Name: Lentivirale Vektor-Plattform für die effiziente Bereitstellung von Epigenom-editing-Tools in menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet Krankheitsmodelle (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-29T14:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: Lernen Sie die Produktion und Anwendung von lentiviralen Vektoren für Epigenom-Editing mit CRISPR-dCas9-DNMT3A in hiPSC-abgeleiteten Neuronen. Diese Methode ermöglicht präzise Genexpressionsregulierung für neurologische Forschung.

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Diese Arbeit wurde teilweise von den Kahn Neurotechnologie Development Award (für OC) und die nationalen Institute der Gesundheit/National Institute of Neurological Disorders und Schlaganfall (NIH/NINDS) finanziert (R01 NS085011, OC).

<ol><li>Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+applications+of+CRISPR-Cas9+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering.</a> Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).</li>
<li>Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZFN%2C+TALEN%2C+and+CRISPR%2FCas-based+methods+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering.</a> Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).</li>
<li>Thakore, P. I., Black, J. B., Hilton, I. B., Gersbach, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Editing+the+epigenome%3A+technologies+for+programmable+transcription+and+epigenetic+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Editing the epigenome: technologies for programmable transcription and epigenetic modulation.</a> Nature Methods. 13 (2), 127-137 (2016).</li>
<li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-mediated+modular+RNA-guided+regulation+of+transcription+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes.</a> Cell. 154 (2), 442-451 (2013).</li>
<li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Scale+CRISPR-Mediated+Control+of+Gene+Repression+and+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-Scale CRISPR-Mediated Control of Gene Repression and Activation.</a> Cell. 159 (3), 647-661 (2014).</li>
<li>Perez-Pinera, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+gene+activation+by+CRISPR-Cas9-based+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors.</a> Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).</li>
<li>Chavez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+Cas9-mediated+transcriptional+programming%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming.</a> Nature Methods. 12 (4), 326-328 (2015).</li>
<li>Horlbeck, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosomes+impede+Cas9+access+to+DNA+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Nucleosomes impede Cas9 access to DNA in vivo and in vitro.</a> eLife. 5, (2016).</li>
<li>Chavez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Cas9+activators+in+multiple+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of Cas9 activators in multiple species.</a> Nature Methods. 13 (7), 563-567 (2016).</li>
<li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+simultaneous+transcriptional+activation+of+multiple+genes+in+the+brain+using+CRISPR-dCas9-activator+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice.</a> Nature Neuroscience. 21 (3), 440-446 (2018).</li>
<li>Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protein-tagging+system+for+signal+amplification+in+gene+expression+and+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging.</a> Cell. 159 (3), 635-646 (2014).</li>
<li>Konermann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+transcriptional+activation+by+an+engineered+CRISPR-Cas9+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex.</a> Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).</li>
<li>Holtzman, L., Gersbach, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Editing+the+Epigenome%3A+Reshaping+the+Genomic+Landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genomics+and+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Editing the Epigenome: Reshaping the Genomic Landscape.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. , (2018).</li>
<li>Perez-Pinera, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+and+tunable+human+gene+activation+by+combinations+of+synthetic+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Synergistic and tunable human gene activation by combinations of synthetic transcription factors.</a> Nature Methods. 10 (3), 239-242 (2013).</li>
<li>Thakore, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+specific+epigenome+editing+by+CRISPR-Cas9+repressors+for+silencing+of+distal+regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly specific epigenome editing by CRISPR-Cas9 repressors for silencing of distal regulatory elements.</a> Nature Methods. 12 (12), 1143-1149 (2015).</li>
<li>Amabile, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inheritable+Silencing+of+Endogenous+Genes+by+Hit-and-Run+Targeted+Epigenetic+Editing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Inheritable Silencing of Endogenous Genes by Hit-and-Run Targeted Epigenetic Editing.</a> Cell. 167 (1), 219-232 (2016).</li>
<li>Liu, X. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Editing+DNA+Methylation+in+the+Mammalian+Genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Editing DNA Methylation in the Mammalian Genome.</a> Cell. 167 (1), 233-247 (2016).</li>
<li>McDonald, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogrammable+CRISPR%2FCas9-based+system+for+inducing+site-specific+DNA+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Reprogrammable CRISPR/Cas9-based system for inducing site-specific DNA methylation.</a> Biology Open. 5 (6), 866-874 (2016).</li>
<li>Huang, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+epigenome+editing+using+CRISPR-Cas+SunTag-directed+DNMT3A%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA epigenome editing using CRISPR-Cas SunTag-directed DNMT3A.</a> Genome Biology. 18 (1), 176(2017).</li>
<li>Vojta, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repurposing+the+CRISPR-Cas9+system+for+targeted+DNA+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Repurposing the CRISPR-Cas9 system for targeted DNA methylation.</a> Nucleic Acids Research. 44 (12), 5615-5628 (2016).</li>
<li>Razin, A., Kantor, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+in+epigenetic+control+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Molecular+and+Subcellular+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA methylation in epigenetic control of gene expression.</a> Progress in Molecular and Subcellular Biology. 38, 151-167 (2005).</li>
<li>Kantor, B., Ma, H., Webster-Cyriaque, J., Monahan, P. E., Kafri, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+activation+of+unintegrated+HIV-1+genomes+by+gut-associated+short+chain+fatty+acids+and+its+implications+for+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Epigenetic activation of unintegrated HIV-1 genomes by gut-associated short chain fatty acids and its implications for HIV infection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (44), 18786-18791 (2009).</li>
<li>Kantor, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downregulation+of+SNCA+Expression+by+Targeted+Editing+of+DNA+Methylation%3A+A+Potential+Strategy+for+Precision+Therapy+in+PD%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Downregulation of SNCA Expression by Targeted Editing of DNA Methylation: A Potential Strategy for Precision Therapy in PD.</a> Molecular Therapy. , (2018).</li>
