt. Diese neuralen Stammzellen können durch zahlreiche Passagen erweitert werden, differenziert und gepflegt wie ein fast 50:50 Neuron zu Gliazellen Kultur.

Wachstum und Differenzierung von adulten Hippocampus Arctic Ground Squirrel Neural Stem Cells

Dieses Video zeigt das Verfahren zum Färben neu proliferierter neuraler Stammzellen in Hirngewebeschnitten mittels EdU-Inkorporation, gefolgt von Immunfluoreszenz zur Visualisierung spezifischer Proteine, was das Verständnis der Zelldynamik und -proliferation verbessert.

Immunfluoreszenzfärbung zur Visualisierung proliferierter neuraler Stammzellen in Hirnschnitten von Mäusen

Während der adulten Hippocampus-Neurogenese wird ein bestimmter Satz genetischer Marker exprimiert, wenn eine ruhende neurale Stammzelle nacheinander fortschreitet und sich zu einem funktionell integrierten Neuron im Schaltkreis entwickelt. Mittels hitzeinduzierter Antigengewinnung werden Vorläuferzelltypen, die sonst schwer zu detektieren sind, mit verbesserter Wirksamkeit identifiziert.

Hitzeinduzierte Antigengewinnung: Eine effektive Methode zum Nachweis und zur Identifizierung von Vorläuferzelltypen während der adulten Hippocampus-Neurogenese

Hier beschreiben wir eine detaillierte Protokoll für die gleichzeitige Erzeugung von neuralen Vorläuferzellkulturen, entweder als Mono-oder haftNeuroSphären, aus der Subventrikularzone und Gyrus dentatus der einzelnen erwachsenen Mäusen.

Eine Maus, zwei Kulturen: Isolierung und Kultur von adulten neuralen Stammzellen aus dem Zwei Neurogene Zonen der einzelnen Mäuse

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das ein Werkzeug zur Untersuchung der Regulationsmechanismen bestimmter Gene während der Hippocampus-Entwicklung bietet. Der Einsatz von Ex-utero-Elektroporation und organotypischer Schnittkultur ermöglicht die Hoch- und Herunterregulierung der Expression von Genen von Interesse in einzelnen Zellen und die Verfolgung ihres Schicksals während der Entwicklung.

Ex Utero Elektroporation und Organotypischen Kultur der Maus Hippocampus-Gewebe

Dieser Videoartikel veranschaulicht ein umfassendes Protokoll zum Nachweis und zur Quantifizierung aller Stadien der adulten Hippocampus-Neurogenese innerhalb desselben Gewebeabschnitts. Wir haben eine Methode entwickelt, um die Einschränkungen der indirekten multiplen Immunfluoreszenz zu überwinden, die entstehen, wenn geeignete Antikörper von verschiedenen Wirtsspezies nicht verfügbar sind.

Immunhistochemie und Multiple Markierung mit Antikörper aus dem gleichen Host Arten, die Adult Neurogenese Studieren

Wir berichten über eine auf Fluoreszenz aktivierte Zellsortierung (FACS) basierende Methode, um neurale Stammzellen (NSCs) und ihre Nachkommen aus der subventrikulären Zone (SVZ) des adulten Mäusegehirns zu isolieren. Angewendet auf FUCCI-transgene Mäuse (Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator) ermöglicht es die Untersuchung des Zellzyklusverlaufs durch Live-Bildgebung.

Zellsortierung von Neural Stamm- und Vorläuferzellen aus dem erwachsenen Maus Subventrikularzone und Live-Bildgebung ihrer Zellzyklus Dynamics

Der Eckzahn Gehirn ist ein wertvolles Modell, bei dem die adulte Neurogenese zu studieren. Präsentiert hier sind Protokolle zur Isolierung und erweitert erwachsenen Hunde-Hippocampus-neuralen Vorläuferzellen aus primären Hirngewebe.

Isolierung und Expansion von adulten Canine Hippocampus Neural Precursors

Die Kryoschnitt-Dissektion ermöglicht die frische, gefrorene Vorbereitung der größten neurogenen Nische im murinen Gehirn für eine tiefe quantitative Proteomanalyse. Die Methode ist präzise, effizient und verursacht minimale Gewebestörungen. Daher eignet es sich ideal für die Untersuchung der molekularen Mikroumgebung dieser Nische sowie anderer Organe, Regionen und Arten.

Kryoschnitt-Dissektion der adulten subependymalen Zone für genaue und tiefe quantitative Proteomanalyse

Hier wird eine Methode zur Sequenzierung einzelner Kerne, die aus dem Gyrus dentatus der Maus isoliert wurden, vorgestellt, die die meisten Neuronen durch Fluoreszenz-aktivierte Kerne (FAN)-Sortierung ausschließt. Dieser Ansatz generiert qualitativ hochwertige Expressionsprofile und erleichtert die Untersuchung der meisten anderen Zelltypen, die in der Nische vertreten sind, einschließlich seltener Populationen wie neuraler Stammzellen.

Fluoreszenzaktivierte Kerne negative Sortierung von Neuronen kombiniert mit Einzelkern-RNA-Sequenzierung zur Untersuchung der neurogenen Hippocampus-Nische

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Entwicklung chemisch umprogrammierter Stammzellen, um eine präzise neuronale Modulation zu erreichen, indem diese Zellen in dopaminerge Vorläuferzellen differenziert, in Mausmodelle der Parkinson-Krankheit transplantiert und verhaltensbezogene und elektrophysiologische Ergebnisse ausgewertet werden, um die erfolgreiche Integration und funktionelle Wirksamkeit der transplantierten Zellen zu bestätigen.

Chemogenetische Regulation in reprogrammierten Stammzell-abgeleiteten Vorläuferzellen bei der Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen

Erfahren Sie, wie chemogenetische Manipulation neuronaler Schaltkreise die Proliferation adulter neuraler Stammzellen im Hippocampus reguliert. Diese Methode ermöglicht präzise Untersuchungen zur Neurogenese im erwachsenen Gehirn.

Assaying Circuit Spezifische Regulation von adulthippocampal neuralen Vorläuferzellen

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