<li>Jowaed, A., Schmitt, I., Kaut, O., Wullner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylation+regulates+alpha-synuclein+expression+and+is+decreased+in+Parkinson%27s+disease+patients%27+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Methylation regulates alpha-synuclein expression and is decreased in Parkinson's disease patients' brains.</a> Journal of Neuroscience. 30 (18), 6355-6359 (2010).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA+methyltransferase+inhibitor%2C+5-aza-2%27-deoxycytidine%2C+exacerbates+neurotoxicity+and+upregulates+Parkinson%27s+disease-related+genes+in+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22CNS+Neuroscience+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">A DNA methyltransferase inhibitor, 5-aza-2'-deoxycytidine, exacerbates neurotoxicity and upregulates Parkinson's disease-related genes in dopaminergic neurons.</a> CNS Neuroscience & Therapeutics. 19 (3), 183-190 (2013).</li>
<li>Matsumoto, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CpG+demethylation+enhances+alpha-synuclein+expression+and+affects+the+pathogenesis+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">CpG demethylation enhances alpha-synuclein expression and affects the pathogenesis of Parkinson's disease.</a> PLOS One. 5 (11), e15522(2010).</li>
<li>Desplats, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+sequesters+Dnmt1+from+the+nucleus%3A+a+novel+mechanism+for+epigenetic+alterations+in+Lewy+body+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein sequesters Dnmt1 from the nucleus: a novel mechanism for epigenetic alterations in Lewy body diseases.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (11), 9031-9037 (2011).</li>
<li>Ai, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypomethylation+of+SNCA+in+blood+of+patients+with+sporadic+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Neurological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Hypomethylation of SNCA in blood of patients with sporadic Parkinson's disease.</a> Journal of the Neurological Sciences. 337 (1-2), 123-128 (2014).</li>
<li>Tagliafierro, L., Chiba-Falek, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up-regulation+of+SNCA+gene+expression%3A+implications+to+synucleinopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogenetics%22%5BJournal%5D)">Up-regulation of SNCA gene expression: implications to synucleinopathies.</a> Neurogenetics. 17 (3), 145-157 (2016).</li>
<li>Ortinski, P. I., O’Donovan, B., Dong, X., Kantor, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrase-Deficient+Lentiviral+Vector+as+an+All-in-One+Platform+for+Highly+Efficient+CRISPR%2FCas9-Mediated+Gene+Editing%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Integrase-Deficient Lentiviral Vector as an All-in-One Platform for Highly Efficient CRISPR/Cas9-Mediated Gene Editing.</a> Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 5, 153-164 (2017).</li>
<li>Tagliafierro, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+alpha-synuclein+3%27+untranslated+region+and+its+corresponding+microRNAs+in+relation+to+Parkinson%27s+disease+compared+to+dementia+with+Lewy+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimer%E2%80%99s+%26+Dementia%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of alpha-synuclein 3' untranslated region and its corresponding microRNAs in relation to Parkinson's disease compared to dementia with Lewy bodies.</a> Alzheimer’s & Dementia. 13 (11), 1237-1250 (2017).</li>
<li>Tagliafierro, L., Zamora, M. E., Chiba-Falek, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplication+of+the+SNCA+locus+exacerbates+neuronal+nuclear+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Multiplication of the SNCA locus exacerbates neuronal nuclear aging.</a> Human Molecular Genetics. , (2018).</li>
<li>Kantor, B., McCown, T., Leone, P., Gray, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+applications+involving+CNS+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Clinical applications involving CNS gene transfer.</a> Advances in Genetics. 87, 71-124 (2014).</li>
<li>Kantor, B., Bailey, R. M., Wimberly, K., Kalburgi, S. N., Gray, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+gene+transfer+to+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Methods for gene transfer to the central nervous system.</a> Advances in Genetics. 87, 125-197 (2014).</li>
<li>Vijayraghavan, S., Kantor, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Protocol+for+the+Production+of+Integrase-deficient+Lentiviral+Vectors+for+CRISPR%2FCas9-mediated+Gene+Knockout+in+Dividing+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (130), e56915(2017).</li>
<li>Bayer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large+U3+deletion+causes+increased+in+vivo+expression+from+a+nonintegrating+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">A large U3 deletion causes increased in vivo expression from a nonintegrating lentiviral vector.</a> Molecular Therapy. 16 (12), 1968-1976 (2008).</li>
<li>Bassil, C. F., Huang, Z., Murphy, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisulfite+pyrosequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Bisulfite pyrosequencing.</a> Methods in Molecular Biology. 1049, 95-107 (2013).</li>
<li>Truong, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+intein-mediated+split-Cas9+system+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Development of an intein-mediated split-Cas9 system for gene therapy.</a> Nucleic Acids Research. 43 (13), 6450-6458 (2015).</li>
<li>Nishimasu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+Structure+of+Staphylococcus+aureus+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Crystal Structure of Staphylococcus aureus Cas9.</a> Cell. 162 (5), 1113-1126 (2015).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome+editing+using+Staphylococcus+aureus+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9.</a> Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).</li>
<li>Van Lint, C., Ghysdael, J., Paras, P., Burny, A., Verdin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcriptional+regulatory+element+is+associated+with+a+nuclease-hypersensitive+site+in+the+pol+gene+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">A transcriptional regulatory element is associated with a nuclease-hypersensitive site in the pol gene of human immunodeficiency virus type 1.</a> Journal of Virology. 68 (4), 2632-2648 (1994).</li>
<li>Van Lint, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+binding+sites+downstream+of+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+transcription+start+site+are+important+for+virus+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Transcription factor binding sites downstream of the human immunodeficiency virus type 1 transcription start site are important for virus infectivity.</a> Journal of Virology. 71 (8), 6113-6127 (1997).</li>
<li>Goffin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+binding+sites+in+the+pol+gene+intragenic+regulatory+region+of+HIV-1+are+important+for+virus+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Transcription factor binding sites in the pol gene intragenic regulatory region of HIV-1 are important for virus infectivity.</a> Nucleic Acids Research. 33 (13), 4285-4310 (2005).</li>
<li>Kim, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+zinc+finger+fusions+targeting+Sp1-binding+sites+and+the+trans-activator-responsive+element+potently+repress+transcription+and+replication+of+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Artificial zinc finger fusions targeting Sp1-binding sites and the trans-activator-responsive element potently repress transcription and replication of HIV-1.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (22), 21545-21552 (2005).</li>
<li>Kantor, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notable+reduction+in+illegitimate+integration+mediated+by+a+PPT-deleted%2C+nonintegrating+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Notable reduction in illegitimate integration mediated by a PPT-deleted, nonintegrating lentiviral vector.</a> Molecular Therapy. 19 (3), 547-556 (2011).</li>
</ol>

Duke University reichte eine provisorische Patentanmeldung im Zusammenhang mit dieser Studie.

LVs haben damit begonnen, als das Fahrzeug der Wahl für das Epigenom bearbeiten, vor allem im Zusammenhang mit genetischen Erkrankungen entstehen, vor allem wegen ihrer Fähigkeit, (i) Platz für große DNA-Nutzlasten und (Ii) effizient transduzieren eine Vielzahl von Teilen und nondividing Zellen. Die große Verpackung Wirksamkeit der LVs ist besonders vorteilhaft für die Anwendungen, bei denen Verpackung der CRISPR/dCas9-Systeme, die übergroß sind. Aus dieser Perspektive stellen LVs die Plattform der Wahl für die Lieferung...

Mehreren Epigenom-editing-Plattformen wurden vor kurzem entwickelt, um jede DNA-Sequenzen in den Regionen abzielen, die gen-Expression-1,-2zu kontrollieren. Die erstellten Epigenom-editing-Tools sollen (i) Transkription regulieren, (Ii) Änderungen posttranslationale Histon-Modifikationen, (Iii) ändern DNA-Methylierung und (iv) modulieren regulatorisches Element Interaktionen. Der Ansatz, die Transkription/Chromatin-Modifizierer auf eine deaktivierte (tot) Cas9 zu verankern (dCas9) von zuvor entwickelten Epigenom-editing-Plattformen, z. B. Zink angehoben finger Proteine (ZFPs) und Transkription Aktivator-ähnlichen Effektoren (Geschichten) beherbergen eine potente transkriptionelle Effektor-Domäne verschmolzen (ED) mit der gestalteten DNA-bindende Domäne (DBD)3. Die Ergebnisse der gewünschten Phänotyp wie Aktivierung oder Unterdrückung zeichnet sich durch die Effektor-Molekül an der endogenen Loci (Abbildung 1) verankert. Um programmierbare transcriptional Aktivatoren zu erstellen, sind dCas9/gRNA Module mit VP164,5,6 (Abbildung 1A), einer viralen Aktivierungsdomäne verknüpft, die Pol-II und die allgemeine Transkriptionsmaschinerie rekrutiert. Die Änderung dieses Systems hat VP64, ein Tetramer VP16 Domains, bietet eine noch robustere Aktivierung Rate5,6enthalten. Das System wurde erfolgreich eingesetzt, um Codierung und nichtkodierende Regionen zu aktivieren, indem Sie auf Förderer und regulatorischen Elemente. Wichtig ist, auch wenn VP64 Moleküle der Chromatinstruktur in der Zielregion nicht direkt ändern, es Rekruten Chromatin-Modifikatoren, die Ergebnisse im Ablagerung der aktiven (Euchromatin) Marken, unter anderem als H3/H4 Acetylierung und H3-K4 di binden / Tri-Methylierung5,6. Neben VP64 hat der p65-Untereinheit des menschlichen NF-κB-Komplexes zur dCas9/gRNA Modul7angebunden worden. Interessanterweise führt die Anbindehaltung von diese Effektoren für die Regionen stromaufwärts der Transkription Start Seiten (TSK) und innerhalb von Promotoren einen starken gen Induktion. Dennoch können VP64 und p65 Effektoren auch die activatory Wirkungen ausüben, während der Verbindung mit den Regionen flussabwärts von TSK und am distalen Geschmacksverstärker7,8. Eine robustere transcriptional Antwort zu entlocken, müssen mehrere dCas9-VP64 oder dCas9-p65 Fusionen in ein einzelnes Ziel Locus9,10eingestellt werden. So führte die jüngste Entwicklung der nächsten Generation Aktivatoren, die mehrere Effektor Domains durch einen einzigen dCas9-gRNA Komplex, wie SunTag, rekrutieren eine stärkere Aktivierung Fähigkeit im Vergleich zu dCas9-VP64 Fusion Kollegen11 , 12. eine verbesserte transkriptionelle Aktivierung erzielt wurde, durch die Verschmelzung von VP64, p65 und Rta (VPR), einer Domäne werden von Gamma-Herpesviren an den C-Terminus des dCas913 (Abb. 1A). Ähnliche CRISPR/dCas9-Systeme wurden für Target-spezifische Unterdrückung (Abbildung 1 b) entwickelt.
Endogenen gen Unterdrückung kann mit veränderter Repressor Fusionen durch eine Vielzahl von Mechanismen (Abbildung 1 b) erreicht werden. Es hat sich gezeigt, dass CRISPR/dCas9 Systeme, verbunden mit der Repressor DBD (auch ohne ein Effektor-Domäne/s), effizient Genexpression während angebunden, um einen Promotor oder upstream/downstream-TSS Regionen3,6 Schweigen kann ,14. Die Auswirkungen auf die Transkription wird durch die sterische Einmischung der Transkription Faktor Bindung und RNA-Polymerase Verarbeitung verursacht. Dennoch sind umfassendere Ansätze notwendig, da gen Unterdrückung durch sterische Behinderung allein oft nicht ausreicht für robuste zum Schweigen zu bringen. Die jüngste Entwicklung der nächsten Generation von Schalldämpfern auf Basis CRISPR/dCas9 Systeme tragen transkriptioneller Repressor Domänen (TRDs), Histon Modifikatoren (H3-K9 - di / Tri-Methylierung, H3-K27 di-/ Tri-Methylierung; H3-K36 di-/ Tri-Methylierung, H3/H4 Deacetylation), und führte zum Bau von epigenetischen Tools ermöglicht stabilere Effekte4,5,15,16, zum Schweigen zu bringen (CpG) DNA-Methylierung 17,18,19,20. Es wurde nachgewiesen, dass die Rekrutierung von diese epigenetischen Modifikatoren der DNA führen zur Bildung von mehr geschlossen und verkürzte Chromatin, die in der Regel ein potenter Stummschaltungs-Ergebnis21,22erzeugen. Die am häufigsten Stummschaltungs-Domäne mit DBDs verwendet ist der Krüppel-assoziierten Box (Krabbe)4,5. Die Einstellung des Faktors nachgewiesen Chromatin Änderungen entsprechen; Allerdings sind die Mechanismen dieser Modifikationen noch aufgeklärt16,17,18sein. Vor kurzem hat sich gezeigt, dass die Lokalisierung von KRAB DNA die Montage von Histon-Methyltransferase SETDB1 und die Histon Deacetylation (HDAC) NuRD-komplexe fördern kann, die Möglichkeit, die diese Interaktionen die Bildung von vermitteln Chromatin-Kondensation und transcriptional silencing3,13. Als ein alternativer Ansatz können Effektor Domänen, DBDs, erstellen Sie eine benutzerdefinierte epigenetische silencing Protein fusioniert werden. Dieses System katalysiert direkt repressive DNA-Spuren oder Histon-Modifikationen.
Vor kurzem hat die Verwendung von synthetischen CRISPR/dCas9-Systeme angebunden an das Enzym DNMT3A transkriptionelle Deaktivierung zweckentfremdet worden. DNMT3A katalysiert DNA-Methylierung, die transkriptionelle Repression während der Bildung von Heterochromatin auf endogene gen Promotoren und anderen regulatorischen Regionen (Abbildung 1 b)18,20ausübt. McDonald Et Al.18 und Vojta Et Al.20 waren die ersten Autoren berichten, dass DNA-Methylierung verwendet werden kann, für Epigenom-Gen-silencing oder Unterdrückung, nachzuweisen, dass das Plasmid geliefert dCas9-DNMT3A-Fusion-System potent verbessern können Cytosin Methylierung um die TSS-18,-20. McDonald und Kollegen gezeigt, dass die Beschäftigung der Strategie von einer signifikanten Reduktion (ca. 40 %) führen kann in einem Tumor-Suppressor-gen Level CDKN2A mRNA18. Ebenso zeigt das unmethylated Promotorregion BACH oder IL6ST Gene targeting erhöhter CpG Methylierung, die mit einem doppelten Rückgang der gen-Expression-20korreliert worden. Unser Labor hat vor kurzem die Verwendung von DNA-Methylierung für die pathologischen Ergebnisse der SNCA Überexpression (Abbildung 2)23mildernde umgewidmet. Die Strategie basiert auf selektiven Verstärkung in der DNA-Methylierung in der SNCA Intron 1 Region, wie es bereits berichtet wurde, zu hypomethyliert bei Morbus Parkinson und Demenz mit Lewy Körpern (DLB) Gehirn24,25, 26. Diese Hypomethylierung ist mit SNCA Überexpression, bietet somit ein attraktives Ziel für therapeutische Intervention24,27,28verbunden worden. Wir zeigten kürzlich einem niedrigen Niveau der DNA-Methylierung in der SNCA Intron 1 Region in HiPSC abgeleitet dopaminergen NPCs aus einem PD-Patienten mit der SNCA Verdreifachung23gewonnen. Der Vorteil dieser experimentellen Modells ist, dass die NPCs können robust in Kultur vermehrt oder weiter in Reife Neuronen ermöglichen eine effiziente Sortierung differenziert, genetische Faktoren zu identifizieren, die zelluläre Phänotypen, einschließlich oxidativen vermitteln Stress und Apoptose29. Darüber hinaus ermöglicht dieses Modellsystem Wissenschaftler, die entwicklungspolitische Ereignisse zu rekapitulieren, die vor dem Einsetzen der Symptome bei Patienten aufgetreten sind. Darüber hinaus vertreten HiPSC abgeleitet NPCs ein großartiges Werkzeug, um die zellulären und molekularen Wege zugeordnete Genexpression zu testen. Wichtig ist, können HiPSC abgeleitet NPCs in Kombination mit State-of-the-Art CRISPR/Cas9-Epigenom Technologie die Entwicklung der "Next-Generation-Drogen" für viele Neurodegenerative Erkrankungen erheblich erleichtern.
Um pathologische Verringerung der SNCA Ausdruck wir kürzlich entwickelt, ein Lentivirus basierendes System mit einem dCas9-DNMT3A Schmelzverfahren Protein und gRNA, speziell Ziel CpG Methylierung innerhalb der SNCA Intron 1 (Abbildung 2A)23. Dieses Protokoll wird Lentivirale Vektor (LV)-Design und Produktion im Detail beschreiben. LVs repräsentieren ein wirksames Mittel zur Bereitstellung von CRISPR/dCas9 Komponenten aus mehreren Gründen, nämlich (i) ihre Fähigkeit, sperrige DNA tragen einfügt, (Ii) einen hohen Wirkungsgrad von transducing eine Vielzahl von Zellen, einschließlich der trennende und nondividing Zellen30 , und (Iii) ihre Fähigkeit, minimale zytotoxische und immunogenen Reaktionen auslösen. Vor kurzem, wir das LV-System auf HiPSC abgeleitet dopaminergen Neuronen eines Patienten mit der Verdreifachung der SNCA Locus angewendet und demonstriert das therapeutische Potenzial von LVs für die Lieferung der Epigenom-Bearbeitung Methylierung Werkzeuge23 ( Abbildung 2 b). In der Tat bewirkt, dass eine LV-gRNA/dCas9-DNMT3A System eine deutliche Steigerung in der DNA-Methylierung bei der SNCA Intron 1 Region. Diese Erhöhung entspricht die Reduktion in der Höhe der SNCA mRNA und Protein23. Außerdem rettet SNCA Herabregulation PD-bezogene Phänotypen in der SNCA Verdreifachung/HiPSC-abgeleitete dopaminergen Neuronen (z. B. mitochondrialen ROS Produktion und Zelle Tragfähigkeit)23. Wichtig ist, haben wir bewiesen, dass der Rückgang der SNCA Ausdruck vom LV-gRNA-dCas9-DMNT3A-System ist in der Lage, die Umkehrung der Phänotypen, die charakteristisch sind für HiPSC abgeleitet dopaminergen Neuronen von einem PD-Patienten, die die durchgeführt SNCA Verdreifachung, z. B. mitochondrialen ROS Produktion und Zelle Lebensfähigkeit23. Das Ziel dieses Protokolls ist (1) das Protokoll der Produktion und Konzentration einer optimierten LV-Plattform für die Erzeugung von qualitativ tittered virale Vorbereitungen zu skizzieren und (2) die Differenzierung des HiPSCs in NPCs zu Reifen dopaminergen gemustert zu beschreiben Neuronen31,32 und die Charakterisierung der Methylierung Ebenen der gezielten Region innerhalb SNCA Intron 1.
Lentivirale Plattformen haben einen großen Vorteil über die beliebteste Plattform der Vektor, nämlich Adeno-assoziierten Vektoren (Flugabwehrpanzer), die das ehemalige Fähigkeit, größere genetische Einsätze33,34unterzubringen ist. Flugabwehrpanzer auf deutlich höhere Erträge generiert werden können, sondern besitzen eine niedrige Verpackungsleistung (< 4,8 kb), gefährden ihre Verwendung für die Bereitstellung von all-in-One CRISPR/Cas9 Systeme. So scheint es, dass die LVs die Plattform der Wahl in den Anwendungen an der Lieferung beteiligten CRISPR/dCas9 Werkzeuge wäre. Daher werden die hier beschriebene Protokoll ein wertvolles Werkzeug für die Forscher in dem Wunsch, effektiv Epigenom-Bearbeiten von Komponenten zu den Zellen und Organen liefern. Das Protokoll weiter skizziert die Strategie, um die Produktion und Ausdruck der Vektoren über eine Änderung in der GUS der Elemente innerhalb der Vektor Ausdruck Kassette30,35zu verbessern. Die Strategie basiert auf dem Roman System entwickelt und in unserem Labor untersucht und zeigt seine Fähigkeit auf virale Partikel im Bereich von 1010 virale Einheiten (VU) /mL30,35zu produzieren.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optima XPN-80 Ultrazentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>A99839</td><td></td></tr><tr><td>0,22 &mu; M Filtereinheit, 1 L</td><td>Corning</td><td>430513</td><td></td></tr><tr><td>0,45-&mu; m Filtereinheit, 500 mL</td><td>Corning</td><td>430773</td><td></td></tr><tr><td>100 mm TC-behandelte Kulturschale</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>konische Zentrifugenröhrchen</td><td>Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>150 mm TC-behandelte Zellkulturschalen mit 20 mm Grid</td><td>Corning</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>konischen Zentrifugenröhrchen</td><td>Corning</td><td>430291</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Platten</td> <td>CorningCorning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Aggrewell 800</td><td>StemCell Technologies</td><td>34811</td><td></td></tr><tr><td>Allegra 25R Tischzentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>369434</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS</td><td>Becton Dickinson</td><td>338960</td><td></td></tr><tr><td>Ultrazentrifugationsröhrchen mit konischem Boden</td><td>Seton Scientific</td><td>5067</td><td></td></tr><tr><td>Adapter für konische Röhrchen</td><td>Seton Scientific</td><td>PN 4230</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Cell Imaging Slides</td><td>Eppendorf</td><td>30742060</td><td></td></tr><tr><td>Hochbindende 96-Well-Platten</td><td>Corning</td><td>3366</td><td></td></tr><tr><td>Inverses Fluoreszenzmikroskop</td><td>Leica</td><td>DM IRB2</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Reversibles Sieb</td><td>StemCell Technologies</td><td>27215</td><td></td></tr><tr><td>SW32Ti Rotor</td><td>Beckman Schar</td><td>369650</td><td></td></tr><tr><td>VWR&reg; Serologische Einwegpipetten, Glas, pyrogenfrei</td><td>VWR</td><td>93000-694</td><td></td></tr><tr><td>VWR&reg; Vakuumfiltrationssysteme</td><td>VWR</td><td>89220-694</td><td></td></tr><tr><td>xMark&trade; Mikroplatten-Absorptionsplatten-Reader</td><td>Bio-Rad</td><td>1681150</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Zellkulturreagenzien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Menschliche embryonale Nierenzellen 293T (HEK 293T) ATCC</td><td></td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>StemCell Technologies</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Adhärenz-Spüllösung</td><td>StemCell Technologies</td><td>7010</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FOXA2-Antikörper</td><td>Abcam</td><td>Ab60721</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Nestin-Antikörper</td><td>Abcam</td><td>Ab18102</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotisch-antimykotische Lösung, 100x</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5955-100ML</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement (50x), minus Vitamin A</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>BES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B9879 - BES</td><td></td></tr><tr><td>Rinderalbuminfraktion V (7,5%ige Lösung)</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific 15260037</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>StemCell Technologies</td><td>72052</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel hESC-qualifizierte Matrix</td><td>Corning</td><td>08-774-552</td><td></td></tr><tr><td>Cosmic Calf Serum</td><td>Hyclone</td><td>SH30087.04</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Lonza</td><td>12-719</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, Medium mit hohem Glukosegehalt</td><td>Gibco</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy Blut & Tissue Kit</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>EpiTect PCR Control DNA Set</td><td>Qiagen</td><td>596945</td><td></td></tr><tr><td>EZ DNA Methylierungskit</td><td>Zymo Research</td><td>D5001</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1800-100G</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15750078</td><td></td></tr><tr><td>Reagenz für sanfte Zelldissoziation</td><td>stemCell Technologies</td><td>7174</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Human Recombinant bFGF</td><td>StemCell Technologies</td><td>78003</td><td></td></tr><tr><td>Human Recombinant&nbsp; EGF</td><td>StemCell Technologies</td><td>78006</td><td></td></tr><tr><td>Humane rekombinante Shh (C24II)</td><td>StemCell Technologies</td><td>78065</td><td></td></tr><tr><td>MEM Lösung für nicht-essentielle Aminosäuren (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>StemCell Technologies</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>N-2 Nahrungsergänzungsmittel (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502001</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasales Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>nicht-essentielle Aminosäure (NEAA)</td><td>Hyclone</td><td>SH30087.04</td><td></td></tr><tr><td>PyroMark PCR Kit</td><td>Qiagen</td><td>978703</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medien</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875-085</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>StemCell Technologies</td><td>72232</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8636-100ML</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff&nbsp; Neuronales Induktionsmedium</td><td>StemCell Technologies</td><td>5835</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff Neurales Vorläufer Gefriermedium</td><td>StemCell Technologies</td><td>5838</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Assay FOXA2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>hs00232764</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Assay GAPDH</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific hs99999905</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Assay Nestin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>hs04187831</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Assay OCT4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>HS04260367</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Assay PPIA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>HS99999904</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0,05 %</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>StemCell Technologies</td><td>72302<</td><td></td></tr><tr><td>strong>Name</td><td>Company</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>p24 ELISA-Reagenzien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monoklonales Anti-p24</td><td>Antikörper NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td><td>3537</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Kaninchen-Meerrettichperoxidase IgG</td><td>Sigma Aldrich</td><td>12-348</td><td>Arbeitsschwerpunkt 1:1500</td></tr><tr><td>Ziegenserum, steril, 10 mL</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td>Arbeitskonzentration 1:1000</td></tr><tr><td>HIV-1-Standards</td><td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td><td>SP968F</td><td></td></tr><tr><td>Normales Mausserum, steril, 500 mL</td><td>Equitech-Bio</td><td>SM30-0500</td><td></td></tr><tr><td>Polyklonales Kaninchen Anti-p24Antikörper</td><td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td><td>SP451T</td><td></td></tr><tr><td>TMB Peroxidase-Substrat</td><td>KPL</td><td>5120-0076</td><td>Arbeitskonzentration 1:10.000</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalognummer</td><td>><Kommentare</td></tr><tr><td>Plasmide</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12253</td><td></td></tr><tr><td>pRSV-Rev</td><td>Addgene</td><td>52961</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Unternehmen<</td><td>strong>Katalognummer</td><td><>Kommentare</td></tr><tr><td>Restriktionsenzyme</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BsmBI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0580S</td><td></td></tr><tr><td>BsrGI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0575S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRV</td><td>New England Biolabs</td><td>R0195S</td><td></td></tr><tr><td>KpnI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0142S</td><td></td></tr><tr><td>PacI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0547S</td><td></td></tr><tr><td>SphI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0182S</td><td></td></tr></tbody></table>

lentivirale vektor-plattform für die effiziente bereitstellung von epigenom-editing-tools in menschlichen induzierten pluripotenten stammzellen abgeleitet krankheitsmodelle

Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models

Die Verwendung von HiPSC abgeleitete Zellen stellt einen wertvollen Ansatz zur menschlichen neurodegenerativen Krankheiten zu studieren. Hier beschreiben wir ein optimiertes Protokoll für die Differenzierung von HiPSCs abgeleitet von einem Patienten mit der Parkinson-Krankheit (PD) die Verdreifachung der Alpha-Synuclein Gens (SNCA) Locus-relevanten dopaminergen neuronalen Populationen. Beweise sammeln hat gezeigt, dass hohe Konzentrationen von SNCA ursächlich für die Entwicklung der PD erkennen die ungedeckten neue therapeutische Ansätze für PD, vor allem die Ausrichtung auf die Regulierung der SNCA Ausdruck, schaffen müssen wir vor kurzem entwickelt ein CRISPR/dCas9-DNA-Methylierung-basiertes System zur epigenetisch modulieren SNCA Transkription durch Methylierung Ebenen auf der SNCA Intron 1 regulatorischen Region zu bereichern. Das System, bestehend aus einem Toten liefern (deaktiviert) Version des Cas9 (dCas9) fusioniert mit der katalytischen Domäne des DNA-Methyltransferase Enzym 3A (DNMT3A), Lentivirale Vektor verwendet. Dieses System gilt für Zellen mit der Verdreifachung der SNCA -Locus und reduziert die SNCA-mRNA und Protein-Spiegel um ca. 30 % durch die gezielte DNA-Methylierung der SNCA Intron 1. Die fein abgestimmte Herabregulation der SNCA Ebenen rettet krankheitsbezogenen zelluläre Phänotypen. Das aktuelle Protokoll wollen wir eine schrittweise Anleitung zur Differenzierung von HiPSCs in neurale Vorläuferzellen (NPCs) und die Etablierung und Validierung von Pyrosequenzierung Assays für die Auswertung des Profils Methylierung in der SNCA beschreiben Intron 1. Um im Detail die Lentivirus-CRISPR/dCas9-System in diesen Experimenten verwendeten umreißen, beschreibt dieses Protokoll zu produzieren, zu reinigen und Lentivirale Vektoren zu konzentrieren und ihre Eignung für Epigenom und Genom-Bearbeitung Anwendungen mit hervorheben HiPSCs und NPCs. Das Protokoll ist leicht anpassbar und kann verwendet werden, um hohe Titer Lentiviren für in-vitro- und in-vivo Anwendungen zu produzieren.

Validierung der Produktion Titer der LV-dCas9-DNMT3A-GLP/Puro Vektoren im Vergleich zu den naiven GFP Gegenstück
Wir führten p24gag ELISA zwischen physischen Titer von LV-dCas9-DNMT3A-GLP/Puro mit den naiven GFP/Puro Kollegen zu vergleichen. Repräsentative Ergebnisse in Abbildung 5A, zeigen, dass körperliche Erträge der Vektoren, erzeugt unter Verwendung des Protokolls, d...

Gezielte DNA Epigenom Bearbeitung stellt eine leistungsstarke Therapieansatz. Dieses Protokoll beschreibt die Produktion, Reinigung und Konzentration der all-in-One Lentivirale Vektoren beherbergen das CRISPR-dCas9-DNMT3A Transgen für Epigenom-editing-Anwendungen in menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (HiPSC)-Neuronen abgeleitet.

Lentivirale Vektor-Plattform für die effiziente Bereitstellung von Epigenom-editing-Tools in menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet Krankheitsmodelle

The use of hiPSC-derived cells represents a valuable approach to study human neurodegenerative diseases. Here, we describe an optimized protocol for the ...

LentiviralE Vektorplattform haben einen großen Vorteil gegenüber der beliebtesten Vektorplattform, insbesondere wegen der Fähigkeit von lentiviralen Vektoren, größere genetische Einsätze aufzunehmen. So scheint es, dass der lentivirale Vektor die Plattform der Wahl in der Anwendung wäre, die die Lieferung von CRISPR/Cas-Tools beinhaltet. Diese Technik imitiert den natürlichen Regulierungsmechanismus der Alpha-Synuclein-Expression, die, wenn sie beeinträchtigt sind, mit Krankheiten verbunden sind.Es ermöglicht eine Feinabstimmung der Expressionsebene im Vergleich zu robusten Veränderungen in der Genexpression. Ich würde dringend empfehlen, diese oder ähnliche Ansätze mit mehreren Guide RNAs für das Screening zu validieren. Es gibt eine große Variabilität in der Rna-Potenz des Führers.Die einzige Möglichkeit, es zu bestimmen, ist ein robustes und umfassendes Screening und Validierung. Das entwickelte System kann leicht an andere Modellsysteme wie Tiermodelle wie Nagetier und nichtmenschliche Primaten angepasst werden. Diese Folgeexperimente könnten als Beweis für zukünftige klinische Studien dienen.Demonstriert wird das Verfahren von Dr.Ekaterina Ilich, einer leitenden Mitarbeiterin

lentiviral-vector-platform-for-efficient-delivery-epigenome-editing

Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Quelle: Tagliafierro, L., et al. Lentivirale Vektorplattform für die effiziente Bereitstellung von Epigenom-Editing-Werkzeugen in humane induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Krankheitsmodelle. J. Vis. Exp. (2019)Dieses Video zeigt die lentivirale Transduktion von neuralen Vorläuferzellen (NPCs) zur gezielten epigenetischen Modifikation von alpha-Synuclein, einem Schlüsselprotein bei der Parkinson-Krankheit. Das Protokoll ermöglicht eine Methyltransferase-vermittelte DNA-Methylierung,...

Lentivirale Transduktion von neuralen Vorläuferzellen zur epigenetischen Regulation der Alpha-Synuclein-Expression

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Erzeugung von menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen aus dem peripheren Blut mit Hilfe eines Episoms basierend Neuprogrammierung Strategie und Histon-Deacetylase-Inhibitoren.

Effiziente iPS Zellgeneration aus Blut Mit Episomen und HDAC-Inhibitoren

TALEN-vermittelte Geneditierung am Safe-Harbor-AAVS1-Locus ermöglicht eine hocheffiziente Transgen-Addition in humanen iPSCs. Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren zur Vorbereitung von iPSCs für die TALEN- und Donorvektorverabreichung, zur Transfektion von iPSCs und zur Auswahl und Isolierung von iPSC-Klonen, um eine gezielte Integration eines GFP-Gens zur Erzeugung von Reporterlinien zu erreichen.

Transfektion, Selektion und Colony-Picking für Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen mit einem GFP-Gen in die AAVS1 Safe Harbor TALEN ziel

Pluripotenten Stammzellen (iPS) Quelle eines patientenspezifischen Geweben für die klinische Anwendung und Grundlagenforschung. Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll für die menschliche periphere mononukleäre Blutzellen (PBMNC) von gefrorenen Buffy Coats in virale freien iPSCs mit nicht-integrierenden episomalen Plasmiden erhalten neu zu programmieren.

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus Gefrorene Buffy Coats mit Non-Integration episomalen Plasmiden

Genom-Editierung von humanen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) kann schnell und effizient durchgeführt werden. Hier wird ein robustes experimentelles Verfahren zur genetischen Veränderung von hPSCs vorgestellt, wie es am Beispiel der Editierung des AAVS1-Safe-Harbor-Locus zur Expression von EGFP und zur Einführung von Antibiotikaresistenzen veranschaulicht wird.

Einrichtung von Genom bearbeitet humanen pluripotenten Stammzelllinien: Von Targeting zur Isolation

Dieses Protokoll beschreibt eine detaillierte Methode zur effizienten Erzeugung integrationsfreier iPSCs aus menschlichen adulten peripheren Blutzellen. Durch die Verwendung von vier oriP/EBNA-basierten episomalen Vektoren zur Expression der Reprogrammierungsfaktoren KLF4, MYC, BCL-XL oder OCT4 und SOX2 können Tausende von iPS-Kolonien aus 1 ml peripherem Blut gewonnen werden.

Die Erzeugung von Integration freien induzierte pluripotente Stammzellen aus menschlichen peripheren einkernigen Blutzellen Mit Episomale Vektoren

Wir beschreiben die Produktionsstrategie der Integrase-defizienten Lentivirale Vektoren (IDLVs) als Vehikel für Zellen CRISPR/Cas9 bereitzustellen. Mit der Fähigkeit, schnell und robust Gene in Zellen bearbeiten zu vermitteln IDLVs präsentieren ein sicherer und ebenso wirksame Vektor Plattform für gen-Lieferung im Vergleich zu Integrase-kompetente Vektoren.

Ein Protokoll für die Produktion der Integrase-defizienten Lentivirale Vektoren für CRISPR/Cas9-vermittelte Gen Knockout in teilenden Zellen

Beschrieben werden Protokolle für die hocheffiziente Genombearbeitung von murinen hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPC) durch das CRISPR/Cas9-System zur schnellen Entwicklung von Mausmodellsystemen mit hämatopoetischen systemspezifischen Genmodifikationen.

Lentiviral CRISPR/Cas9-Vermittelte Genombearbeitung zur Untersuchung hämatopoetischer Zellen in Krankheitsmodellen

Hier beschreiben wir eine detaillierte Methode zur nahtlosen Genbearbeitung in humanen pluripotenten Stammzellen unter Verwendung eines piggyBac-basierten Donorplasmids und der Cas9-Nickase-Mutante. Zwei Punktmutationen wurden in Exon 8 des Hepatozyten-Kernfaktor-4-alpha-Locus (HNF4α) in humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) eingeführt.

Einführung von Punktmutationen in humane pluripotente Stammzellen durch nahtlose Genom-Editierung

Unter Verwendung des kostengünstigen kationischen Polymers Polyethylenimin (PEI) produzierten wir lentivirale Partikel für die stabile Expression von shRNAs in H9-humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) und transienten H9-abgeleiteten neuralen Vorläuferzellen (NPCs) mit hoher Effizienz.

Lentiviral vermittelte Abgabe von shRNAs an hESCs und NPCs unter Verwendung des kostengünstigen kationischen Polymers Polyethylenimin (PEI)

Die vorgestellte Methode beschreibt die Erzeugung eines CRISPR-vermittelten Gen-Knockouts in der humanen embryonalen Stammzelllinie (hESC) H9, die sgRNAs, die auf das L2HGDH-Gen abzielen, unter Verwendung eines hocheffizienten lentiviralen Gentransfersystems stabil exprimiert.

CRISPR-Cas9-vermittelte Gendeletion in humanen pluripotenten Stammzellen, die unter feederfreien Bedingungen kultiviert wurden

Lernen Sie die Produktion und Anwendung von lentiviralen Vektoren für Epigenom-Editing mit CRISPR-dCas9-DNMT3A in hiPSC-abgeleiteten Neuronen. Diese Methode ermöglicht präzise Genexpressionsregulierung für neurologische Forschung.

Lentivirale Vektor-Plattform für die effiziente Bereitstellung von Epigenom-editing-Tools in menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet Krankheitsmodelle (Video) | JoVE Journal

Lentivirale Vektor-Plattform für die effiziente Bereitstellung von Epigenom-editing-Tools in menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet Krankheitsmodelle

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